Name: 細胞外マトリックスを視覚化するために浸軟組織の電子顕微鏡をスキャンします (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 学ぶ 走査型電子顕微鏡を用いて脱細胞化心臓組織の細胞外マトリックス構造を可視化する方法。線維症や心筋症におけるマトリックス組織化の理解に貢献し、定性的な洞察で定量的データを補完します。

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この研究は、国立衛生研究所(NIH)、心臓・肺・血液研究所(NIHLB)からの助成金によって資金提供されました：K01-HL-121045、K08-HL-094703、5T32HL007411-35、P20 HL101425、U01 HL100398。 
イメージングと組織処理(NaOH浸軟後)は、ヴァンダービルト大学医療センター（VUMC)のCell Imaging Shared Resource（CISR）（NIH助成金CA68485、DK20593、DK58404、DK59637、EY08126）の支援を受けて)を使用して行われました。特に、VUMC CISRのコアディレクターであるSam Wells博士とW. Gray (Jay) Jerome博士には、貴重な技術的アドバイスを提供し、この論文で強調した技術を撮影するためのコアスペースとリソースを提供していただいたことに感謝しています。 
ヴァンダービルト大学のトランスレーショナルおよび臨床研究のための心臓病学コアラボのヤン・ル・ス博士とケルシー・トマセック氏に、技術的な専門知識を提供し、この研究で使用されたヒト組織サンプルを収集してくださったことに深く感謝したいと思います。

