Name: 前駆細胞が媒介する肝細胞の再生を研究するためにゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルの開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 学ぶエタノール誘発性線維症肝臓モデルの構築法。ゼブラフィッシュを用いて肝細胞再生の分子機構を探索し、化学スクリーニングで治療薬候補を同定するコスト効率の良い手法です。

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ゼブラフィッシュは上昇し、国立衛生研究所の基準を満たしており、ジョージア工科大学施設内動物管理使用委員会により承認された標準プロトコルを使用して飼育しました。 ソリューションの調製<ol><li>胚/幼虫のゼブラフィッシュを維持するために、（同義的に「胚培地」で使用される）20 Lの卵の水を準備します。蒸留水250ミリリットル中に1.5グラムのCaSO 4と6グラムインスタント海の海の塩を溶解させます。 20 Lの蒸留水で満たされたカーボイに注ぎ、かき混ぜます。 </li><li> 1 L 1-フェニル-2-チオ尿素（PTU）ストック溶液（20倍）を準備します。 1 Lの蒸留水に0.6グラムのPTU粉末を溶かします。作動液として0.003％の最終濃度は、20 mlの胚培地当たりストック溶液1mlを加えます。 注意：PTUは、吸入または皮膚暴露後の全身毒性を引き起こす可能性があります。準備し、適切な取り扱いガイドラインに従って使用しています。 </li><li> 1 Lのエチル3- aminobeを準備nzoateメタン（トリカイン）ストック溶液（20倍）。蒸留水で4グラムのトリカイン粉末を溶かします。 1 Mトリス緩衝液（pH 9）を加えることによりpHを7に調整し、蒸留水で1Lの最終容量をもたらします。 -20℃で50ミリリットルにアリコートとストア。使用前に解凍します。 注意：トリカインは、感覚の喪失を誘導することができます。準備し、適切な取り扱いガイドラインに従って使用しています。 </li><li> 100ミリリットル幼虫メトロニダゾール（MTZ）ワーキング溶液を調製します。 100 mlの胚培地中の0.1％のジメチルスルホキシド（DMSO）0.25グラムMTZ粉末を溶解することにより、新鮮な15mMのMTZ溶液を作ります。激しく振盪によって完全にMTZ粉末を溶かします。新鮮なMTZ溶液を作成し、MTZの光触媒分解を防ぐためにアルミ箔を使用しています。 注意：MTZが、炎症を引き起こす場合があります。準備し、適切な取り扱いガイドラインに従って使用しています。 </li><li> 100ミリリットル幼虫のエタノール/メトロニダゾール（エタノール/ MTZ）ワーキング溶液を調製します。新鮮なMTZ溶液を作製し、光触媒ドを防ぐためにアルミ箔を使用MTZのグラデーション。使用直前に1.5％の最終濃度まで100ミリリットルMTZ溶液に1.5ミリリットルの100％エタノールを追加します。 </li><li> 500ミリリットル大人MTZ作業溶液を準備します。 500ミリリットルシステムの水に0.1％のDMSO中に0.83グラムのMTZ粉末を溶解することにより、新鮮な10mMのMTZソリューションを作成します。激しく振盪によって完全にMTZ粉末を溶かします。新鮮なMTZ溶液を作成し、MTZの光触媒分解を防ぐためにアルミ箔を使用しています。 </li><li> 1 L PEMバッファを準備します。 30.2グラムのPIPES、0.74グラムのEGTA、および0.12グラムの蒸留水に硫酸マグネシウムを溶解させます。 NaOHでpHを7に調整します。蒸留水で1リットルに最終容量を持参。 </li></ol>幼虫のゼブラフィッシュの調製<ol><li> [Tgは（fabp10a：CFP-NTR）のセットアップ交配GT1。 Tgは（Tp1の：mCherryを）JH11] のTg（hand2：EGFP）で15,17大人のゼブラフィッシュは、交配タンク内の13の大人のゼブラフィッシュをPD24。時限交配を行うために仕切りを使用します。 </li><li> Dを削除します翌朝ividerと魚が中断することなく交尾することを可能にします。 2時間後、システムの水に負担し、胚培地で100ミリメートルペトリ皿に胚を転送することにより収穫胚。 </li><li>ペトリ皿当たりのない100以上の胚を保管してください。実体顕微鏡下では、ガラスピペットを用いて、未受精卵を削除します。 28℃で胚を成長し、顔料の開発を阻害するために10時間ポスト受精（HPF）の後に0.003％の最終濃度にフェニルチオ尿素（PTU）を追加します。 </li></ol>幼虫ゼブラフィッシュ3.エタノール、メトロニダゾール治療と肝再生<ol><li> 1.5％の最終濃度まで胚培地にエタノールを添加することにより、新鮮なエタノール溶液を調製します。 PTUを追加しないでください。 </li><li> 56〜80 HPFからペトリ皿当たり20ミリリットルのエタノール溶液で胚を扱います。エタノールの蒸発を防ぐためにラップでペトリ皿をカバーしています。 </li><li>ソートアウト[Tgは（fabp10a：CFP-NTR）GT1。 Tgは（Tp1の：mCherryを）JH11 </SUP&gt;; Tgは（hand2：EGFP）同様の肝臓サイズとPD24]幼虫、80 HPFで、CFP式によって決定されます。