Name: の調製と分析インビトロ三次元乳癌サロゲート (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 学ぶ三次元乳がんサロゲートの調製法。灌流バイオリアクター系を用いて細胞培養を維持し、組織学的解析で細胞密度を評価します。治療薬の有効性評価に応用可能です。

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アラバマ大学バーミンガム代謝骨疾患センターは、代理母の組織学的処理と切片化を行いました。Southern Research(アラバマ州バーミンガム)は、バイオリアクターシステムの製造を支援しました。資金は、米国国防総省の乳がん研究プログラム(BC121367)によって提供されました。

<ol><li>Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+3D+environments+to+elucidate+the+effect+of+environmental+parameters+on+drug+response+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer.</a> Integr Biol (Camb). 3 (1), 31-38 (2011).</li>
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<li>Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microenvironment+in+breast+cancer+progression%3A+biology+and+implications+for+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 227(2011).</li>
<li>Mao, Y., Keller, E. T., Garfield, D. H., Shen, K., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+in+tumor+microenvironment+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 32 (1-2), 303-315 (2013).</li>
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<li>Wendt, D., Marsano, A., Jakob, M., Heberer, M., Martin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillating+perfusion+of+cell+suspensions+through+three-dimensional+scaffolds+enhances+cell+seeding+efficiency+and+uniformity%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Oscillating perfusion of cell suspensions through three-dimensional scaffolds enhances cell seeding efficiency and uniformity.</a> Biotechnol Bioeng. 84 (2), 205-214 (2003).</li>
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<li>Calcagnile, P., Fragouli, D., Mele, E., Ruffilli, R., Athanassiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+foams+with+functional+nanocomposite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Polymeric foams with functional nanocomposite cells.</a> RSC Adv. 4, 19177-19182 (2014).</li>
<li>Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+signatures+of+human+mammary+carcinoma+identify+novel+metastasis+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters.</a> eLife. 3, (2014).</li>
<li>Lochter, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+extracellular+matrix+constituents+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Involvement of extracellular matrix constituents in breast cancer.</a> Semin Cancer Biol. 6 (3), 165-173 (1995).</li>
<li>Joiner, K. S., Spangler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+HistoGel-embedded+specimens+for+use+in+veterinary+diagnostic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Diagn+Invest%22%5BJournal%5D)">Evaluation of HistoGel-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology.</a> J Vet Diagn Invest. 24 (4), 710-715 (2012).</li>
<li>Varsegi, G. M., Shidham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Block+Preparation+from+Cytology+Specimen+with+Predominance+of+Individually+Scattered+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells.</a> J Vis Exp. (29), e1316(2009).</li>
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<li>Otali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effects+of+formalin+fixation+and+tissue+processing+on+immunorecognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Combined effects of formalin fixation and tissue processing on immunorecognition.</a> Biotech Histochem. 84 (5), 223-247 (2009).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

本明細書において、3D培養の方法は、より密接にモデルヒト乳癌は概括的な3D形態の開発を可能にする量で、細胞外マトリックス（ECM）およびヒト間質線維芽細胞を含む組織の微小環境の成分を組み込むことが記載されています。記載の三次元培養法は、ECMの三次元ボリュームに組み込まれている、複数の細胞型における従来の2D細胞培養物よりも、ヒト疾患のより代表的です。組織構造、微小環境からの信号、及び次元を考慮1,8に取り込まれているので、これらのパラメータ（ すなわち、複数の細胞型、ECM、および3Dボリューム）が生物学的プロセスを研究するために多くの充当のコンテキストを提供することが注目されています。 3D培養の他の方法は、以前の3Dマトリックス29の上に細胞の培養を含む、記載されており、スフェロイド30の生成は、懸滴31は 、cutluresndはマイクロ流体デバイス32を使用します。これらのシステムのそれぞれは、ユニークな利点を有しているが、全体として、それらはマトリックス成分、間質細胞集団、または代表的な次元のいずれ...