倫理文：動物取扱プロトコルはヴァンダービルト施設内動物管理使用委員会（IACUCによって承認されたが数M / 117分の10（豚）とM / 219分の10（マウス）プロトコルとAAALACインターナショナルの基準に従って行いました。バンクヒト心筋組織の使用法は、ヴァンダービルト大学医療センターIRB（プロトコル番号100887）によって承認されました。 1.サンプルの収集と保管<ol><li> 0.1Mリン酸緩衝液（PB）溶液中の新鮮な4％グルタルアルデヒドを行います。 注意：グルタルアルデヒドは毒性があり、ヒュームフード内で手袋や作業を着用してください。 <ol><li>千ミリリットルのdH 2 Oに21.8グラムの Na 2 HPO 4および6.4グラムののNaH 2 PO 4。 量子サティス （適量）を使用して、PB、pH7.4の0.2Mの原液を作ります</li><li> PBストック溶液の2.5ミリリットルと2.1ミリリットルのdH 2 Oに50％グルタルアルデヒドの400μLを追加</li></ol></li><li> 2 cより（も大きくチャンクを浸していません4％グルタルアルデヒド溶液中に組織のM 2）。注：より小さな断片も使用することができるが、簡単にプロトコルの後工程を容易にするために、眼によって視覚化されるのに十分なサイズ（無5mm未満2）であるべきです。 </li><li> 4℃で無期限に保存した後、1時間室温でインキュベートします。 </li></ol>心臓組織の脱細胞化2。 <ol><li> 10gのNaOHペレット/ 100mlでのdH 2 Oを用いて新鮮な10％NaOH水溶液を加えます 注意：NaOHのソリューションは、腐食性であり、アルカリ火傷を引き起こす可能性があり、手袋を着用してください。 </li><li> dH 2 Oに組織をすすぎます</li><li> （オフホワイトや白に赤茶色から組織変化まで）10日 - 6のために室温で10％NaOH溶液中でインキュベートします。 </li><li>組織が ​​透明になるまでの dH 2 Oですすいでください。 </li><li>室温で4時間、1％タンニン酸で組織を浸し。 4ミリリットルのdH 2 Oあたり1ミリリットル5％原液を使用して 注意：タンニン酸強い刺激で、手袋を着用してください。 </li><li>一晩のdH 2 Oですすいでください。 </li></ol> 3.オスミウム酸染色法と（安全のためのドラフトチャンバー内）心臓組織の脱水<ol><li> 21.4グラムのカコジル酸ナトリウム、10.0グラムの塩化カルシウムと450ミリリットルのdH 2 Oを使用してカコジル酸ナトリウム緩衝液の0.2Mの原液を作りますpHを7.4に調整するために必要な混合物は、その後、塩酸を加える。Qsを500 mlまでのdH 2 Oで 注意：ナトリウムカコジル酸および塩酸がヒュームフードに手袋や作業を着用し、有毒です。 </li><li> 50ミリリットルのdH 2 O中に1グラム四酸化オスミウム結晶を溶解することにより、安全性のためのヒュームフード内で四酸化オスミウムの2％水性原液を作ります 注意：四酸化オスミウムが厳しい吸入の危険性です。粘膜や眼球の蒸気固定が可能であり、それゆえにのみ手袋とドラフト内で取り扱います。スプラッシュガードをお勧めします。 </li><li> dHで1：（原液1を混ぜ、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中で組織をすすぎます<su回転子（または穏やかな撹拌に5分間、B&gt; 2 O））。 </li><li> 3バッファリンス、合計二回前の手順を繰り返します。 </li><li>回転子に1時間：（1株カコジル酸ナトリウムおよび株式四酸化オスミウム1を混ぜる）、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中の1％四酸化オスミウムで組織を浸し。 </li><li> 0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中で回転体上で5分間、3回組織をすすぎます。 </li><li>ローテーター上で15分ごとに、エタノールの増加濃度（30％、50％、75％、85％、95％、および最終的に100％）を用いて組織をすすぎます。 </li></ol> SEM 4.断面表面の準備<ol><li>また、100％のエタノールを含む浅いペトリ皿に100％エタノール中に組織を移します。 </li><li>両側の平坦部が互いに接触していると、切刃が試料上等辺三角形の二辺を形成するように交差するように2つの非常に鋭利なカミソリ刃を保持します。これを達成するために、試料の右端側つのブレードを配置するために左手を使用してカットが左方向。同時に、これまでのサンプルとスライス右方向の左側の2番目のブレードを配置するために右手を使用しています。このように、ブレードは、単一の滑らかなカットを作るために、反対方向から互いに対してスライドさせることになります。 </li><li>好ましくは、試料を損傷することなく、可能な限り大きな表面積を露出し、最小限の歪みや引き裂く力で試料の非常にきれいにカットを作るためにお互いに対してフラットブレード側面をスライドさせます。 </li><li> SEMでの検査のために可能な限りクリーンな断面の表面を露出するために、各試験片について、この手順を繰り返します。 </li></ol>心臓組織の5臨界点乾燥（CPD） <ol><li>組織は常に100％エタノールに残っていることを確認して、臨界点乾燥機（CPD）のサンプルホルダーに組織を転送するためにへらやピンセットを使用してください。ホルダーをエタノールに浸漬し、転送は数秒を超えない空気に露出した組織で達成されていることをされていることを確認してください。 </li><li>私たち当たりのCPDを操作液体二酸化炭素とエタノールを置き換えるために3パージ・アンド・フィルサイクルを完了するために、小胞体のマニュアル。 </li><li>サンプルの臨界点乾燥を達成し、CO 2の制御されたガス抜きで大気圧に戻すことユーザーズマニュアル当たりのCPDを操作します。 </li></ol> SEMのための心臓組織標本の6取付<ol><li>アルミスタブの上面にカーボン接着剤タブを付着させることにより、各検体のためのSEMの試料スタブを準備します。 </li><li>実体顕微鏡の助けを借りて、慎重に関心の断面表面が（離れてタブから、目に見える）上に向けて接着剤タブに試料を付着し、サンプルのスタブ表面の平面に平行にできるだけ近いです。プローブまたは関心の表面に触れないでください。 </li><li>ペイントアプリケーションのための理想的な、テーパー状のブラシを達成するために木製のアプリケータースティックを破ります。スタブへの密着性を向上させるために、ベースと試料の側面に銀やカーボン塗料を適用します。 </li><li>地面に目的物の表面からの電荷の経路を提供するために、関心の表面の端部に銀やカーボンペイントまでの非常に細い線を拡張します。 </li><li>地面にこのように金属スタブの炭素タブ表面から導電性経路を提供するために、炭素タブの周囲に銀やカーボン塗料の2または3小さな描点を適用し、。 </li><li>導電性塗料は2時間乾燥することができます。 </li><li>金 - パラジウム合金または金の - 比較的重いコーティング（40〜30nm程度の目標範囲）を適用するユーザのマニュアルあたりのスパッタコーターを操作します。約0.1ミリバールに試料室ポンプ。 40秒にタイマーを設定します。 8時位置（中程度のアルゴンガス流量）にオープンセットバルブ。 Startを押し30mAでスパッタコーティングを開始します。パープルグロー放電は、試料室に表示されるはずです。 </li></ol>ハートの組織標本の7 SEM検査<ol><li>イメージングpを最小にするために比較的低加速電圧での走査型電子顕微鏡を行いますサンプル（充電）に乏しい電荷散逸に関連したroblems。推奨初期撮像条件である：加速電圧が5kV、10ミリメートル作動距離。 </li><li>経験豊富なオペレータの支援を受けて、採用は、z次元でかなりの長さのために延びた複数の焦点面における繊維、または繊維のフォーカスを必要とする撮影条件で被写界深度を拡張するために作動距離の増加しました。 <ol><li>ここで使用される顕微鏡のためのユーザインタフェースへのアクセスで、右上の[ナビゲーション]タブを（ 材料の表を参照してください）。 </li><li>ステージ]メニューから[座標]タブにアクセスします。 、作動距離を増加させるZ座標のためのミリメートルで、より大きな値を入力するには、次に入力された作動距離に試料ステージを移動するタブに移動をクリックします。 </li></ol></li><li>経験豊富なオペレータの支援を受けて、電子ビームに関心直交の表面を配置するために、試料の傾きや回転を採用しています。 10〜30 DEGRの追加の傾きEESこの位置からマトリクス構造の観察やドキュメントを改善することができます。 <ol><li>フォーカスされた作動距離に注意して、ここで使用される顕微鏡のために、（ 材料の表を参照）ユーザーインターフェイスで、関心の調製された表面面の外周付近の標本を集中するために、その後、左または右にスライドをクリックし、マウスの右ボタンを押したまま。 </li><li>表面の反対側の端部付近に移動し、フォーカスを繰り返すマニュアルユーザーインターフェースのジョイスティックで移動します。作動距離が第一の位置にほぼ等しくない場合には、傾斜試料を（7.2を参照）、Tにおける傾き値が座標入力ステージメニューの座標タブを使用して、両方の場所に近似合意を達成します。 </li><li>試料を90度回転（フィールド座標Rに値を入力します）と、すべての位置はほぼ同じ作動距離に集束されるまで、プロセスを繰り返します。 注：可変圧力SEMは、電荷散逸を改善するために使用することができます可能な場合は。高真空走査電子顕微鏡のための標準的な動作モードです。 </li></ol></li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