エタノールで処理した幼虫をソートするとき、これは、その後のエタノール/ MTZ処理と高い死亡率の原因となりますので、トリカインを使用しないでください。ペトリ皿当たり30の胚の密度でソートされた幼虫を保管してください。 </li><li> 0.1％DMSO中の胚培地中で新鮮な15mMのMTZを準備します。 1.5％の最終濃度にするMTZ溶液にエタノールを適量加えます。 28℃で24時間、ペトリ皿当たり20ミリリットルのEtOH / MTZ溶液中の幼虫をインキュベートします。光から保護するために、エタノール濃度とアルミホイルでを維持するために、プラスチック製のラップでカバーペトリ皿。 </li><li>治療の終わりに、新鮮胚培地で新しいペトリ皿に幼虫を転送することによってエタノール/ MTZ溶液を除去。胚培地で幼虫を3回洗浄し、PTUなし20ミリリットル胚培地に保管してください。 </li><li>肝細胞のほぼ完全な切除で幼虫を整理するには、蛍光を観察します80Xの倍率でCFPフィルターと落射蛍光顕微鏡下で。肝臓での最小限のCFPの蛍光と大幅に減少肝体積で成功したアブレーション結果。 </li><li>エタノール/ MTZ-処理した幼虫の死を回避するために、ソートにトリカインを使用しないでください。免疫染色のための幼虫を修正しました（セクション5を参照）、またはさらなる分析のために28℃でペトリ皿に並べ替えられた幼虫を保ちます。 </li></ol>エタノール/ MTZ-処理した幼虫のゼブラフィッシュ4.化学画面<ol><li> DMSO中の10mMに化学銘柄を含む96ウェルプレートを持参℃の冷凍庫から-80（商業化学物質ライブラリーに関する詳細については、物質一覧を参照してください）​​。化学物質の光触媒分解を防ぐためにアルミホイルで覆います。緩やかに揺り動かしながら室温でストック溶液を解凍します。 </li><li>初期秒：96ウェルプレートで、50μMの最終濃度（に胚培地と10mMストック溶液を希釈して薬液を準備creen;再テスト）：1.5ミリリットルチューブインチ対照幼虫を胚培地中のDMSOの同じ濃度で処理しました。 </li><li> 1.5％のEtOH / 15mMのMTZで処理し、96ウェル（初期画面）またはの密度で胚培地を予め充填し、24ウェル（再検査）プレートのどちらかに、前述のように分類したほぼ完全な肝切除と転送幼虫ウェルあたり5幼虫。各化学物質のための二連のウェルを使用してください。 </li><li>胚培地を削除し、各ウェルに250μlの（96ウェルプレート）または500μlの（24ウェルプレート）化学溶液のいずれかを追加します。アルミホイルでカバープレートとは、28℃で50時間、幼虫を扱います。毎日化学浸漬幼虫を点検し、個々のウェルからの任意の死んだ幼虫を削除します。 </li><li>化学的処理の終わりには、80Xの倍率でCFPフィルターと落射蛍光顕微鏡下でCFPを発現する肝細胞の数および/または強度を観察します。写真ライブ幼虫を増強または低下させる示しますD番号および/またはレコードのデジタルカメラでCFPを発現する肝細胞の強度。 </li><li>セクション5で説明したように、共焦点イメージングのためのホルムアルデヒド固定によって幼虫を保持します。 </li><li>初期画面での肝細胞の再生を促進する化学物質を再テストするには、4.1から4.5（「再試験」）に記載されている手順と最も効果的な濃度を見つけるために、より高い及びより低い濃度でその効力を調べます。 </li></ol> 5.幼虫ゼブラフィッシュ固定、免疫染色、および共焦点イメージング<ol><li> 0.02％の最終濃度までトリカインを追加することによって幼虫を麻酔。 1.5mlチューブに10~15幼虫を移し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1回洗浄します。 PBSを削除し、4℃でO / Nを固定するために、PEM緩衝液中に新たに調製した2％のホルムアルデヒドの1ミリリットルを追加します。 注意：ホルムアルデヒドは炎症を引き起こし、ヒトの発癌物質であることが知られています。化学ドラフト内で取り扱います。 </li><li> WA正しく、次いで溶液を固定捨てます室温でPBSでshが3回。固定された幼虫は、数日間まで4℃でPBS中に維持することができます。次のステップに進むには、速やかに優れた免疫染色の結果が得られます。 </li><li>慎重に実体顕微鏡下で＃55ピンセットを用いて肝臓領域をカバー卵黄と皮膚を取り除きます。 </li><li> 4℃で透過処理し、ブロックバッファ内のブロックの幼虫（4％のウシ血清アルブミン、PBS中の0.3％トリトンX-100）O / N。 </li><li> 1の希釈でウサギ抗コラーゲンI抗体とインキュベート：ブロック・バッファ・O / Nで100 4℃。洗浄緩衝液（PBS中0.3％トリトンX-100）で15分間ずつ5回洗浄します。 </li><li> 1の希釈でのAlexaFluor 647結合ロバ抗ウサギ抗体でインキュベートする：ブロックバッファO / Nで200 4℃。洗浄バッファーで15分間ずつ5回洗浄します。その後、PBSで1回洗浄。 </li><li>静かに左側面を上に向けてガラスピペット、および配向固定幼虫を用いてガラススライドに幼虫を移します。キムワイプを使用して過剰のPBSを削除してください。取り付けメディアのドロップを追加します。マニキュアと、シールカバーガラス。すぐに共焦点イメージングを行うことは大いに推奨されます。 </li><li>画像をキャプチャするために40X / 1.3オイルレンズを搭載した共焦点システムを使用してください。