より正確にインビボでの腫瘍アーキテクチャおよび微小環境を模倣する三次元（3D）培養モデルは、細胞とその微小環境との間の複雑な相互作用を分析するために候補治療法の有効性を試験することを目的とした研究のために重要です。腫瘍次元への影響の酸素と栄養勾配、薬物暴露、間質圧/血液の流れ、および3Dアーキテクチャ1-4の均一性。適切な間質微小環境の存在は、腫瘍の次元と影響細胞のECMシグナリングおよびストローマ細胞と悪性上皮細胞間の傍分泌シグナル伝達に貢献しています。細胞機能に対する腫瘍の次元と微小環境の影響はよく両方の要因が、薬物応答1,3,5-8を変更することで、確立されています。さらに、細胞増殖動態、代謝率、および細胞シグナル伝達は、これらの要因がaffeで、3Dで2次元（2D）文化と文化の間で異なります細胞応答1,3,8-10を cting。 インビトロでは 、腫瘍微小環境代理代表ECM成分および間質細胞の集団を含むことによって調節することができます。悪性上皮細胞はさらに、腫瘍の伝播5,6,10を阻害するためにECMおよび癌関連間質細胞のいずれかによって腫瘍の進行を促進するための相乗/保護方法で、または抑制の方法で影響を受けています。いずれかの文脈では、基質は、薬物送達1,6を減少パラ分泌シグナル伝達を介して、および/ ​​または、その結果、腫瘍内の間質圧力を増加させることによって、治療応答および薬物送達に影響を与えることができます。したがって、前臨床モデルへのECMとの間質細胞の添加は、2D培養で十分にモデル化することができない腫瘍の特徴を再現するのに役立ちます。 ECM成分とsを含む概括的微小環境を組み込む乳癌サロゲートを確立するために、本明細書の方法3D体積tromal細胞は、記載されています。乳癌では、間質細胞集団は主に癌関連線維芽細胞（CAF）および間質ECMから構成されているが、主としてラミニンおよびコラーゲンIV型を含む基底膜に見出されるマトリックス成分のより少ない割合でI型コラーゲンで構成されています1,4,11-13。したがって、乳癌の微小環境（ すなわち、CAF、コラーゲンI、および基底膜）のこれらの構成要素は、サロゲートに組み込まれています。この方法は、固体の、非灌流3D代用物（ 図1A）を生成するために使用することができ、またはバイオリアクターシステム（ 図1B）を介してサロゲートを通して培地の灌流を含むように適合させることができます。両方のアプローチは、ここで説明されています。この方法はまた、腫瘍関連マクロファージのような他の間質要素を含むように改変され得る、または必要に応じて、細胞とECMの成分を調整することにより、他の固形腫瘍をモデル化します。 <pクラスここで説明乳癌サロゲートの場合= &quot;jove_content&quot;&gt;我々は、MDA-MB-231を利用している（231）乳癌細胞株、CAFは、以前にヒト乳癌14、及びIは、（90％のコラーゲンからなるECMから単離されました6 mg / mlで）および10％の増殖因子低減基底膜材料（BM）。サロゲートは、いずれか8ウェルチャンバースライド（固体サロゲート）に成長させるか、バイオリアクターシステムは、連続的栄養かん流（灌流サロゲート）を提供するために利用されます。 ECMを含有する細胞の量を収容することができる任意の灌流バイオリアクターシステム15を使用することができます。例として、私たちは私たちのバイオリアクターシステムにおける組織サロゲートの調製を記載します。このシステムは、社内で開発され、市販されていないました。ここで我々の焦点は、3D組織代替物の調製および分析上にあるので、私たちは私たちのバイオリアクターシステムの製造及び組み立ての仕様に関する広範な詳細に行っていません。しかしながら、詳細な説明このシステムとその開発は16を発表してきました。このバイオリアクターシステムにおいては、ポリジメチルシロキサン（PDMS）流路は、PDMSフォームでサポートされているサロゲートを収容するために使用される（Calcagnile ら 17によって記載されたものと同様の方法を用いて形成されます）。このボリュームは、連続的に代理に酸素と栄養を供給するためにmicrophysiologicポンプを介して媒体によって灌流されている4マイクロチャンネル（直径各400ミクロン）によって貫通されています。 サロゲートの適切な分析は、治療または他の操作に応答した細胞機能に関する適切な情報を得るために重要です。サロゲートは、固定および処理後の分泌物、または組織切片上での分析のために、共焦点顕微鏡または非侵襲的イメージングの他の手段、馴化培地、または灌流液をアッセイすることによって間接的細胞解析を用いて、無傷のサロゲートの直接画像を含む様々な方法によって分析することができますにパラフィン。組織切片で評価することができるそのようなパラメータは、セル密度です。我々は、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）で染色されたサロゲート組織切片の顕微鏡写真に適用される半自動画像処理技術を用いて細胞密度（ すなわち、断面積当たりの有核細胞数）を測定するための一つのアプローチを提示します。細胞密度は、時間の経過または様々な増殖条件および処理の結果は、細胞数の相対的な変化の指標として用いることができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54004/54004fig1.jpg" /> 図1の3次元ボリュームとバイオリアクターシステム。 3Dソリッドサロゲートを生成するためのプロセスのA）概略図。トップ：ECMを含む固体3Dボリュームの漫画（ピンク）、上皮癌細胞（黄色）、およびCAF（オレンジ）。下：サロゲートを含む8ウェルチャンバースライドの上面図B）概略工程の灌流3Dのサロゲートを生成します。トップ：CA培地灌流およびECMを含む（ピンク）、上皮癌細胞（黄色）、およびCAF（オレンジ色）を可能にするためのチャネルを有する3Dボリュームのrtoon。中央：PDMSフォーム（黒矢印）を含むPDMS流路の画像は、細胞+ ECMを注入し、直径400μmの測定ポリマー被覆ステンレス鋼線（ピンク色矢印）によって貫通されます。底：サロゲートを含有する連続媒体灌流を可能にするバイオリアクターシステムに接続されたPDMS流路の画像（蠕動ポンプと媒体リザーバ図示せず）とC）培養後、固体及び灌流サロゲート両方の処理ステップの写真。左：ゲルとサロゲートを処理する検体を含むcryomoldの画像。ミドル：固定され、処理サロゲートを含むパラフィンブロックの画像。右：サロゲートのH＆E染色した組織学的セクションとスライドガラスの画像<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54004/54004fig1large.jpg" target="_blank">表示するには、こちらをクリックしてください。</a>この図の拡大版。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコの改変Eagel Medium 1x(DMEM)</td><td>Corning CellGro</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>0.25%トリプシン+ 2.21&nbsp;mM EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>組織培養プレート、100&nbsp;mm</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229620</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>組織培養プレート、35&nbsp;mm</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229638</td><td>PDMSフォーム形成用&nbsp;</td></tr><tr><td>9インチガラスピペット</td><td>フィッシャー&nbsp;</td><td>13-678-20D</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>10 ml ピペット</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229210B</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>1,000 & マイクロ;lピペットチップ</td><td>FisherBrand</td><td>02-717-166</td>滅菌<td>フィルター200</td></tr><tr><td>&micro;l