クロスセクションの表面調製は、プロトコル中に最も重要なステップです。臨界点乾燥工程に導入されるまで、微細構造を維持するために、脱水標本はすべての回で100％エタノールのままでなければなりません。標本は浅い皿にエタノールに浸されている間そこでEM検査のための表面を達成するための検体のスライスを行わなければなりません。露出面に触れたり、その後の取り扱い中にプローブされていないことも重要です。プロトコルのSEM部は関係なく、サンプル起源の基本的な電子顕微鏡のトラブルシューティングが必要な場合がありますが、重大な修正は、同様の行列観測のための他の組織タイプへのこの技術の適用のために予想されていません。繊維状のサンプルから収集した画像は、貧しい電荷散逸（「充電」）によって導入されたアーティファクトを起こしやすいです。充電の問題は、通常、走査速度を増加させる、加速電圧（別名滞留時間を減少させることによって最小化することができます）電子ビームのスポットサイズを小さくします。いくつかのスキャンの統合が遅くなり、より高品質な単一のスキャン画像内に存在する電荷アーティファクトなしでノイズの品質に匹敵する信号の画像を生成するチャージアーチファクトを回避するの...

線維症は正常な心筋コラーゲンネットワークを破壊し、これは心筋細胞1,2の正常な機構機能だけでなく、細胞間コミュニケーション、細胞内シグナル伝達、および細胞生存3にとって重要です。線維症の発症は心機能の主要な決定要因であり、さまざまな病因から生じる心臓間質の線維化リモデリングは、左心室硬化の増加と拡張期機能障害につながります4。心筋線維症も不整脈を引き起こす可能性があり、線維性リモデリングの進行が一般的な現象であるか局所的な現象であるかにかかわらず、虚血性および非虚血性心筋症の患者の予後不良と非常に関連しています5。同様に、心筋線維症の欠如は、心室機能の回復と長期生存の強力な予測因子です6。
線維症の特徴は、過剰なコラーゲンの沈着であり、これは鋼鉄7の引張強度を持ち、複数のレベルで心筋細胞の機能に悪影響を与える可能性があります。過度にコラーゲン性マトリックスに起因する機械的な力は、心筋細胞の萎縮8,9、受動的な組織こわばり10、強直性収縮誘発性心筋こわばり11-13、および心筋細胞の残りの集団への酸素供給の減少につながる可能性があります。心筋細胞とmyoFbsのギャップ結合結合も心臓の電気的特性を損なう可能性があり、不整脈の発症リスクが高くなります14-16。血管周囲線維症は、壁内冠状動脈および細動脈の血管運動反応性を変化させ17、酸素の供給を減少させる管腔狭窄に寄与し、したがって心筋細胞17-22の生存を減少させる。虚血性損傷またはエネルギーの不均衡の最初の部位から発せられる病原性線維性および電気的リモデリングは、必然的に心不全に進行します。
心筋細胞の壊死は線維性反応を開始し、その後の有害な線維性リモデリングは病因に関係なく発生する可能性があります。心筋線維症を制御する方法を見つけることは、虚血性および特発性心筋症、高血圧性心疾患、肥大型心筋症、弁膜性心疾患、およびジストロフィノパチーの治療に臨床的に有益です23-42。線維性疾患のプロセスがどのように始まるかにかかわらず、可溶性の線維化促進因子が間質性空間を横切り、最初の線維性瘢痕から離れた部位で間質性および外形性線維芽細胞の活性化を引き起こし、最終的に心不全につながるカスケード効果を生み出す可能性があります。最適なシナリオは、収縮期ポンプ不全、拡張期心不全、またはその他の末期の結果に進行する前に、心筋症の代償性肥大型段階で適用できる標的治療薬を使用して、線維原性プロセスを利用することです。最終的な目標は、線維化を逆転させ、死んだ心筋細胞を置き換え、心機能を完全に回復させることです。
マトリックスの重要性は広く理解されていますが、マトリックスを研究する方法は主に主要な構造成分、特にコラーゲンの定量的測定、および異なるマトリックスおよび母細胞タンパク質の相対的なレベルに限られています。このプロトコルは、心臓マトリックスの質的な違いを評価するのに役立つ、めったに使用されない手法を強調しています。この技術は最近、心臓病のさまざまな病因(ヒト外植片)からの心臓マトリックスの基本的な違いを比較対照するために使用され、ニューレグリン-1βのグリア成長因子(GGF)アイソフォームで治療された梗塞後ブタの心臓を未治療の動物と比較して調べ、mdxからの心臓組織のマトリックスの違いを調査するために使用されていますマウス(デュシェンヌ型筋ジストロフィーの一般的に使用される動物モデル)をさまざまな年齢で、野生型の対照と比較しました。この技術は、1979年にコールフィールド博士とボルグ博士によって初めて導入されましたが、それ以来、この強力な技術を採用した研究はほとんどありません45-47、ここでわずかな変更を加えて再導入しました。この方法論は、単にマトリックス成分含有量や線維症のレベルを測定するだけでは見落とされがちな細胞外マトリックスの超微細構造に関する定性的な情報を提供するため、貴重な研究ツールです。