百分の20から50にレーザー強度を使用してください。 1ミクロン間隔でZスタック画像をキャプチャします。 </li></ol>アダルトゼブラフィッシュの6準備<ol><li> [Tgは（fabp10a：CFP-NTR）のセットアップ交配GT1。 Tgは：交配タンク内（Tp1とmCherryを）JH11] 15,17大人のゼブラフィッシュ。収穫は、システムの水に負担し、胚培地で100ミリメートルペトリ皿に胚を転送することにより、翌朝胚。 </li><li>ペトリ皿当たりのない100以上の胚を保管してください。実体顕微鏡下では、ガラスピペットを用いて、未受精卵を削除します。 28℃で胚を成長し、顔料の開発を阻害するために10 HPF後の0.003％の最終濃度にPTUを加えます。 </li><li> 4 DPFでは、幼虫を麻酔し、整理してトリカインを使用して、[Tgは（fabp10a：CFP-NTR）GT1; Tgは（Tp1の：mCherryを）JH11]幼虫。新鮮胚培地を数回に変更することにより、トリカインを洗浄します。彼らは分18あたり120〜180拍の正常な心拍数を達成するまで、幼虫は28℃で回復させます。 </li><li>標準的な手順19に基づいて、6-12ヶ月齢にソートされた幼虫を上げます。 </li></ol>アダルトゼブラフィッシュ7.エタノール、メトロニダゾール治療、および肝再生<ol><li> 6-12ヶ月齢[Tgは（fabp10a：CFP-NTR）転送GT1を 。 Tgは：ネットを使用して、相手側のタンクへ（Tp1のmCherryを）JH11]大人のゼブラフィッシュ。タンクあたり10個以下の魚の密度で魚を保管してください。 </li><li> 1％の最終濃度になるようにシステム水にエタノールを添加することにより、新鮮なエタノール溶液を調製します。各タンク内の500ミリリットルのEtOH溶液で成魚を治療し、28℃のインキュベーターでそれらを維持します。 </li><li>毎日新鮮なエタノール溶液への転送成魚、廃棄死んだ魚の小道具バイオハザードとしてerly。連続MTZ処理の前に72時間のために動物を扱います。 </li><li> 0.1％DMSO中にシステムの水に新鮮な10 mMのMTZ溶液を調製します。 28℃インキュベーターでMTZソリューションを事前に温めます。 28℃で8時間、1 L交差タンク内の500ミリリットルMTZ溶液で魚を扱い、アルミ箔を使用して、光から保護します。 </li><li>治療中に毎時確認し、すぐに死んだ魚を削除します。バイオハザードとして適切に死んだ魚を捨てます。 MTZ処理の終了時に、二回新鮮なシステムの水に動物を転送することによりMTZを洗い流します。 </li><li>動物は28℃のインキュベーター中で回復し、それらを維持することを可能にします。フィードおよび分析のための時点まで毎日新鮮なシステムの水に魚を移します。 </li></ol> 8.アダルトゼブラフィッシュ肝臓固定、免疫染色、および共焦点イメージング<ol><li> 0.02％トリカインで大人の魚を麻酔し、15分間氷水中で安楽死させます。パット魚ペーパータオル上で乾燥し、解剖マットの上に置きます。 </li><li>以前に20を説明したように皮膚や筋肉を除去することにより、胃腸の臓器を公開します。臀鰭に戻って後方魚の側面に沿って、その後蓋に臀鰭から腹に沿って皮膚とその下の筋肉をカットするはさみを使用し、。 </li><li> 15ミリリットルコニカルチューブに魚を入れ、PBSで1回洗浄。 PBSを削除し、4℃でO / Nを固定するために、PEM緩衝液中に新たに調製した2％のホルムアルデヒドの4ミリリットルを追加します。 </li><li>適切溶液を固定捨て、そして室温でPBSで3回洗浄します。固定したサンプルは、数日間、4℃でPBS中に維持することができます。次のステップに進むには、すぐに優れた免疫染色の結果が得られます。 </li><li>食道を切断することによって、魚の体腔からの肝臓と全体の腸を解剖。セク金型内の低融点アガロース4％と胃腸器官を埋め込みます。 </li><li>前端から出発し、氷冷PBSで50μmの間隔で横断切片にサンプルをカットするためにビブラトームを使用してください。秒の転送＃1ペイントブラシを使用して、PBSで6ウェルプレートにション。 </li><li> 4℃でブロックバッファO / Nでの透過処理およびブロックセクション。 </li><li> 1の希釈でウサギ抗コラーゲンI抗体とインキュベート：ブロック・バッファ・O / Nで100 4℃。洗浄緩衝液で5回、各15分間洗浄します。 </li><li> 1の希釈でのAlexaFluor 647結合ロバ抗ウサギ抗体でインキュベートする：ブロックバッファO / Nで200 4℃。洗浄緩衝液で一度PBSで5回、各15分間洗浄します。 </li><li>静か＃1ペイントブラシを使用してガラススライドにセクションを転送します。キムワイプを使用して過剰のPBSを取り外し、取り付けメディアのドロップを追加し、マニキュアでカバーガラスをシール。共焦点イメージングを行うことは、すぐに非常に示唆されています。 </li><li>画像をキャプチャするために40X / 1.3オイルレンズを搭載した共焦点システムを使用してください。百分の20から50にレーザー強度を使用してください。 1ミクロン間隔でZスタック画像をキャプチャします。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