ピペットチップ</td><td>FisherBrand</td><td>02-717-141</td><td>滅菌フィルター</td></tr><tr><td>10 & マイクロ;l ピペットチップ</td><td>FisherBrand</td><td>02-717-158</td><td>滅菌ろ過</td></tr><tr><td>15 ml コニカルチューブ</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229410</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>50 ml コニカルチューブ</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229422</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>1.5 ml 微量遠心チューブ</td><td>FisherBrand</td><td>05-408-129</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td>不妊</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>24236-10</td><td>PDMSエラストマーと硬化剤。自社製バイオリアクターに使用。</td></tr><tr><td>PDMSフォーム</td><td></td><td></td><td>社内のバイオリアクターで使用するために社内で製造されています。</td></tr><tr><td>高濃度ウシコラーゲンI型</td><td>アドバンスドバイオマトリックス</td><td>5133-A</td>フィ<td>ブリコール~10 mg / ml</td></tr><tr><td>成長因子還元マトリゲル(基底膜)</td><td>コーニング</td><td>354230</td><td>基底膜材料</td></tr>重<tr><td>炭酸ナトリウム</td>シ<td>グマ</td><td>S8761</td><td></td></tr>分子<tr><td>生物学グレードウォーター</td><td>フィッシャーBP2819-1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM 10x&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2429</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek チャンバースライドシステム&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>の177402</td><td>8ウェル</td></tr><tr><td>バイオリアクター</td><td></td><td></td><td>自社製。</td></tr><tr><td>スプリングバック 304 ステンレススチールPTFE</td><td>ポリマーMcMaster-Carr</td><td>1749T19</td><td>ステンレス鋼線でコーティングされ、社内バイオリアクターシステムでマイクロチャネルを生成します。 直径0.016インチ</td></tr><tr><td>BioPharm Plusプラチナ硬化シリコーンポンプチューブ、L/S 14</td><td>Masterflex</td><td>EW-96440-14</td><td>社内バイオリアクターシステム用。チューブ内径:1.6 mm、ホースバーブサイズ:1/16インチ</td></tr><tr><td>2ストップチューブセット、ノンフレアPVC、1.52&nbsp;mm ID</td><td>コール・パーマー&nbsp;</td><td>EW-74906-36</td><td>当社自社製バイオリアクターシステム(マイクロペリスタリックポンプ付)用&nbsp;</td></tr><tr><td>6チャンネル精密マイクロ蠕動ポンプ</td><td>コール・パーマー</td><td>EW-74906-04</td><td>社内バイオリアクターシステムで使用するため</td></tr><tr><td>ツベルクリンシリンジ</td><td>BDメディカル</td><td>309625</td><td>26ゲージ 3/8インチ針;生殖不能</td></tr><tr><td>の解剖ティッシュ鉗子</td><td>FisherBrand</td><td>13-812-36</td><td>5.5インチ</td></tr><tr><td>小型管の回転子</td><td>Boekel Scientific</td><td>260750</td><td>代理回転のための装置選択。50mlチューブ用カルーセル(型番260753)に使用</td></tr><tr><td>50mlチューブカルーセル</td><td>Boekel Scientific</td><td>260753</td><td>ミニチューブローテーターBambino</td></tr><tr><td>&nbspに使用。ハイブリダイゼーションオーブン</td><td>Boekel Scientific</td><td>230301</td><td>代理回転のための機器オプション</td></tr><tr><td>HistoGel 試料処理ゲル</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td>ステップ5.2で説明した試料処理ゲル</td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>Andwin Scientific</td><td>4566</td><td>15 mm x 15 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>Tissue Marking Dye</td><td>Cancer Diagnostics, inc.&nbsp;</td><td>03000P</td><td>サロゲートのマーキングに使用でき、1つの組織カセットに複数のサンプルを含めることができます&nbsp;</td></tr><tr><td>ヒンジ式ティッシュカセット&nbsp;</td><td>FisherBrand</td><td>22-272-416</td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン</td><td>フィッシャー</td><td>23-245-685</td><td></td></tr><tr><td>GoldSeal プレーンガラススライド</td><td>Thermo Scientific</td><td>3048-002</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>フィッシャー</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、200プルーフ (100%)、USP</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2805M</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7211</td><td></td></tr><tr><td>クラリファイヤー</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7401</td><td></td></tr><tr><td>Bluing Solution</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7301</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7111</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal XYL マウンティングメディア</td><td>: Thermo Scientific, Richard-Allan Scientific</td><td>83124</td><td></td></tr>, <tr><td>Coverslips,</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