<table><tbody><tr><td>塩化カルシウム</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>12340</td><td>100 g</td></tr><tr><td>炭素接着</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>12664</td><td>30 g</td></tr><tr><td>炭素接着タブ</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>77825</td><td>スタブに合うように注文</td></tr><tr><td>ダブルエッジ カミソリの刃 ステンレス鋼</td><td>テッド・ペラ社</td><td>121-6</td><td>250/pkg</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>電子Microscopy Sciences</td><td>15055</td><td>450 ml</td></tr><tr><td>Gluteraldehyde, 50% Solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16310</td><td>EM grade, distillation purified</td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16760 or 16770</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Monosodium Phosphate NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9251-250G</td><td>250 g</td></tr><tr><td>オスミウム四酸化電子</td><td>顕微鏡科学</td><td>19100</td><td>1 g</td></tr><tr><td>銀導電性接着剤</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>12686-15</td><td>15 g</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-1KG</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>リン酸二塩基性ナトリウム (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264-500G</td><td>500g</td></tr><tr><td>タンニン酸、5%水性&nbsp;</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>21702-5</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>三水和物カコジル酸ナトリウム</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>12300</td><td>100 g</td></tr><tr><td>金パラジウム合金または金</td><td>精製システム株式会社&nbsp;</td><td></td><td>スパッタコーターのメーカーとモデルによって異なります</td></tr><tr><td>臨界点乾燥機</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>850</td><td></td></tr><tr><td>プレーン木製アプリケーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>23-400-102</td><td></td></tr><tr><td>クォンタ 250 環境SEM</td><td>FEI</td><td>Q250 SEM</td><td></td></tr><tr><td>スパッタコーター</td><td>クレッシントンサイエンティフィックインスツルメンツ株式会社</td><td>モデル108</td><td></td></tr><tr><td>アルミSEMのサンプルスタブ電子</td><td>顕微鏡科学</td><td>75220-12</td><td>ミスクロスコープに特有</td></tr></tbody></table>

細胞外マトリックスを視覚化するために浸軟組織の電子顕微鏡をスキャンします

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

線維症は、病因に関係なく、あらゆる形態の心臓病の構成要素であり、心臓マトリックス生物学の分野では多くの進歩が見られましたが、マトリックスがどのように形成されるか、生理学的および病理学的リモデリングがどのように異なるか、そして最も重要なこととして、マトリックスダイナミクスがどのように治癒を促進し、線維症を阻害するかについては、まだ大きなギャップがあります。現在、心線維症を制御、予防、または逆転させるための治療選択肢はありません。その理由の一部は、心筋梗塞後に起こるような、死んだ心筋細胞や死にかけている心筋細胞にすぐに取って代わる心臓瘢痕形成の複雑さにあると思われます。細胞外マトリックス自体は、常在細胞を活性化し、浸潤した細胞を機能不全の病変に導くのを助けることにより、リモデリングに関与します。このマトリックスは、正常なマトリックスの代謝回転や線維性シグナル伝達に重要な母系細胞タンパク質の保管ロッカーのようなものでもあります。さらに、このマトリックスは、心臓組織において電気機械的な役割を果たすことが実証されています。線維症を評価するためのほとんどの手法は、本質的に定性的ではなく、2つのグループを比較するのに役立つ定量的な結果を提供しますが、基礎となるマトリックス構造に関連する情報は提供しません。ここで強調されているのは、心臓マトリックスの超微細構造を視覚化する手法です。脱細胞化した心臓組織の走査型電子顕微鏡法は、従来の定量的研究方法では見落とされがちな構造の顕著な違いを明らかにします。

強調表示された技術は、ブタから未使用のヒト心臓移植ドナーからの心臓組織（ 図1）は 、移植レシピエントからの外植組織を、野生型およびジストロフィーマウスの心臓（ 図3）に、および心筋梗塞後の心臓サンプルにおいて適用されました心臓傷害のモデル（ 図2）。 図1に示すように 、人間の心臓のマトリックスは、断面で見たときに、ハニカム状のパターンを表示する架橋されたタンパク質の複雑な織り方です。 図1の平面図を検討する際に各「ハニカム」構造は、通常、単一の筋細胞を回避し、約40μmの幅である。介在板で接続されたときに、いくつかの心筋細胞はメタファー「トンネル」を通って縦方向に実行されているロッドとして想定することができます三次元に拡張される。また、1ハイライト図切断工程（ 図1、...

