Name: モデルシアノバクテリア種のマークとマーカーレス変異体の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: 学ぶシアノバクテリアSynechocystis sp. PCC6803とSynechococcus sp. PCC7002におけるマーカー付き・マーカーレス変異体の作製法。抗生物質耐性遺伝子挿入と負の選択マーカーを用いた遺伝子操作により、反復的な染色体改変が可能となる。

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<ol><li>Zwirglmaier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+phylogeography+of+marine+Synechococcus+and+Prochlorococcus+reveals+a+distinct+partitioning+of+lineages+among+oceanic+biomes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Global phylogeography of marine Synechococcus and Prochlorococcus reveals a distinct partitioning of lineages among oceanic biomes.</a> Environ Microbiol. 10, 147-161 (2008).</li>
<li>Galloway, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+cycles%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Nitrogen cycles: past, present, and future.</a> Biogeochemistry. 70, 153-226 (2004).</li>
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<li>Lea-Smith, D. J., Bombelli, P., Vasudevan, R., Howe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic%2C+respiratory+and+extracellular+electron+transport+pathways+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic, respiratory and extracellular electron transport pathways in cyanobacteria.</a> Biochim Biophys Acta. , (2015).</li>
<li>McCormick, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+production+through+oxygenic+photosynthesis+using+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC+6803+in+a+bio-photoelectrolysis+cell+%28BPE%29+system%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Environ.+Sci%22%5BJournal%5D)">Hydrogen production through oxygenic photosynthesis using the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 in a bio-photoelectrolysis cell (BPE) system.</a> Energy Environ. Sci. 6, 2682-2690 (2013).</li>
<li>Bradley, R. W., Bombelli, P., Lea-Smith, D. J., Howe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+oxidase+mutants+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+show+increased+electrogenic+activity+in+biological+photo-voltaic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Terminal oxidase mutants of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 show increased electrogenic activity in biological photo-voltaic systems.</a> Phys Chem Chem Phys. 15, 13611-13618 (2013).</li>
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<li>Tan, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+natural+products+from+marine+cyanobacteria+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Bioactive natural products from marine cyanobacteria for drug discovery.</a> Phytochemistry. 68, 954-979 (2007).</li>
<li>Volk, R. B., Furkert, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antialgal%2C+antibacterial+and+antifungal+activity+of+two+metabolites+produced+and+excreted+by+cyanobacteria+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Antialgal, antibacterial and antifungal activity of two metabolites produced and excreted by cyanobacteria during growth.</a> Microbiol Res. 161, 180-186 (2006).</li>
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<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phycobilisome-deficient+strains+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803+have+reduced+size+and+require+carbon-limiting+conditions+to+exhibit+enhanced+productivity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phycobilisome-deficient strains of Synechocystis sp. PCC 6803 have reduced size and require carbon-limiting conditions to exhibit enhanced productivity.</a> Plant Physiol. 165, 705-714 (2014).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thylakoid+terminal+oxidases+are+essential+for+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+to+survive+rapidly+changing+light+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Thylakoid terminal oxidases are essential for the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 to survive rapidly changing light intensities.</a> Plant Physiol. 162, 484-495 (2013).</li>
<li>Liu, X., Sheng, J., Curtiss, R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+production+in+genetically+modified+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6899-6904 (2011).</li>
