の調製と分析インビトロ三次元乳癌サロゲート

この一連の手順の全体的な目標は、in vitro乳がんの代理として機能する三次元細胞培養を作製し、代理の組織切片における細胞増殖を測定する方法を提示することです。三次元細胞培養は、二次元細胞培養よりもin vitroで細胞の挙動をモデル化する生理学的に関連性のある方法です。実験条件で細胞組成を変化させることにより、この一連の手順は、さまざまな生物学的問題に対処し、候補治療薬の有効性を評価するために適合させることができます。

細胞をECMに組み込むには、氷上で、細胞と添付の原稿の表1にリストされている最初の4つの関連成分を2ミリメートルの微量遠心チューブに加えます。次に、ピペッティングで穏やかに混合し、気泡が発生しないようにします。10XD MEMのフェノールレッドを使用してpHレベルを監視し、混合物がオレンジピンク色を示し、pHが7であることを確認します。

混合物が黄色に見え、pHが低すぎる場合は、適切な色になるまで、7.5%の重炭酸ナトリウムを一度に1滴ずつゆっくりと追加します。.混合物を氷上に保管し、ECMの早期重合を防ぐために迅速に作業することを忘れないでください。固体の3D培養では、チャンバーを氷上にスライドさせて、ECMの早期重合を防ぎます。

100マイクロリットルの細胞ECM混合物を8ウェルチャンバースライドの各ウェルにゆっくりとピペットで入れ、ウェルの縁の周りに細胞ECM混合物をピペットで動かして、混合物をよりよく分配します。次に、サロゲートを摂氏37度、CO25%で45分間インキュベートし、ECM重合を可能にします。45分後、各ウェルに100マイクロリットルの培地を加え、実験期間中、摂氏37度とCO2を5%でインキュベー

培地は2日ごとに交換してください。3D培養の限界は、酸素と栄養素のボリュームへの拡散が細胞の生存率をサポートするのに十分でない可能性があることです。バイオリアクターシステムの追加は、この制限を克服し、成長を促進するのに役立つ可能性があります。

バイオリアクターシステムで3D培養を大量に行うには、バイオリアクターシステムの代理母を収容する部分を滅菌して準備し、組み立てます。細胞培養フード内で、26ゲージ針付きシリンジを使用して、細胞を封入するように設計された灌流バイオリアクターの領域に細胞ECM混合物を注入し、迅速に次のステップに進みます。サロゲート内の細胞がより均一に分布するように、サロゲートを収容するバイオリアクターコンポーネントを50ミリリットルの円錐管に配置します。

18 rpmでサロゲートを連続的に回転させながら、in situハイブリダイゼーションオーブンまたはインキュベーターで摂氏37度で45分間インキュベートし、ECM重合を可能にします。重合と培地の添加に続いて、バイオリアクターアセンブリをポンプに接続します。インキュベーター内で摂氏37度、CO2の5%で培地灌流を開始します。

実験期間中は培地灌流を継続し、特定の実験デザインに必要な培地を変更します。実験の最後に、代理母を標本処理ゲルで包み込み、処理中に代理母を無傷に保ち、組織学的切片化を容易にします。これを行うには、試料処理ゲルを60°Cの水浴で使用できるようになるまで溶かします。

次に、約300マイクロリットルの検体処理ゲルを標識されたクライオモールドの底にピペットで入れます。メスの刃と鉗子を使用して、バイオリアクターまたは8ウェルチャンバースライドのウェルからサロゲートを慎重に取り出し、標本処理ゲルを含むクライオモールドに入れます。約300マイクロリットルの検体処理ゲルをピペットで固定し、クライオモールドで代理を覆います。

その後、摂氏4度で30分間インキュベートします。検体処理ゲルが固まったら、サロゲートが入った検体処理ゲルをクライオモールドから取り出し、ティッシュカセットに入れます。複数のサロゲートを同じ組織カセットに入れる場合、組織マーキング色素を使用して、固定および処理後のサンプルを区別できます。

続いて、代理物質を含む組織カセットを室温で10〜12時間、10%中性緩衝製剤に入れ、完全固定を可能にする。固定後、代理物質を含む組織カセットを70%エタノールに移します。これで、固定サロゲートをパラフィンに処理し、その後の組織学的切片化を行う準備が整いました。

HおよびE染色切片の細胞密度および顕微鏡画像を測定するには、サロゲートの画像ファイルを開きます。ImageJ のポリゴン ツールと ECM のエッジをガイドとして使用して、マウスをドラッグしてクリックしてアンカー ポイントを作成し、サロゲートの領域の輪郭を描きます。アウトラインが表示されたら、[分析] タブの [測定] を選択します。

次に、サロゲート面積の測定に使用した画像ファイルをファイルリストにドラッグして、Cell Profilerにアップロードします。次に、名前とタイプのインポート モジュールでインポートされた各画像に名前を割り当て、画像の種類を選択します。解析パイプラインが生成されたら、テストモードを開始し、Cell Profiler で Run をクリックします。

また、フィルタリングされたオブジェクトを評価して、テスト画像内の核の大部分が適切に識別され、細胞を識別するための最適なパラメータが選択されていることを確認します。含まれる原子核は緑色の丸で囲まれています。次に、プロジェクトを保存し、テストモードを終了して、「イメージの分析」をクリックします。

ここに示されているのは、7日間培養した灌流サロゲートのHおよびE染色切片の代表的な画像です。そして、これは、2日ごとに培地を交換して7日間成長させた固体の代理母からのHおよびE染色切片の代表的な画像です。細胞性は、固体の代理母でははるかに低くなります。

このグラフは、成長の7日後の面積あたりの平均有核細胞数の比較を示しています。灌流された堅実な代理母。これらの数値データは、HおよびE染色切片の写真顕微鏡写真の細胞性を裏付けています。

そして、このグラフは、灌流された代替物と固体の代用物の7日間の成長後の細胞増殖の測定であるKi-67標識指数の比較を示しています。これらのデータは、灌流サロゲートのさらなる成長を再びサポートしています。この手順に続いて、代理母の組織切片に対してin situハイブリダイゼーションやアミノ組織化学などの他の方法を実行して、RNAやタンパク質の発現などの質問に答えることができます。

このビデオを見れば、三次元in vitro組織サロゲートの調製方法と処理方法、およびHおよびE染色された組織切片のサロゲート分析の実施方法について十分に理解できるはずです。