私たちも、私はコラーゲン線維状の型を含むECMタンパク質の実質的な量の存在下では、HPCのが肝細胞として再生するために自分の能力を保持していることを示唆し、エタノール/ MTZ-扱わ回復肝臓におけるHPC媒介肝細胞の再生を観察しました。エタノールのみ処理はHPCの活性化15を誘導しなかったMTZのみ処理は、大幅にECMタンパク質の沈着を増加させませんでした。合わせたエタノール/ MTZ処理を利用することにより、我々は線維性肝臓でHPC-駆動再生を調査することができました。肝細胞のほぼ完全な除去はHPC-駆動肝細胞の再生を誘発するように、クラスタ化されたNRCSにより肝細胞特異的蛍光の欠如の基準に基づいてMTZ処理した幼虫と大幅に減少肝体積を整理することが重要です。動物は自由に飲んだりintragaを必要とすることを可能にする必要がないように魚では、鰓や皮膚の血管は、アルコール24を吸収します哺乳動物のモデルのようにstric注入。私たちは水を循環させることなく、別々のタンクでEtOH-、その後のMTZ処理された成魚を収容しました。毎日新鮮なエタノール溶液に魚を転送し、EtOH...

肝臓の主要な実質細胞型である肝細胞1、の顕著な再生能力にもかかわらず、慢性肝不全、肝前駆細胞（HPC）依存性再生2につながる、この能力を損ないます。 慢性肝障害は、主にアルコールの乱用、慢性C型肝炎ウイルス（HCV）感染3及び非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）4から誘導されます。それは、細胞外マトリックス（ECM）タンパク質の蓄積に関連している持続的な肝線維症につながります。永続化ECMの蓄積はその後、高い罹患率と死亡率との肝硬変で、その結果、線維性瘢痕組織5を形成することにより、無傷の肝アーキテクチャを歪めます。多くの試みがprofibrogenicサイトカインおよび活性化筋線維芽細胞6を阻害することに焦点を当て、主に線維化反応を緩和するために行われてきました。後者は主にH（肝星細胞に由来しますSCS）、肝臓の瘢痕形成4に責任原則肝非実質細胞。それにもかかわらず、持続的な線維形成侮辱の存在下で肝細胞を再生成するのHPCを含む内因性の細胞源を刺激する再生治療は、さらなる調査を待ちます。 肝線維症の多くの実験モデルは、哺乳動物において記載されています。四塩化炭素（CCl 4）の繰り返し注射が広くマウスおよびラットモデル7における肝線維症を誘導するために使用されてきました。高脂肪（HF）ダイエットと組み合わせると、アルコールはprofibrogenic遺伝子発現と肝線維症8の実質的なアップレギュレーションにつながりました。脂肪症（脂質蓄積）が急性アルコール暴露から生じるが、それはより重度の肝損傷9に肝臓が受けやすくなります。 ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュは、再生を研究するための貴重な脊椎動物モデル系として浮上しています。しかしこのようなイモリやアホロートルなどの他の下等脊椎動物は、再生のための驚くべき能力を持っている、ゼブラフィッシュは、潜在的な回生要因10を操作するために必要な遺伝子操作と可視化戦略に関して、他のモデル系を超える利点を有しています。ゼブラフィッシュは、単にそれらの水エタノール（エタノール）を添加してアルコール性肝疾患（ALD）を研究するための魅力的な脊椎動物モデルを表します。幼虫と大人のゼブラフィッシュへの急性エタノール曝露は、肝臓脂肪症11-13を引き起こしました 。成体ゼブラフィッシュは、拡張エタノール曝露を受けたときに、コラーゲン沈着は、線維症関連遺伝子14のアップレギュレーションを観察しました。ただし、必要が線維形成刺激としてのEtOHに応じて、肝臓の再生を研究するためのモデルを開発するために存在します。 最近、我々はゼブラフィッシュ15におけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルを開発しました。私たちは、幼虫とADULにエタノール治療と肝細胞特異的遺伝子除去システム​​を組み合わせましたトンのゼブラフィッシュ。我々は2つのトランスジェニック系統を生成し、Tgは（fabp10a：CFP-NTR）GT1及びTg（fabp10a：mCherryを-NTR）GT2、 大腸菌ニトロレダクターゼ（NTR）が制御の下で、それぞれシアン、mCherryを蛍光タンパク質に融合されています肝細胞特異的な脂肪酸のタンパク質10aは結合、肝臓基本 （fabp10a）プロモーター。このシステムでは、NTRは、肝細胞の明示的な死を誘導する、DNAストランド間架橋剤16に非毒性のプロドラッグメトロニダゾール（MTZ）に変換します。このモデルを使用して、我々は、Notchシグナル伝達に応答する肝細胞の集団は、肝細胞の近くにない場合およびECMを超える肝細胞に変換することを実証しました。私たちは、HPCのように、これらの細胞を指定しました。さらに、化学画面を、我々は線維症、肝臓における肝細胞の再生を増強する小分子Wntシグナル伝達の活性化剤およびNotchシグナル伝達の阻害剤を同定しました。 Therefo再は、ゼブラフィッシュにおける当社の線維性肝臓モデルは、セルculture-または哺乳動物に基づくスクリーニングシステムと比較して、優れた化学的スクリーニングシステムを表します。これは、かなりの費用と時間節約のメリットとin vivo系です。ここでは、エタノール誘発性線維症肝臓モデルを確立するためのゼブラフィッシュでは、このモデルを用いて化学スクリーンを実行するための詳細な手順を説明します。また、経時的分析は、肝細胞の再生が線維性肝臓で発生方法の検討を行いました。このプロトコルは、線維性肝臓で肝細胞の再生を促進するメカニズムと戦略を研究するための貴重なツールを提供します。