の調製と分析<em&gt;インビトロ</em&gt;三次元乳癌サロゲート

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

三次元（3D）培養は、二次元培養物よりもin vitroでの細胞の挙動をモデル化するために、より生理学的に関連する方法です。乳癌を含む癌は、線維芽細胞および細胞外マトリックス（ECM）を含む、がん上皮細胞および間質成分からなる複雑な3次元組織です。しかし、乳癌のほとんどのin vitroモデルは、したがって、間質を省略し、唯一の癌上皮細胞からなり、そして、in vivoでの腫瘍の3Dアーキテクチャ。癌の適切な3Dモデリングは、腫瘍生物学、行動、および治療に対する反応の正確な理解のために重要です。しかし、3Dモデルの文化とボリュームの持続時間は、培養中の酸素や栄養素の利用可能性によって制限されます。ここで、我々は、乳癌上皮細胞及び間質線維芽細胞は、間質を含むとして培養することができる3D乳癌サロゲートを生成するECMに組み込まれた方法を示します固体の3D構造または酸素および栄養素を送達するための灌流バイオリアクターシステムを使用することによって。セットアップおよび初期成長期に続いて、サロゲートは、前臨床薬物試験のために使用することができます。代替的に、代理の細胞およびマトリックスの構成要素は、生物学的問題の様々な対処するために変更することができます。培養後、サロゲートを固定し、目的のパラメータの評価のために、臨床的乳癌試料の処理と同様に、パラフィンに処理されます。 ImageJのとCellProfiler画像解析ソフトウェアシステムは、サロゲートの組織切片の顕微鏡写真に適用され、説明されているそのようなパラメータ、存在する細胞の密度の評価は、面積当たりの有核細胞の数を定量します。これは、時間の経過とともに細胞数の変化または変動する成長条件および治療から得られた細胞数の変化の指標として使用することができます。