<li>Xu, H., Vavilin, D., Funk, C., Vermaas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+deletions+of+small+cab-like+proteins+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC+6803+-+Consequences+for+pigment+biosynthesis+and+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple deletions of small cab-like proteins in the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 - Consequences for pigment biosynthesis and accumulation.</a> J Biol Chem. 279, 27971-27979 (2004).</li>
<li>Castenholz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+methods+for+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Culturing methods for Cyanobacteria.</a> Method Enzymol. 167, 68-93 (1988).</li>
<li>Mitschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimentally+anchored+map+of+transcriptional+start+sites+in+the+model+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An experimentally anchored map of transcriptional start sites in the model cyanobacterium Synechocystis sp PCC6803.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2124-2129 (2011).</li>
<li>Ried, J. L., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+nptI-sacB-sacR+cartridge+for+constructing+directed%2C+unmarked+mutations+in+gram-negative+bacteria+by+marker+exchange-eviction+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis.</a> Gene. 57, 239-246 (1987).</li>
<li>Vieira, J., Messing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pUC+plasmids%2C+an+M13mp7-derived+system+for+insertion+mutagenesis+and+sequencing+with+synthetic+universal+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers.</a> Gene. 19, 259-268 (1982).</li>
<li>Vermaas, W. F. J., Williams, J. G. K., Rutherford, A. W., Mathis, P., Arntzen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+Engineered+Mutant+of+the+Cyanobacterium+Synechocystis+6803+Lacks+the+Photosystem-Ii+Chlorophyll-Binding+Protein+Cp-47%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetically Engineered Mutant of the Cyanobacterium Synechocystis 6803 Lacks the Photosystem-Ii Chlorophyll-Binding Protein Cp-47.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 9474-9477 (1986).</li>
<li>Westphal, S., Heins, L., Soll, J., Vothknecht, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vipp1+deletion+mutant+of+Synechocystis%3A+A+connection+between+bacterial+phage+shock+and+thylakoid+biogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vipp1 deletion mutant of Synechocystis: A connection between bacterial phage shock and thylakoid biogenesis?</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4243-4248 (2001).</li>
<li>Zhang, S. Y., Shen, G. Z., Li, Z. K., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vipp1+Is+Essential+for+the+Biogenesis+of+Photosystem+I+but+Not+Thylakoid+Membranes+in+Synechococcus+sp+PCC+7002%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Vipp1 Is Essential for the Biogenesis of Photosystem I but Not Thylakoid Membranes in Synechococcus sp PCC 7002.</a> J Biol Chem. 289, 15904-15914 (2014).</li>
<li>Taroncher-Oldenberg, G., Nishina, K., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+the+polyhydroxyalkanoate-specific+beta-ketothiolase+and+acetoacetyl+coenzyme+A+reductase+genes+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+strain+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of the polyhydroxyalkanoate-specific beta-ketothiolase and acetoacetyl coenzyme A reductase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp strain PCC6803.</a> Appl Environ Microbiol. 66, 4440-4448 (2000).</li>
<li>Hein, S., Tran, H., Steinbuchel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synechocystis+sp.+PCC6803+possesses+a+two-component+polyhydroxyalkanoic+acid+synthase+similar+to+that+of+anoxygenic+purple+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synechocystis sp. PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria.</a> Arch Microbiol. 170, 162-170 (1998).</li>
<li>Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+of+photoautotrophic+protein+production+by+combining+promoters+and+neutral+sites+in+Synechocystis+6803%2C+a+cyanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium.</a> Appl Environ Microbiol. , (2015).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