<table><tbody><tr><td>硫酸カルシウム半水和物 (CaSO4)</td><td>Acros</td><td>AC385355000</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム (MgSO4)</td><td>EMD</td><td>MX0075</td><td></td></tr><tr><td>1,4-ピペラジンジエタネスルホン酸 (PIPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)- N,N,N&prime;,N&prime;-四酢酸 (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200プルーフ</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>F79-500</td><td></td></tr><tr><td>メトロニダゾール (MTZ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3761</td><td></td></tr><tr><td>1-フェニル-2-チオ尿素 (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>3-アミノ安息香酸エチルエステル(トリカイン)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)錠</td><td>Amresco</td><td>E404</td><td>1錠を100 ml蒸留水に溶かす</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>BP165</td><td></td></tr><tr><td>幹細胞シグナル化合物ライブラリ</td><td>Selleck Chemicals</td><td>L2100</td><td>10&nbsp;DMSO</td></tr><tr><td>ActiProbe-1Kライブラリ</td>のmMストック <td>Timtec</td><td>ActiProbe-1K</td><td>10&nbsp;DMSO</td></tr><tr><td>SB</td><td>415286 Selleck Chemicals</td><td>S2729</td> の mM ストック <td>DMSO で 10&nbsp;mM</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2924</td><td>DMSOで10&nbsp;mM</td></tr><tr><td>抗コラーゲン I 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab23730</td><td>1:100 で使用して免疫染色、魚と反応</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 ロバ抗ウサギ IgG (H+L)</td><td>分子プローブ</td><td>A31573</td><td>1:200 で免疫染色に使用</td></tr><tr><td>封入剤 (Vectorshield)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>100 mm ペトリ皿</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>24-wellプレート</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11255-20</td><td>デュモン #55</td></tr><tr><td>スライド</td><td>ガラス VWR</td><td>48312-003</td><td>75x25 mm</td></tr><tr><td>カバー ガラス</td><td>VWR</td><td>48366-045</td><td>18 mm</td></tr><tr><td>ラップ</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>22305654</td><td></td></tr><tr><td>アルミ箔</td><td>フィッシャー サイエンティフィック 1213100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>バイブロトーム</td><td>ライカ</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>落射蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>コンフォコール顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>LSM700</td><td></td></tr></tbody></table>