ここに示されているのは、脱細胞化した心臓組織の細胞外マトリックスの超微細構造を視覚化する方法です。

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

この手法の全体的な目的は、細胞やその他の非マトリックス物質を除去した状態で、心臓マトリックスの構造を可視化することです。この手法は、線維化の分野における重要な疑問、特にマトリックス含有量の違いがマトリックスの組織化にどのように影響するか、また、これらの変化がさまざまな心筋症やその他の線維性疾患にどのように影響するかという点に答えることができます。この手法の主な利点は、定量的測定を補完するために利用可能な、マトリックスの定性的な視覚情報を提供できることです。Galindo博士とSawyer博士は、心筋梗塞後の豚に対する定期的な治療によって、治療後のマトリックス含有量の変化と同様の遺伝子発現の変化が認められることを発見し、本手法を用いる着想を得ました。この手法に不慣れな方は、必要とされる微細な運動技能のため、SEMサンプルの調製経験がない場合は苦労する可能性があります。組織サンプルは容易に視認できる十分な大きさである必要があり、4%グルタルアルデヒド溶液中で4°Cで保存してください。組織を冷暗所から取り出し、蒸留水で洗浄します。次に、ペレットを用いて水で調製した新鮮な10%水酸化ナトリウム溶液に組織を浸します。適切な予防措置を必ず講じてください。組織を水酸化ナトリウム溶液に入れ、室温で6～10日間保持します。組織の色がオフホワイトまたは白になったら、次の工程に進みます。その後、組織が透明になるまで蒸留水で洗浄します。次に、手袋を着用し、組織を1%タンニン酸に室温で4時間浸します。タンニン酸浴の後、組織を蒸留水で一晩洗浄します。準備として、ドラフト内で手袋を着用し、0.2 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液ストック溶液と2%四酸化オスミウム水溶液ストック溶液を作成します。四酸化オスミウムは吸入すると極めて危険なため、飛散防止ガードを使用してください。次に、カコジル酸ナトリウム緩衝液を0.1 Mに希釈し、組織をその中に浸し、緩やかに撹拌しながら5分間インキュベートします。緩衝液を2回交換し、カコジル酸ナトリウムで組織を計3回洗浄します。次に、ナトリウムカコジレートストック溶液と四酸化オスミウムストック溶液を等量混合します。組織をこの新しい混合液に入れ、ローテーターを用いて1時間インキュベートします。その後、組織を0.1 molar ナトリウムカコジレートに戻し、緩やかに撹拌しながら5分間インキュベートします。このバス溶液を15分間で2回交換します。その後、濃度の異なる一連のエタノールバスを用いて組織を脱水します。各バスで緩やかに撹拌しながら、組織を15分間浸漬させてください。次に、組織と溶液を100%エタノールを満たした浅いペトリ皿に移します。続いて、注意深く、2枚の非常に鋭利なカミソリの平らな面を互いに接触させ、切断刃が標本の上で正三角形の2辺を形成するように保持します。そして、利き手を用いて2枚目の刃をサンプルの左端に置き、右方向へ切り出します。したがって、刃を互いに反対方向から滑らせるようにして、歪みや引き裂き力を最小限に抑えながら、一度に滑らかに切断します。目的は、試料を損傷させることなく、可能な限り広い表面積を露出させることです。SEMによる観察に十分な数の良好な断面標本が作製されるまで、この工程を繰り返します。スパチュラまたはピンセットを使用して、組織を100%エタノールに浸したままCPDのサンプルホルダーに移します。組織を空気にさらす時間は数秒以内にしてください。CPDを用いてエタノールを液体二酸化炭素に置換し、製造元の指示に従って乾燥サイクルを行います。次に、各試料用にSEMサンプルスタブを準備します。アルミニウムスタブの上面にカーボン粘着タブを貼り付けます。実体顕微鏡下で、関心のある断面表面が上向き（タブとは反対側）になり、かつスタブ表面に対して最大限に平面となるように、試料を粘着タブに慎重に貼り付けます。関心のある表面をプローブで触れたり、直接触れたりしないでください。