モデルシアノバクテリア種のマークとマーカーレス変異体の生成

この手順の全体的な目標は、シアノバクテリアのシネコシスティス種PCC6803のマークされていない変異体と、シネココッカス種PCC7002のマーク付き変異体を生成するシステムを実証することです。この方法は、シアノバクテリア遺伝学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、染色体の変化を菌株に導入する方法などです。

抗生物質耐性遺伝子を挿入し、続いてネガティブ選択マーカーを使用してこのカセットを除去します。この技術の主な利点は、株を繰り返し遺伝子操作できることです。必要なだけ多くの交代を株に導入することができます。

培地を調製した後、シアノバクテリア株およびプラスミドを、テキストプロトコルに従って調製します。シアノバクテリア細胞でいっぱいのループを30〜50ミリリットルのBG11培地に接種することにより、新鮮な培養をセットアップします。30°Cの光の下で2〜3日間培養し、OD7500(0.2〜0.6)にします。

インキュベーション後、1〜2ミリリットルの培養物を2,300gで5分間遠心分離します。次に、上清を捨てた後、BG11培地を使用してペレットを一度洗浄し、静かにピペッティングして細胞を再懸濁します。ボルテックスにより、DNAの取り込みに不可欠な線毛が失われる可能性があります。

細胞を再度ペレット化し、上清を除去した後、BG11培地を最終容量100マイクロリットルまで追加し、細胞を14ミリリットルの丸底チューブに移します。次に、以前に調製したプラスミドAの1マイクログラムを細胞に加えます。そして、軽くたたいて混ぜます。

次に、チューブをインキュベーターに30°Cで水平に置き、4〜6時間インキュベートします。インキュベーション後、細胞培養プラスミドDNA混合物のアリコートを抗生物質を含まないBG11寒天プレートに広げます。そして摂氏30度でインキュベートします。

約24時間後、カナマイシンを含む水に0.6%寒天溶液を調製します。.そして、摂氏42度まで冷まします。次に、培養プレートの端に2.5〜3ミリリットルを加え、プレートを傾けて、溶液が表面に均一な上部寒天層を形成するようにします。

プレートを約7日間インキュベートして、コロニーが見えるようにします。次に、新しいBG11寒天とカナマイシンプレートを6つのセクターに分割します。そして、鈍い端のつまようじを使用して、個々のコロニーを縞模様にします。

PCRを行うには、マークされたノックアウトを確認するために、50マイクロリットルの水と約20個の425〜600マイクロメートルのガラスビーズが入ったチューブに少量の細胞を移します。細胞とビーズを約2, 000 rpmで5分間振とうした後、15, 700 gで5分間回転します。次に、5マイクロリットルの上清を使用して、タックDNA予備試薬を使用して50マイクロリットルのPCR反応を調製します。

変異体を検証するために、テキストプロトコルに従ってプライマーを設計した後、以下のプログラムを用いて産物を増幅し、野生型コントロールを含めた。gelelektroforeseesを通じて、ノックアウト形質転換体の遺伝子型を確認します。約4キロベースペアのバンドを示し、野生型バンドを欠いています。

詳細については、テキストプロトコルを参照してください。野生型バンドがまだ存在する場合は、新しいプレートでひずみを再度ストリークし、PCRを繰り返します。変異体が分離され、PCR反応で野生型バンドが観察されなくなるまで、バリデーションプロセスを繰り返します。

マークされた変異体プロファイルを示す株の場合は、マークされていないノックアウトの生成に使用するために、新しいプレートで再度ストリークします。標識のないSynechocystis変異体を生成するには、細胞でいっぱいのループをBG11培地の30〜50ミリリットルに接種することにより、標識されたノックアウトの新鮮な培養を設定します。OD750に2〜3日間培養物を育て、0.2〜0.6に等しくします。

10ミリリットルの培養物を2, 300gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。次に、BG11培地で細胞をやさしく洗います。BG11を最終容量の200マイクロリットルに添加し、細胞を14ミリリットルの丸底チューブに移した後、プラスミドB DNAを1マイクログラムの細胞に加え、軽くたたいて混合します。