前駆細胞が媒介する肝細胞の再生を研究するためにゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルの開発

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

細胞外マトリックス(ECM)タンパク質の蓄積が続く持続的な肝線維症は、肝臓の細胞能力の喪失をもたらし、肝細胞機能障害を伴う肝硬変を引き起こします。複数の肝障害の中で、アルコール乱用は肝不全や肝細胞癌などの重大な健康問題を引き起こす可能性があります。それにもかかわらず、アルコールに応答して肝細胞を再生する内因性細胞源の同一性は適切に調査されていません。さらに、アルコール誘発性損傷に対する肝細胞の再生を効果的にモデル化した研究はほとんどありません。私たちは最近、ゼブラフィッシュでエタノール(EtOH)誘導性線維性肝臓モデルを確立したことを報告しました。そこでは、肝前駆細胞(HPC)が線維形成刺激の存在下でほぼ完全な肝細胞喪失時に肝細胞を生じさせました。さらに、このモデルを用いた化学スクリーニングにより、肝細胞の再生を促進する複数の低分子を同定しました。ここでは、EtOH誘導性線維性肝臓モデルの開発手順と、ゼブラフィッシュにおけるこのモデルを用いた化学スクリーニングの実施手順について詳しく説明します。このプロトコルは、肝細胞が線維性肝臓でどのように再生するかの分子的および細胞的メカニズムを描写するための重要なツールになります。さらに、これらの方法は、in vivoでの慢性肝疾患の新しい治療戦略の発見を促進する可能性があります。

図1は、幼虫のゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルの開発を示しています。 EtOH中にゼブラフィッシュの幼生を露出させるためのプロトコルを最適化するには、まずエタノールの毒性を評価しました。 2.5日 - 受精後（DPF）の幼虫をEtOH濃度1％、1.5％、または同時24時間のエタノール/ MTZ処理に続いて24時間2％を暴露しました。ほぼすべての幼虫が1％EtOHを以下にさらされながら、2％エタノールへの曝​​露は、高い死亡率の原因となった、コラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質のまれな堆積と最小限の線維形成変化を示しました。これらの結果に基づいて、幼虫は、24時間（2.5〜3.5 DPF）とを同時に24時間（3.5〜4.5 DPF）（ 図1A）のためのMTZで処理するために、1.5％EtOHで前処理しました。エタノール/ MTZ-処理した幼虫は、トランクと尾の上向きの曲率、心膜浮腫、スイム膀胱を膨らませるの失敗など、形態異常を示しました。 （ 図1B）。</...

過剰な細胞外マトリックスタンパク質の沈着を伴う持続的な線維症は肝硬変を引き起こします。アルコール乱用は、重度の肝疾患の主な原因の1つです。エタノールによるゼブラフィッシュの線維性肝臓モデルを確立し、アルコールによる傷害に対する肝細胞の再生促進のメカニズムと戦略を研究しました。