マークされていない変異体の世代の中で最も重要な手順は次のとおりです。1）慎重なプラスミドのデザインのみ標的領域が改変されていることを確認します。 2）特に、培養された場合、スクロース上のサンプルは、無菌のままであることを保証します。 3）24時間後に寒天を加えた抗生物質を添加した抗生物質を欠くBG11寒天プレート上に最初にマークされた変異体の生成のためのめっき形質転換細胞。 4）培養は、BG11プラスショ糖寒天プレート上にプレーティングする前に4日間フルのための突然変異体をマークし：5）マークされた変異体が完全に分離されていることを保証し、6）徹底的に変異株の遺伝子型を確認しました。この最後のステップのために、削除された領域の一部を増幅するために設計された追加のプライマーは、それが削除されたことを確認するために使用することができます。サザンブロット法は、面倒ながら、使用することもできます。しかし、私たちの経験では、このホワイトペーパーで説明した手順は、変異体の適切な検証のために十分であるということです。この手順はまたSynechococの著しい変異体を生成するために使用されていますelongatus PCC7942 C...

シアノバクテリアは、地球上のほぼすべての自然環境の中で見つかった細菌の進化的に古代と多様な門です。海洋生態系において、それらは特に豊富であり、炭素固定1の約半分を、海洋における窒素固定2と炭化水素生産3のトン数百万の大半は毎年を占め、多くの栄養素のサイクルで重要な役割を果たしています。葉緑体は、真核藻類や植物の光合成を担う細胞小器官は、宿主生物4に包まれたシアノバクテリアから進化した可能性があります。シアノバクテリアは、その多くが植物に保存されている、光合成、電子輸送5および生化学的経路の研究のための有用なモデル生物を証明しています。付加シアノバクテリアにおいてますます食品、バイオ6、電気7及びそれらのハイによる産業用化合物8の製造に使用されています太陽エネルギー9を用いて、バイオマスへの水とCO 2のghly効率的に変換します。多くの種はシアノバクテリアが潜在的に農業生産に影響を与えることなく、大規模に成長させることができたことを示唆し、最小限の栄養素と海水と非耕地で栽培することができます。特定の種も抗真菌、抗菌性及び抗癌化合物10,11を含む天然物の源です。 変異体を生成する能力は、シアノバクテリアの光合成、生化学および生理学、および産業用菌株の開発に不可欠なを理解するための鍵です。公表された研究の大部分は、目的の部位に抗生物質耐性カセットの挿入によって遺伝的に改変された株を生成します。これは、いくつかの抗生物質耐性カセットは、シアノバクテリアにおける使用のために利用可能であるように、株に導入され得る変異の数を制限します。抗生物質の再付与する遺伝子を含む株sistanceは、バイオ燃料および他の低価値製品12を製造するための唯一の費用効果的な手段である可能性が高い開放池の工業生産のために使用することができません。マークされていない変異体の生成は、これらの制限を克服します。マークされていない変異体は、意図的に含まれない限り、外来DNAを含有しない、複数回操作することができます。したがって、所望のように株のように多くの変更を生成することができます。また、修飾部位の下流の遺伝子上の極性効果は、生体13のより正確な修正を可能にする、最小限にすることができます。 変異株、削除対象の遺伝子に隣接するシアノバクテリアの染色体における領域と同一の2つのDNA断片を含有する自殺プラスミド（隣接領域の5 &#39;および3&#39;と呼ばれる）を生成するために最初に構成されています。二つの遺伝子は、これらの隣接領域間に挿入されます。これらの一つは、抗生物質耐性タンパク質をコードします。第二は、SacBを、PRODを符号化レバンスクラーゼuces、化合物は、スクロースに対する感受性を付与します。プロセスの最初の段階では、マークされた変異体は、いくつかの外来DNAを含む、すなわち株は、生成されます。プラスミド構築物は、シアノバクテリア細胞と混合し、DNAは、生物によって天然に取り込まれます。形質転換体は、適切な抗生物質およびPCRにより確認変異体の遺伝子型を含有する寒天プレート上での増殖によって選択されます。自殺プラスミドは、目的の菌株内で複製することはできません。したがって、任意の抗生物質耐性コロニーは、目的の遺伝子が染色体に挿入することにより組換え事象から生じます。マークされていない変異体を生成するために、マークされた変異体は、その後、ちょうど5 &#39;および3&#39;フランキング領域を含む第二の自殺プラスミドと混合されます。外来DNAの挿入が必要な場合は、これらのDNA断片の間に挿入された目的の遺伝子を含有するカセットを有する領域に隣接する5 &#39;および3&#39;からなるプラスミドを用いることができます。セレctionは、ショ糖を含有する寒天プレート上での成長によるものです。 sacB遺伝子産物が発現されたときに、スクロースを細胞に致死的であるように、生存細胞のみがショ糖感受性遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子に加えて、外に再結合されていることにより第2の組換え事象が発生したものであり、染色体とプラスミド上に。組換え交換の結果として、隣接する領域と、それらの間のいずれかのDNAが染色体に挿入されています。 我々は成功しシネコシスティスの同じ系統で複数の染色体の変異を生成するために、これらのメソッドを使用しています。 （以下、 シネコシスティスという）PCC6803 13,14は 、関心対象13の遺伝子に、遺伝子カセットの発現のための単一点突然変異を導入します。マークされていないノックアウトの生成はシネコシスティス 15,16、詳細な方法で私たちの仕事の前に実証されてきたが、によって支援重要なステップのビジュアルプレゼンテーションは、公開されていません。また、別のモデルのラン藻、 シネココッカス属にマークされたノックアウトを生成するために同じ方法を適用しました。 PCC7002（以下、 シネココッカスと呼ばれます）。このプロトコルは、変異体およびこれらの株を検証し、保存するための迅速なプロトコルを生成するための明確な、簡単な方法を提供します。