次に、チューブをインキュベーターに水平に置き、4〜6時間インキュベートします。インキュベーション後、1.8ミリリットルのBG11培地を加え、サンプルを振とうしながら合計4日間インキュベートします。これは、複数の染色体コピーで組換えが発生するのに十分な時間です。

形質転換した培養物のプレート50、10、および1マイクロリットルのアリコートをBG11と5%ショ糖寒天プレートに添加し、約7日間インキュベートして単一コロニーを生成します。次に、鈍い端のつまようじを使用して、BG11とカナマイシンプレートに30〜50の個々のコロニーを孵化します。次に、BG11に5%のスクロースを加えてパッチします。

BG11とスクロースで増殖するコロニーは、カナマイシンを含むプレートでは増殖しないコロニーは、無印のノックアウトとなる可能性があります。両方のプレートで成長するコロニーは、sacB遺伝子の突然変異により、ショ糖抵抗性である可能性が高いです。このビデオで前述したPCR法に従って、野生型サイズから削除された領域を引いたゲルバンドを生成する、マークされていないノックアウトを確認します。

株がマークされていない変異プロファイルを示している場合は、抗生物質を使用せずに新鮮なBG11寒天培地で再度スリークします。菌株を長期間保存するには、細胞でいっぱいのループをBG11培地の30〜50ミリリットルに接種することにより、菌株の新鮮な培養を設定します。3〜4日間培養し、OD750を0.4〜0.7に等しくします。

BG11を使用して細胞を一度洗浄した後、ペレットを約2ミリリットルのBG11に再懸濁します。濃縮された細胞の0.8ミリリットルを1本のチューブに加えます。次に、0.2ミリリットルの80%フィルター滅菌グリセロールを追加します。

別のチューブに、0.93ミリリットルの濃縮細胞と0.07ミリリットルのDMSOを追加します。両方のチューブをマイナス80°Cで保管してください。菌株を復活させるには、チューブを取り外し、鈍い端のつまようじを使用して、抗生物質を含まない寒天プレートに一部の細胞をこすり落とします。

次に、滅菌ループを使用して、通常どおりストリークアウトします。この図は、欠失変異体の生成に用いたプラスミドAとBの例を示しています。いずれの場合も、5つのプライムプランキング領域と3つのプライムプランキング領域は、約900〜1, 000塩基対です。

プラスミドBは、5プライムと3プライムとの間に約1キロベース対の隣接領域との間に遺伝子カセットを含有することもできる。または、ネイティブ遺伝子配列の改変バージョン。プラスミドAで形質転換すると、7〜10日後に数百のコロニーがプレート上に現れます。

遺伝子が必須ではなく、変異体が野生型株と同様に成長を示す場合、すべての染色体には、PCRによって決定されたコピーnpt1/sacB挿入配列が含まれている必要があります。遺伝子が必須ではなく、変異体の成長が遅い場合、分離されたマーク付き変異体を得るためには、カナマイシンの濃度を増やしながら数回の再ストリーキングが必要です。再ストリーキング時にマークされた変異体が得られない場合、その遺伝子は生存に必須である可能性が高いです。

プラスミドBによる形質転換から得られる個々のコロニーの大部分は、カナマイシン感受性およびスクロース抵抗性を示します。ここで示したように、これらのコロニーにおける標的領域のPCR増幅は、マークされていない変異体プロファイルのほぼ100%を示している。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば、6週間にわたって数時間で行うことができます。

この手順を試みるときは、滅菌技術を使用することを忘れないでください。この手順に続いて、光合成速度や代謝物生産の測定などの追加の質問に答えるために、酸素産生の測定やガスクロマトグラフィー質量分析などの他の方法を実行できます。その開発後、この技術はシアノバクテリア遺伝学の分野の研究者への道を開きました。

この門の主要な生化学的および生理学的プロセス、および産業目的の発達系統を調査すること。このビデオを見れば、Synechococcus種PCC6803でマークされていないノックアウトを生成する方法について十分に理解できるはずです。