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

本プロトコルの全体的な目的は、ゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性肝線維症モデルを確立し、このモデルを用いて化学物質スクリーニングを行うことです。この手法は、線維化した肝臓において肝細胞がどのように再生するかという分子および細胞メカニズムなど、肝再生分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、vevo化学スクリーニングにおいてコスト効率が高く、時間を短縮できることです。さらに、単一細胞の可視化を通じて、詳細なタイムコース解析を行うことができます。本手順の実演は、研究室のポストドクターであるMianbo Huangと、大学院生のJin Xuが行います。テキストのプロトコルに従って試薬を調製した後、脂肪酸結合タンパク質 10a:CFP-NTR と Tp1:mCherry を有する成体トランスジェニックゼブラフィッシュおよび Tg(hand2:EGFP)ゼブラフィッシュを用いて、仕切り付きの交配タンクを設置します。翌朝、仕切りを外してから2時間後に、システム水をろ過して胚を回収し、胚培地を入れた 100 millimeter のペトリ皿に移します。受精後 56 時間（HPF）に、胚に 1.5 % のエタノールを添加します。エタノールの蒸発を防ぐため、プレートをプラスチックラップで覆います。その後、28 °Cで24時間インキュベートします。新鮮な15 mM MTZおよび0.1% DMSOを含む胚培地を調製し、最終濃度が1.5%になるようにエタノールを加えます。次に、受精後80時間（80 HPF）で、ソートした胚をペトリ皿あたり20 millilitersのエタノールMTZ溶液で処理します。エタノールの蒸発を防ぐためにプラスチックラップでプレートを覆い、遮光のためにアルミホイルで覆います。その後、28 °Cで24時間インキュベートします。翌日、CFPフィルターを用いて倍率80倍の蛍光顕微鏡下で胚を観察し、肝細胞がほぼ完全に除去された幼魚を選別します。化学スクリーニングを行うために、DMSOで調製した10 mMの化学物質ストックを含む96ウェルプレートを-80℃の冷凍庫から取り出します。化学物質の光分解を防ぐため、プレートをアルミホイルで覆い、室温で緩やかに揺らしながら解凍してください。1.5 mLチューブを用いて、10 mMストック溶液5 µLを胚培地1 mLで希釈し、最終濃度50 µMの化学溶液を調製します。次に、肝細胞がほぼ完全に除去された幼魚を1ウェルあたり5匹ずつ、胚培地を満たした24ウェルプレートに移します。その後、胚培地を除去し、各ウェルに化学溶液500 µLを加えます。アルミホイルでプレートを覆い、幼虫を28°Cで50時間インキュベートします。インキュベーション後、落射蛍光顕微鏡を用い、80倍の倍率でCFP発現肝細胞の数および/または強度を観察します。CFP発現肝細胞の数および/または強度が増加または減少した生存幼虫の画像を撮影します。fatty acid binding protein 10a:CFP-NTRおよびTP1:mCherryを持つトランスジェニックゼブラフィッシュを交配させ、選別した幼魚を6～12か月齢まで育成する。ネットを用いて、成体のトランスジェニックゼブラフィッシュを交配タンクに移す。システム水で1%のエタノール新鮮溶液を調製し、その溶液500 millilitersを用いて交配タンク内のシステム水を交換する。水槽を28 °Cで72時間インキュベートし、インキュベーション期間中は毎日、魚を新鮮なエタノール溶液に移し、死魚を除去します。0.1% DMSOを含むシステム水で、新鮮な10 mM MTZ溶液を調製し、1 Lの交配水槽内の魚に、あらかじめ加温したMTZ溶液を500 mL添加します。アルミホイルを用いて水槽を覆います。28 °Cで8時間インキュベートし、本文のプロトコルに従って分析します。本文のプロトコルに従って麻酔をかけた後、はさみを用いて、肛門鰭から鰓蓋にかけて腹部の皮膚と皮下筋を切開し、胃腸器官を露出させます。その後、魚の側面に沿って後方に、肛門鰭まで切開します。魚を15 mLコニカルチューブに入れ、PBSで1回洗浄します。次にPBSを除去し、PEMバッファーで調製したばかりの3%ホルムアルデヒドを4 mL加えます。4 °Cで一晩インキュベートし、魚を固定します。翌日、テキストプロトコルに従ってサンプルを洗浄した後、食道を切断し、肝臓とともに腸管全体を体腔から摘出します。次に、胃腸器官を包埋モールドに入れ、4%低融点アガロースを用いて組織を包埋します。その後、ブロックを台形にトリミングし、ベースに接着します。次にビブラトームを用い、組織の内端から、氷冷したPBS中で50 µm間隔で横断切片を作成します。1号筆を使用して、切片をPBSが入った6ウェルプレートに回収します。本文のプロトコルに従って切片を免疫染色した後、1号筆を用いて切片を慎重にガラススライドへ転送します。Kimwipesを使用して余分なPBSを除去した後、封入剤を1滴滴下し、カバーガラスを載せます。次に、マニキュアを用いてカバーガラスを封止します。最後に、40x 1.3 NA油浸レンズを搭載した共焦点システムを用い、強度20〜50％、間隔1 µmでZスタック画像を撮影します。この図は、エタノールおよびMTZで処理した幼魚に、体幹と尾の上方への湾曲、心膜浮腫、および浮き袋の膨張不全が生じることを示しています。ここで見られるように、DMSOで処理した対照群の肝臓では、線維状のI型コラーゲンの沈着は見られませんでした。一方、エタノールおよびMTZで処理した肝臓では、切除後25時間および50時間においてI型コラーゲンの蓄積の上昇が認められました。さらに、DMSOで処理した対照群の肝臓と比較して、エタノールおよびMTZで処理した再生肝臓では、HSCの数が増加し、細胞質突起を欠く筋線維芽細胞様（myofibrillblast-like）の形態を示しました。この図は、1%のエタノール処理後にMTZを投与した成体ゼブラフィッシュにおける、エタノール誘発性肝線維化モデルの構築を示しています。これらの時系列解析から、DMSO処理肝臓と比較して、エタノールおよびMTZで処理した再生肝臓では、切除後2日、3日、および4日目に、I型コラーゲンの沈着が有意に亢進していることが観察されました。この化合物スクリーニング実験では、1.5%のエタノールと15 mMのMTZ存在下で肝細胞をアブレーションしました。その後、幼魚を化合物に50時間曝露させました。グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3阻害剤などの多くのWntアゴニストやWntアクチベーターは、DMSOと比較して肝細胞の再生を促進しました。これらのデータは、この持続的線維化モデルが、肝細胞の再生を促進する低分子化合物を探索するための極めて有用なツールとなることを示唆しています。この手法を習得すれば、適切に実施することで1週間で完了させることができます。本手順を行う際は、肝細胞をほぼ完全に除去すること、および手順を通じてエタノール濃度を維持することが重要です。本手順に従うことで、同定された化合物群の効率を哺乳類の肝損傷モデルで検証することが可能です。本手法の開発により、慢性肝不全患者に対する新たな治療戦略の発見に向けた、細胞再生治療の分野における新たな道が開かれることが期待されます。このビデオを視聴することで、ゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性肝線維化モデルの構築方法および、化合物スクリーニングの実施方法について十分に理解できるはずです。ホルムアルデヒドの取り扱いは極めて危険であるため、本手順を実施する際は、常に手袋の着用や化学薬品用ドラフトチャンバー内での試薬操作などの予防策を講じてください。