上述の7日間増殖させたような固体及び灌流の両方の3D乳癌代用物を調製しました。その後、サロゲートは、固定パラフィンように処理し、切片、および上記のように、ヘマトキシリン​​およびエオシンで染色しました。各サロゲートの面積当たりの有核細胞の数（両方とも231細胞及びCAF）を測定しました。 図12に見られるように、H＆E染色切片の代表的な顕微鏡写真は、細胞の密度が最初に組み込まれていても、固体の代用物（ 図12B）と比較して、灌流サロゲート（ 図12A）に存在する細胞の高濃度を示しますサロゲートは、両方の固体と灌流条件で同じでした。 Tによって決定されるように、細胞増殖のこの視覚的表現は、灌流サロゲート領域あたりの細胞のより高い平均数（密度）でサポートされている（n = 3）を固体代用物と比較した（n = 3）されています彼は分析（ 図12C）を CellProfiler。 図12Cのデータを取得するために...

私たちは、酸素と栄養素を送達するために灌流バイオリアクターシステムを使用して培養できる3D乳がん代理を生成する方法を示します。成長後、代理母体を固定し、目的のパラメータの評価のためにパラフィンに加工します。そのようなパラメータの1つであるセル密度の評価について説明します。

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

一連の手順の全体的な目的は、in vitroでの乳がんサロゲートとして機能する3次元細胞培養物を構築し、そのサロゲートの組織切片における細胞増殖を測定する方法を提示することです。3次元細胞培養は、2次元細胞培養よりも、in vitroで細胞の挙動をモデル化する上で生理学的に妥当性の高い手法です。実験条件における細胞組成を変更することで、この一連の手順をさまざまな生物学的疑問へのアプローチや、候補治療薬の有効性評価に適応させることができます。細胞をECMに組み込むため、氷上で、細胞と付随する原稿の表1に記載されている関連する最初の4つの成分を、2 mmのマイクロ遠心チューブに加えます。次に、ピペッティングで緩やかに混合し、気泡が生じないように注意してください。10X MEMに含まれるフェノールレッドを用いてpHレベルを確認し、混合液がpH 7を示すオレンジピンク色であることを確認してください。混合液が黄色に見え、pHが低すぎる場合は、適切な色になるまで7.5%重曹溶液を1滴ずつゆっくりと添加してください。混合液は氷上で保持し、ECMの早期重合を防ぐために迅速に操作してください。固体の3D培養を行う場合は、ECMの早期重合を防ぐためにチャンバースライドを氷上に置いてください。細胞ECM混合液100 µLを8ウェルチャンバースライドの各ウェルにゆっくりとピペットで分注し、混合液がより均一に広がるよう、ウェルの縁に沿ってピペットで塗り広げます。次に、ECMを重合させるため、サロゲートを37 °C、5% CO2条件下で45分間インキュベートします。45分後、各ウェルに100 µLの培地を加え、実験期間中、37 °C、5% CO2条件下でインキュベートします。培養液を2日ごとに交換してください。3D培養の制限として、体積内部への酸素や栄養素の拡散が不十分で、細胞の生存を維持できない場合があります。バイオリアクターシステムを導入することで、この制限を克服し、増殖を促進できる可能性があります。バイオリアクターシステム内で3D培養を灌流させるため、サロゲートを収容するバイオリアクターシステムの部位を無菌的に準備し、組み立てます。セルカルチャーフード内で、26ゲージの針を装着したシリンジを使用し、細胞を含むECM混合液を灌流バイオリアクターの細胞収容領域に注入し、速やかに次のステップに進みます。サロゲート内での細胞分布をより均一にするため、サロゲートを収容したバイオリアクター構成部品を50 milliliterのコニカルチューブに入れます。ECMの重合を促進するため、in situ ハイブリダイゼーションオーブンまたはインキュベーター内で37 °Cで45分間、サロゲートを18 rpmで連続回転させながらインキュベートします。重合後、培地を添加し、バイオリアクターアセンブリをポンプに接続します。37 °C、5% CO2のインキュベーター内で培地の灌流を開始します。