<table><tbody><tr><td>NaNO3</td><td>Σ</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Σ</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Σ</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>ΣC0759</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>フィッシャー</td><td>EDT002</td><td></td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Σ</td><td>339067</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2.4H2O</td><td>Σ</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O</td><td>Σ</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4.2H2O</td><td>Σ</td><td>331058</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td>Σ</td><td>209198 Co</td><td></td></tr><tr><td>(NO3)2.6H2O</td><td>Σ</td><td>239267</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸鉄アンモニウム</td><td>Σ</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Fisher</td><td>SODC001</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>SODH001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>シアノコバラミン</td><td></td><td>Σ47869</td><td></td></tr><tr><td>Na2S2O3</td><td>Sigma</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>フィッシャー</td><td>SUC001</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 90 mm トリプルベント</td><td>Greiner</td><td>633185</td><td></td></tr><tr><td>0.2 & マイクロ;m フィルター</td><td>ザルトリウス</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>100 ml 円錐フラスコ</td><td>パイレックス</td><td>CON004</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム M 100 mm x 38&nbsp;m</td><td>Bemis</td><td>FIL003</td><td></td></tr><tr><td>Phusion high fidelity DNA polymerase&nbsp;</td><td>Phusion</td><td>F-530</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>メルフォード</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>DNA精製キット&nbsp;</td><td>MoBio</td><td>12100-300</td><td></td></tr><tr><td>制限エンドヌクレアーゼ</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 リガーゼ</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani ブロス</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン硫酸塩</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>ΣA9518</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GeneJETプラスミドミニプレップキット</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>14 ml 丸底チューブ</td><td>BD falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA ポリメラーゼ</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>425-600 &micro;mガラスビーズ</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>蛍光灯</td><td>Gro-Lux</td><td>69</td><td></td></tr><tr><td>HT マルチトロン フォトバイオリアクター</td><td>インフォ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

モデルシアノバクテリア種のマークとマーカーレス変異体の生成

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

シアノバクテリアは生態学的に重要な生物であり、バイオ燃料や有用な工業製品の生産のための潜在的なプラットフォームです。シアノバクテリア、特にSynechocystis sp. PCC6803やSynechococcus sp. PCC7002などのモデル生物の遺伝子操作は、基礎研究と応用研究の両方にとって重要なツールです。非標識変異体の生成、すなわち、抗生物質耐性カセット(1つ以上の遺伝子を含むDNAの操作可能な断片)の挿入によって染色体の変化を株に導入され、続いてネガティブ選択マーカーを用いてこのカセットを除去することは、特に強力な技術である。マークされていない変異体は、遺伝子操作を繰り返し行うことができ、必要なだけ多くの改変を系統に導入することができます。さらに、変異株に抗生物質耐性タンパク質をコードする遺伝子が存在しないことは、抗生物質耐性生物の環境中への「逃亡」の可能性を回避するため、望ましい。しかし、シアノバクテリアの遺伝子操作を繰り返すための詳細な方法は、科学文献には十分に記載されていません。ここでは、この技術の包括的な説明を提供します。これは、複数の欠失、目的の遺伝子内の一点変異、および新規遺伝子カセットの挿入を伴う突然変異の生成に成功しました。

プラスミドのデザインは、両方のマークされ、マークされていない変異体の生成に成功するために重要である。 図1は 、プラスミドAの例を示し、Bはシネコシスティス遺伝子 cpcC1とcpcC2 13に欠失変異体を生成するために使用されます。それぞれの場合において、5 &#39;及び3&#39;フランキング領域は約900〜1000塩基対です。我々は成功し試用している最小の約500塩基対であったものの、減少フランキング領域を使用することができます。プラスミドBは、また、隣接領域の5 &#39;および3&#39;の約1 KB以上天然の遺伝子配列の改変されたバージョンとの間の遺伝子カセットを含むことができます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54001/54001fig2highres.jpg" width="60...