非常に小さく、取り扱いが困難な検体については、木製塗布棒を折ってスパチュラとして使用してください。また、検体を落とした際の紛失を防ぐため、大きなフィルターペーパーの上で作業を行ってください。密着性を向上させるため、折ったアプリケータースティックで先細りのブラシを作り、試料の底部と側面に銀またはカーボンペイントを塗布します。関心領域の表面の端まで、ペイントで非常に細い線を描きます。これにより、関心領域の表面から接地端までの電荷経路が形成されます。次に、カーボンタブの周囲に導電性塗料を2〜3箇所少量塗り、タブ表面からメタルスタブまでの導電路を確保します。これが接地（グランド）として機能します。試料をそのまま置き、導電性塗料を2時間乾燥させます。乾燥後、スパッタコーターを用いて、試料に金パラジウム合金または金を比較的厚くコーティングします。コーティングの厚さは30から40 nanometerが適切です。試料の電荷散逸不良に伴う問題を最小限に抑えるため、走査電子顕微鏡観察は比較的低い加速電圧で行ってください。可変圧力モードが利用可能な場合は、それを使用してください。まず、Z方向のファイバーに焦点を合わせるのに十分な被写界深度を確保するため、作動距離を調整します。調整するには、右上のナビゲーションタブを開いてください。次に、ステージメニューからCoordinatesタブにアクセスします。そこで、Z座標に20ミリメートルなどのより大きな値を入力します。最後に、Go Toタブを押して変更を実行します。次に、関心領域の表面を電子ビームに対して直交するように配置します。マウスの右ボタンを長押しし、左右にスライドさせて、準備した関心平面の周辺部付近で試料にフォーカスを合わせます。このとき、フォーカスが合った作動距離を記録してください。次に、手動ユーザーインターフェースのジョイスティックを使用して、視点を反対側の端に移動させ、同様にフォーカス調整を行います。作動距離が変化している場合は、試料を傾けて、両方の位置でほぼ一致するように調整してください。ステージメニューの「Coordinates」タブを使用し、T座標に傾斜値を入力します。次に、R座標フィールドにこの値を入力し、試料を90度回転させます。その後、すべての位置がほぼ同じ作動距離でピントが合うまで、傾斜操作を繰り返します。この手法は、未使用のヒト心臓移植ドナーから得られた心臓組織に適用されました。ヒト心臓のマトリックスは、架橋されたタンパク質の複雑な網目構造であり、横断面ではハニカム状のパターンを示します。個々のハニカム構造の幅は約 40 microns で、通常、単一の心筋細胞を囲んでいます。介在板によって連結された複数の心筋細胞は、トンネル状の形状の中を縦方向に走る棒状の構造として捉えることができます。走査電子顕微鏡（SEM）による脱細胞化組織の観察は、構造情報の提供に加えて、ブタの梗塞心筋組織などの損傷または非損傷性の心筋症に対する有意義な定性的評価を可能にします。別の研究では、NRG-1 betaのGGF2アイソフォームが心不全の潜在的な治療法となることが示されました。このビデオを視聴することで、関心領域の表面を露出させる手法や試料の固定方法を含め、走査電子顕微鏡用に心臓組織などの組織を処理する方法について十分に理解できるはずです。この手順の後、細胞外マトリックスタンパク質や、シグナル伝達およびその他の組織的な観察現象に関与するその他の因子を測定するために、質量分析、RNAシーケンシング、およびその他のさまざまなアッセイなどの手法を用いることができます。また、四酸化オスミウムは、蒸気による粘膜への固定のリスクがある危険な化学物質であることに注意してください。必ずニトリル手袋を着用し、飛沫防止ガードまたはフードサッシを使用して、ドラフトチャンバー内で作業してください。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々はinvadopodia媒介マトリックス分解を可視化するための蛍光ゼラチンでコーティングされた顕微鏡のカバーガラスを製造するためのプロトタイプ的な方法を説明します。利用可能なソフトウェアを使用した計算手法は混合集団内および全体の顕微鏡視野を取り囲む多のグループに、単一細胞によるマトリックス分解の結果のレベルを定量化するために表示されている。...