実験期間中は培地の還流を継続し、特定の実験デザインに応じて必要に応じて培養液を交換します。実験終了後、処理中にサロゲートを無傷に保ち、組織切片作成を容易にするため、サロゲートを検体処理用ゲルで包みます。そのためには、検体処理用ゲルを使用可能な状態になるまで60 °Cの恒温水槽で融解させてください。次に、ラベルを貼ったクライオモールドの底に、試料処理用ゲルを約300 µLピペッティングします。メス刃とピンセットを用いて、バイオリアクターまたは8ウェルチャンバースライドのウェルからサロゲートを慎重に取り出し、試料処理用ゲルが入ったクライオモールドの中に配置します。さらに、試料処理用ゲルを約300 µLピペッティングし、クライオモールド内のサロゲートを覆います。その後、4 °Cで30分間インキュベートします。標本処理用ゲルが凝固したら、サロゲートを含む標本処理用ゲルをクライオモールドから取り出し、組織カセットに入れます。複数のサロゲートを同じ組織カセットに入れる場合は、固定および処理後のサンプルを区別するために、組織標識染料を使用することができます。続いて、サロゲートの入った組織カセットを10%中性緩衝ホルマリンに浸し、室温で10〜12時間置いて完全に固定します。固定後、サロゲートの入った組織カセットを70%エタノールに移します。これで、固定済みサロゲートをパラフィン包埋処理およびその後の組織切片作成に使用できる状態になります。H&amp;E染色切片の細胞密度および光学顕微鏡画像の測定を行うため、サロゲートの画像ファイルを開きます。ImageJのPolygonツールを使用し、ECMの端をガイドにして、マウスをドラッグしてアンカーポイントをクリックし、サロゲートの領域を囲みます。囲んだ後、AnalyzeタブのMeasureを選択します。次に、サロゲートエリアの測定に使用した画像ファイルを、ファイルリストにドラッグしてCell Profilerにアップロードします。その後、「Names and Types Import」モジュールで、インポートした各画像に名前を割り当て、画像タイプを選択します。解析パイプラインが生成されたら、テストモード（Test Mode）を開始し、Cell Profilerの「Run」をクリックします。フィルター後のオブジェクトを評価し、テスト画像内の核の大部分が適切に識別されていること、および細胞を識別するための最適なパラメータが選択されていることを確認します。抽出された核は緑色の円で囲まれます。その後、プロジェクトを保存し、テストモードを終了して、「Analyze Images」をクリックします。ここに示しているのは、7日間培養した灌流サロゲートのH&amp;E染色切片の代表的な画像です。そして、こちらは培地を2日ごとに交換し、7日間培養したソリッドサロゲートのH&amp;E染色切片の代表的な画像です。ソリッドサロゲートでは細胞密度が大幅に低くなっています。このグラフは、7日間の培養後における面積あたりの有核細胞数の平均の比較を示しています（灌流サロゲートおよびソリッドサロゲート）。これらの数値データは、H&amp;E染色切片の顕微鏡写真における細胞密度を裏付けるものです。このグラフは、灌流サロゲートとソリッドサロゲートを7日間育成した後の細胞増殖の指標であるKi-67ラベル指数を比較したものです。これらのデータは、灌流サロゲートにおいてより高い増殖が見られることを改めて裏付けています。この手順に続き、サロゲートの組織切片を用いてin situハイブリダイゼーションや免疫組織化学などの他の手法を行うことで、RNAやタンパク質の発現といった疑問を検証することが可能です。このビデオを視聴することで、3次元インビトロ組織代替物の調製および処理方法と、H&amp;E染色した組織切片の代替物解析の手法について十分に理解することができます。

preparation-analysis-vitro-three-dimensional-breast-carcinoma

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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の調製と分析

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