シアノバクテリアに複数のゲノム改変を導入することは、工業的および基礎的な研究目的の株の開発に不可欠なツールです。モデルシアノバクテリア種Synechocystis sp. PCC6803のマークなし変異体とSynechococcus sp. PCC7002のマーク付き変異体を生成するシステムについて説明します。

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

この手順の全体的な目標は、シアノバクテリアのシネコシスティス種PCC6803のマークされていない変異体と、シネココッカス種PCC7002のマーク付き変異体を生成するシステムを実証することです。この方法は、シアノバクテリア遺伝学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、染色体の変化を菌株に導入する方法などです。抗生物質耐性遺伝子を挿入し、続いてネガティブ選択マーカーを使用してこのカセットを除去します。この技術の主な利点は、株を繰り返し遺伝子操作できることです。必要なだけ多くの交代を株に導入することができます。培地を調製した後、シアノバクテリア株およびプラスミドを、テキストプロトコルに従って調製します。シアノバクテリア細胞でいっぱいのループを30〜50ミリリットルのBG11培地に接種することにより、新鮮な培養をセットアップします。30°Cの光の下で2〜3日間培養し、OD7500(0.2〜0.6)にします。インキュベーション後、1〜2ミリリットルの培養物を2,300gで5分間遠心分離します。次に、上清を捨てた後、BG11培地を使用してペレットを一度洗浄し、静かにピペッティングして細胞を再懸濁します。ボルテックスにより、DNAの取り込みに不可欠な線毛が失われる可能性があります。細胞を再度ペレット化し、上清を除去した後、BG11培地を最終容量100マイクロリットルまで追加し、細胞を14ミリリットルの丸底チューブに移します。次に、以前に調製したプラスミドAの1マイクログラムを細胞に加えます。そして、軽くたたいて混ぜます。次に、チューブをインキュベーターに30°Cで水平に置き、4〜6時間インキュベートします。インキュベーション後、細胞培養プラスミドDNA混合物のアリコートを抗生物質を含まないBG11寒天プレートに広げます。そして摂氏30度でインキュベートします。約24時間後、カナマイシンを含む水に0.6%寒天溶液を調製します。.そして、摂氏42度まで冷まします。次に、培養プレートの端に2.5〜3ミリリットルを加え、プレートを傾けて、溶液が表面に均一な上部寒天層を形成するようにします。プレートを約7日間インキュベートして、コロニーが見えるようにします。次に、新しいBG11寒天とカナマイシンプレートを6つのセクターに分割します。そして、鈍い端のつまようじを使用して、個々のコロニーを縞模様にします。PCRを行うには、マークされたノックアウトを確認するために、50マイクロリットルの水と約20個の425〜600マイクロメートルのガラスビーズが入ったチューブに少量の細胞を移します。細胞とビーズを約2, 000 rpmで5分間振とうした後、15, 700 gで5分間回転します。次に、5マイクロリットルの上清を使用して、タックDNA予備試薬を使用して50マイクロリットルのPCR反応を調製します。変異体を検証するために、テキストプロトコルに従ってプライマーを設計した後、以下のプログラムを用いて産物を増幅し、野生型コントロールを含めた。gelelektroforeseesを通じて、ノックアウト形質転換体の遺伝子型を確認します。約4キロベースペアのバンドを示し、野生型バンドを欠いています。詳細については、テキストプロトコルを参照してください。野生型バンドがまだ存在する場合は、新しいプレートでひずみを再度ストリークし、PCRを繰り返します。変異体が分離され、PCR反応で野生型バンドが観察されなくなるまで、バリデーションプロセスを繰り返します。マークされた変異体プロファイルを示す株の場合は、マークされていないノックアウトの生成に使用するために、新しいプレートで再度ストリークします。標識のないSynechocystis変異体を生成するには、細胞でいっぱいのループをBG11培地の30〜50ミリリットルに接種することにより、標識されたノックアウトの新鮮な培養を設定します。OD750に2〜3日間培養物を育て、0.2〜0.6に等しくします。10ミリリットルの培養物を2, 300gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。次に、BG11培地で細胞をやさしく洗います。BG11を最終容量の200マイクロリットルに添加し、細胞を14ミリリットルの丸底チューブに移した後、プラスミドB DNAを1マイクログラムの細胞に加え、軽くたたいて混合します。次に、チューブをインキュベーターに水平に置き、4〜6時間インキュベートします。