development-an-ethanol-induced-fibrotic-liver-model-zebrafish-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

エタノール誘発性発達損傷の分子機構を理解するために、我々は、エタノール暴露のゼブラフィッシュモデルを開発しており、エタノールの暴露後に発生する物理的な、携帯電話、および遺伝的変化を模索している...

胎児性アルコール暴露のゼブラフィッシュモデルの催奇形性変化を評価する

メタボリックメモリは、糖尿病合併症が持続し、正常血糖値は、薬学的に達成された後でも妨げられることなく進行する現象である。ここで我々はそれがメタボリックメモリの分裂伝染エピジェネティックな部品の検査を可能にするという点でユニークである糖尿病のゼブラフィッシュモデルを記述...

糖尿病とメタボリックメモリーのゼブラフィッシュモデル

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胆道主導の肝臓の再生を研究するためにゼブラフィッシュにおける肝細胞特異的アブレーション

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ゼブラフィッシュにおける急性アルコール性肝障害の組織学的解析

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ブライトフィールド顕微鏡を用いた幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズの定量化

この研究は、適切な暴露方法から胚処理およびエタノール分析へのヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いてゼブラフィッシュ胚のエタノールレベルを定量化するプロトコルを記述する。...

ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いたゼブラフィッシュ胚におけるエタノール濃度の定量

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成体ゼブラフィッシュにおけるシスプラチンによる急性腎損傷モデル

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成虫ゼブラフィッシュの部分肝切除術

ここでは、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)関連の肝細胞癌(HCC)ゼブラフィッシュモデルを生成して、肝臓の微小環境と免疫細胞の景観に対するコレステロール余剰の影響を研究する方法を紹介します。...

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この研究では、トランスジェニックコンストラクトを作成してゼブラフィッシュ胚に注入するためのゲートウェイベースのクローニング方法であるモジュラーTol2トランスジェネシスシステムのプロトコルについて説明します。...

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ここでは、受精後少なくとも1〜7日の任意の段階で、ゼブラフィッシュの胚と幼虫に高い空間的および時間的解像度で細胞を移植するためのプロトコルを紹介します。...

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学ぶエタノール誘発性線維症肝臓モデルの構築法。ゼブラフィッシュを用いて肝細胞再生の分子機構を探索し、化学スクリーニングで治療薬候補を同定するコスト効率の良い手法です。

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