シングルおよび多細胞コンテキストでInvadopodia媒介細胞外マトリックスタンパク分解の定量測定

細胞外マトリックスは、創傷治癒、炎症や腫瘍形成の間に、実質的なリモデリングを受ける。我々は、線維性のダイナミクスならびにエピ蛍光または二光子顕微鏡を用いて、高い空間分解能と時間分解能を有する網目状のマトリックス成分を可視化する新規な生体免疫蛍光顕微鏡法を提示する。...

落射蛍光による組織マトリックスのコンポーネントと二光子顕微鏡の長期生体内免疫蛍光イメージング

このプロトコルは、組織や腫瘍からECMタンパク質を濃縮し、ECM濃縮調製物を脱グリコシル化してペプチドに消化し、質量分析によってそれらのタンパク質組成を分析する手順を説明しています。...

質量分析のためのペプチドに組織および消化から細胞外マトリックスタンパク質の濃縮

我々は、高分子crowders（MMC）を使用して、細胞外マトリックスタンパク質に富む細胞由来のマトリックスを得るためのプロトコルを提示します。また、我々は、コンストラクトの成熟度を維持しながら、培養時間を減少させる3D器官型皮膚共培養世代でMMCを組み込むプロトコルを提示します。...

2Dと3Dの肌の改善<em&gt;インビトロ</em分子クラウディングの使用&gt;モデル

細胞外マトリックスは、細胞の微小環境を定義し、細胞の挙動と表現型を調節する上で主要な役割を果たします。細胞由来の細胞外マトリックスを迅速に単離する方法について説明し、顕微鏡、生化学的、プロテオミクス、または機能的な研究のさまざまなスケールに適応できます。...

細胞由来の細胞外マトリックスの急速な、単離、機能性研究のためのスケーラブルな方法、および分析

マクロファージ細胞外トラップは、新しく記述されたエンティティです。この資料に共焦点の顕微鏡検査方法に集中して体外と体内の肺検体から可視化方法します。...

共焦点顕微鏡を用いた可視化マクロファージ細胞外トラップ

このプロトコルの目的は傷の修復のために目標として再生足場インプラントの臨床評価のために適している全体細胞外マトリックス繊維の生産。これらの繊維は中空糸膜の線維芽細胞の培養による生産、膜の分解によって抽出されました。...

いけにえの中空糸膜細胞培養による細胞外マトリックス繊維の生産

細胞外マトリックスヒドロゲルを用いた正常組織放射線効果の研究

配列断層撮影サンプルとして使用するための大きな転写サポートに関するシリアルセクションのリボンの作成と、走査型電子顕微鏡での自動イメージング手順について説明します。このプロトコルにより、局所的なまれな事象のスクリーニング、検索、および標的画像処理、および大量のデータ量の取得が可能になります。...

走査型電子顕微鏡を用いたボリューム情報の標的取得のためのアレイ断層化ワークフロー

本プロトコルは、肝臓 のin situ...

非アルコール性脂肪性肝炎モデルマウスにおける肝臓細胞外マトリックスの3Dイメージング

骨再生をさまざまな階層レベルで評価するためのプロトコルを提案します。このマルチモーダル手法により、異なる長さスケールでの構造解析が可能となり、試料準備の課題に効果的に対処できます。また、骨再生促進におけるバイオマテリアルの効果を評価する信頼性の高いワークフローも提供しています。...

骨再生と足場性能を評価するマルチモーダルアプローチ

学ぶ 走査型電子顕微鏡を用いて脱細胞化心臓組織の細胞外マトリックス構造を可視化する方法。線維症や心筋症におけるマトリックス組織化の理解に貢献し、定性的な洞察で定量的データを補完します。

細胞外マトリックスを視覚化するために浸軟組織の電子顕微鏡をスキャンします

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