インキュベーション後、1.8ミリリットルのBG11培地を加え、サンプルを振とうしながら合計4日間インキュベートします。これは、複数の染色体コピーで組換えが発生するのに十分な時間です。形質転換した培養物のプレート50、10、および1マイクロリットルのアリコートをBG11と5%ショ糖寒天プレートに添加し、約7日間インキュベートして単一コロニーを生成します。次に、鈍い端のつまようじを使用して、BG11とカナマイシンプレートに30〜50の個々のコロニーを孵化します。次に、BG11に5%のスクロースを加えてパッチします。BG11とスクロースで増殖するコロニーは、カナマイシンを含むプレートでは増殖しないコロニーは、無印のノックアウトとなる可能性があります。両方のプレートで成長するコロニーは、sacB遺伝子の突然変異により、ショ糖抵抗性である可能性が高いです。このビデオで前述したPCR法に従って、野生型サイズから削除された領域を引いたゲルバンドを生成する、マークされていないノックアウトを確認します。株がマークされていない変異プロファイルを示している場合は、抗生物質を使用せずに新鮮なBG11寒天培地で再度スリークします。菌株を長期間保存するには、細胞でいっぱいのループをBG11培地の30〜50ミリリットルに接種することにより、菌株の新鮮な培養を設定します。3〜4日間培養し、OD750を0.4〜0.7に等しくします。BG11を使用して細胞を一度洗浄した後、ペレットを約2ミリリットルのBG11に再懸濁します。濃縮された細胞の0.8ミリリットルを1本のチューブに加えます。次に、0.2ミリリットルの80%フィルター滅菌グリセロールを追加します。別のチューブに、0.93ミリリットルの濃縮細胞と0.07ミリリットルのDMSOを追加します。両方のチューブをマイナス80°Cで保管してください。菌株を復活させるには、チューブを取り外し、鈍い端のつまようじを使用して、抗生物質を含まない寒天プレートに一部の細胞をこすり落とします。次に、滅菌ループを使用して、通常どおりストリークアウトします。この図は、欠失変異体の生成に用いたプラスミドAとBの例を示しています。いずれの場合も、5つのプライムプランキング領域と3つのプライムプランキング領域は、約900〜1, 000塩基対です。プラスミドBは、5プライムと3プライムとの間に約1キロベース対の隣接領域との間に遺伝子カセットを含有することもできる。または、ネイティブ遺伝子配列の改変バージョン。プラスミドAで形質転換すると、7〜10日後に数百のコロニーがプレート上に現れます。遺伝子が必須ではなく、変異体が野生型株と同様に成長を示す場合、すべての染色体には、PCRによって決定されたコピーnpt1/sacB挿入配列が含まれている必要があります。遺伝子が必須ではなく、変異体の成長が遅い場合、分離されたマーク付き変異体を得るためには、カナマイシンの濃度を増やしながら数回の再ストリーキングが必要です。再ストリーキング時にマークされた変異体が得られない場合、その遺伝子は生存に必須である可能性が高いです。プラスミドBによる形質転換から得られる個々のコロニーの大部分は、カナマイシン感受性およびスクロース抵抗性を示します。ここで示したように、これらのコロニーにおける標的領域のPCR増幅は、マークされていない変異体プロファイルのほぼ100%を示している。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば、6週間にわたって数時間で行うことができます。この手順を試みるときは、滅菌技術を使用することを忘れないでください。この手順に続いて、光合成速度や代謝物生産の測定などの追加の質問に答えるために、酸素産生の測定やガスクロマトグラフィー質量分析などの他の方法を実行できます。その開発後、この技術はシアノバクテリア遺伝学の分野の研究者への道を開きました。この門の主要な生化学的および生理学的プロセス、および産業目的の発達系統を調査すること。このビデオを見れば、Synechococcus種PCC6803でマークされていないノックアウトを生成する方法について十分に理解できるはずです。

generation-marked-markerless-mutants-model-cyanobacterial

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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出典:Lea-Smith、DJ、et al。モデルシアノバクテリア種におけるマーク及びマーカーレス変異体の生成J. Vis.

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モデルシアノバクテリア種のマークとマーカーレス変異体の生成

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