細胞外マトリックスを視覚化するために浸軟組織の電子顕微鏡をスキャンします

この方法の全体的な目標は、細胞やその他の非マトリックス材料がない場合の心臓マトリックスの構造を視覚化することです。この方法は、線維症の分野における重要な問題、特にマトリックスの含有量の違いがマトリックスの組織化にどのように影響するか、そしてこれらの変化がさまざまな心筋症や他の線維性疾患にどのように影響するかに答えることができます。この手法の主な利点は、定量的測定を補強するために使用できるマトリックスの定性的ビューを提供することです。

ガリンド博士とソーヤー博士は、梗塞後の豚の定期的な治療で、治療後のマトリックス含有量の変化と同様の遺伝子発現の変化があることを発見した後、この技術を使用するというアイデアを最初に思いつきました。この方法を初めて使用する人は、必要な細かい運動能力のために、以前にSEMサンプル調製の経験がない場合、苦労する可能性があります。組織サンプルは、見やすい大きさで、摂氏4度の4%グルタルアルデヒド溶液に保存する必要があります。

ティッシュを冷蔵保存から取り出し、蒸留水ですすいでください。次に、ペレットから新しく水に溶かした10%水酸化ナトリウムの溶液に組織を浸します。適切な予防策を講じてください。

組織を水酸化ナトリウム溶液に室温で6〜10日間保持します。ティッシュの色がオフホワイトまたはホワイトになったら進めてください。次に、ティッシュが透明になるまで蒸留水で洗い流します。

次に、手袋を着用し、室温で4時間、組織を1パーセントのタンニン酸に浸します。タンニン酸浴の後、組織を蒸留水で一晩洗い流します。準備として、手袋を着用したドラフトで、カコジル酸ナトリウム緩衝液の0.2モル原液と四酸化オスミウムの2パーセント水溶液を作ります。

四酸化オスミウムは深刻な吸入の危険性があるため、スプラッシュガードを使用してください。次に、カコジル酸ナトリウム緩衝液を0.1モル希釈し、その中の組織を穏やかに攪拌しながら5分間インキュベートします。緩衝液を2回交換して、カコジル酸ナトリウムで組織を合計3回洗浄します。

次に、ストックカコジル酸ナトリウムとストック四酸化オスミウムの1対1の混合物を作ります。新しい混合物中の組織をローテーターで1時間インキュベートします。その後、組織を0.1モルのカコジル酸ナトリウムに戻し、穏やかに攪拌しながら5分間インキュベートします。

このバス溶液を15分間で2回交換します。次に、濃度を上げた一連のエタノール浴を使用して組織を脱水します。ティッシュを各バスに15分間、穏やかに攪拌しながら

次に、組織と溶液を100%エタノールで満たされた浅いシャーレに移します。次に、注意して、2つの非常に鋭いかみそりの刃を、側面の平坦な部分が互いに接触するように保持し、刃先が交差して試験片の上の正三角形の2つの側面を形成します。次に、利き手を使って2枚目のブレードをサンプルの左端に置き、右にスライスします。

したがって、ブレードを反対方向から互いにスライドさせて、歪みや引き裂き力を最小限に抑えて単一の滑らかなカットを行います。目標は、試験片を傷つけることなく、できるだけ大きな表面積を露出させることです。SEMによる検査のために十分な満足のいく断面が準備されるまで、このプロセスを繰り返します。

へらまたはピンセットを使用して、組織を100%エタノールに浸したまま、組織をCPDのサンプルホルダーに移します。組織を数秒以上空気にさらすことはできません。CPDを使用してエタノールを液体二酸化炭素に置き換え、製造元の指示に従って乾燥サイクルを実行します。

次に、各試料のSEMサンプルスタブを準備します。アルミスタブの上面にカーボン粘着タブを接着します。ステレオスコープの下で、対象の断面表面を上に向けて、タブから離れ、スタブ表面と最大限に平面になるように、試料を接着タブに慎重に接着します。

対象の表面をプローブしたり、触れたりしないでください。最も小さく、最も難しい標本の場合は、木製のアプリケータースティックを壊してヘラとして使用します。また、落とした試料を紛失しないように、大きな濾紙で作業します。

密着性を向上させるには、壊れたアプリケータースティックを使用して先細りのブラシを作成し、試験片の基部と側面に銀またはカーボン塗料を塗布します。非常に細い塗料の線を、対象の表面の端まで伸ばします。これにより、対象地表から地面への電荷経路が作成されます。

次に、カーボンタブの周囲に2〜3本の小さな塗料を塗り、タブの表面から金属スタブへの導電性経路を提供します。これはグランドとして機能します。試料を脇に置き、導電性塗料を2時間乾燥させます。

乾燥したら、スパッタコーターを操作して、金パラジウム合金または金の比較的重いコートを試料に塗布します。30〜40ナノメートルの厚さのコーティングが望まれます。比較的低い加速電圧で走査型電子顕微鏡法を実施して、サンプル中の電荷散逸不良に関連する問題を最小限に抑えます。

可変圧力モードが利用可能な場合は、それを使用してください。まず、作動距離を改善して、Z次元のファイバーに焦点を合わせるのに十分な被写界深度を提供します。これを行うには、右上の[ナビゲーション]タブを開きます。

次に、ステージメニューから「座標」タブにアクセスします。その中に、Z 座標に大きい値 (20 ミリメートルなど) を入力します。最後に、[Go To]タブを押して変更を実行します。

次に、対象の表面を電子ビームに対して直角に配置します。マウスの右ボタンをクリックしたまま、左または右にスライドさせて、試料を目的の表面平面の周辺付近に焦点を合わせます。焦点を合わせた作動距離に注意してください。

次に、手動ユーザーインターフェイスのジョイスティックを使用して、ビューを反対側の端に移動し、フォーカス方法を繰り返します。作動距離が変化した場合は、試験片を傾けて、両方の位置で近似的な一致を達成します。ステージメニューの「座標」タブを使用して、T 座標にチルト値を入力します。

次に、この値をR座標フィールドに入力して、試験片を90度回転させます。次に、すべての位置がほぼ同じ作動距離に焦点を合わせるまで、傾斜プロセスを繰り返します。記載された技術は、未使用のヒト心臓移植ドナーからの心臓組織に適用されました。

ヒトの心臓マトリックスは、架橋タンパク質が複雑に絡み合って編み込まれており、断面にハニカム状のパターンがあります。各ハニカム構造の幅は約40ミクロンで、通常は単一の筋細胞を回避します。挿入された椎間板で接続すると、いくつかの心筋細胞がトンネルのような形状を縦に走るロッドとして想像できます。

脱細胞化組織のSEMは、構造情報を提供するだけでなく、ブタの梗塞性心筋組織などの損傷や非有害な形態の心筋症に反応して、有意義な定性的評価を可能にします。別の研究では、NRG-1ベータのGGF2アイソフォームが心不全の治療薬となる可能性があることが示されました。このビデオを見れば、走査型電子顕微鏡の組織、心臓組織をどのように処理するか、例えば、対象表面を露出させる技術や標本をマウントする技術などについて理解できるはずです。

この手順に続いて、質量分析、RNAシーケンシング、およびその他のさまざまなアッセイなどの他の手法を使用して、細胞外マトリックスタンパク質やその他のシグナル伝達やその他の組織観察現象の原因を測定することができます。また、四酸化オスミウムは、粘膜の蒸気固定の可能性があるため、危険な化学物質であることを忘れないでください。ニトリル手袋をはめ、スプラッシュガードまたはフードサッシを使用して、ヒュームフードで作業することを常に忘れないでください。