脱細胞肺足場を使用してESC由来のマウス気道上皮細胞の生成

この手順の全体的な目的は、脱細胞化肺スキャフォールドを用いた3D培養系を用いて、マウス胚性幹細胞を成熟した気道上皮細胞へと分化誘導することです。この手法は、肺の系統分化における細胞マトリックスの収縮や成長因子のシグナル伝達の役割など、肺発生領域における重要な疑問への回答に寄与します。本技術の主な利点は、定義された無血清条件下で3D培養システムを使用し、他の内胚葉系統からの混入を抑えつつ、堅牢な気道上皮分化を達成できる点にあります。テキストプロトコルに従って成体Wistarラットを安楽死させた後、前肢と後肢を固定して動物を解剖台に固定し、70% ethanolを胸部と腹部にスプレーします。肋骨縁の直下に切開を加えます。皮膚を切開し、横隔膜を露出させます。次に、横隔膜に小さな切開を入れて肺を後退させ、肺を穿刺する可能性を低減します。次に、胸骨に沿って垂直に切開を加え、胸腔を開いて心臓と肺にアクセスします。その後、縫合糸で下大静脈を結紮し、小型の解剖用ハサミを使用して左心房に小さな切開を加えます。ヘパリン化したHank's Balance salt solutionを満たした25ゲージ針付きの10mlシリンジを用い、針を右心室に挿入して肺灌流を開始し、緩衝液を肺循環に押し込みます。肺が白くなり、左心房から流出する液が透明になるまで灌流を続けます。灌流後、気管を露出し、挿管のために甲状軟骨付近に小さな切開を加えます。次に、プラスチックカテーテルで気管に挿管し、縫合糸で固定します。ここで、10mlシリンジをレトルトスタンドとクランプに固定して、重力灌流システムを構築します。その後、シリンジのプランジャーを取り外して廃棄します。シリンジシリンダーの最大充填点を肺の20 cm上に固定し、シリンジの端に2方活栓を、活栓のもう一方の端に長いプラスチックチューブを取り付けます。気管からカテーテルをゆっくりと引き抜き、プラスチックチューブの端に取り付けます。次に、脱細胞化溶液をシリンジに注ぎ、接続されたプラスチックチューブとカテーテルを溶液で完全に満たします。溶液で満たされたカテーテルを気管に戻し、全肺気量まで満たして1分間肺を洗浄（ lavage）します。その後、カテーテルを気管から抜き、液体が肺から流出するようにします。脱細胞化溶液による肺の洗浄を8回繰り返し、続いてPBSで10回すすぎます。洗浄ステップが完了すると、肺は白く見えます。その後、頸部と胸腔から気管と肺を摘出します。食道や心臓を含む摘出肺から余分な組織を取り除き、ビブラトームによる切片作成まで肺を冷PBSに保存します。厚切片を準備するために、PBSを用いて2%および4%の低融点アガロースを約15ml作成し、また、すべての葉を小さな長方形のブロックに包埋するのに十分な量の6%アガロースを作成します。アガロースを15mlチューブに移した後、チューブをヒートブロックに置き、ゲル化を防ぐために温度を40 degrees celsius以上に維持します。小型のハサミを用いて、各葉気管支の末端で脱細胞化肺を切断し、各葉を分離します。次に、吸収シートで余分なPBSを取り除き、葉をヒートブロック上の2%アガロースに移して5分間組織をコーティングします。各葉をペトリ皿に移した後、皿をコールドプレートに置き、表面を1分間ゲル化させます。葉を4%アガロースにそっと配置し、5分間インキュベートして冷却した後、6%アガロースで再度コーティングします。コーティング後、金属ベースの型を用いて各葉を個別に6%アガロースに包埋し、組織の端から少なくとも3mlのアガロースで周囲を囲みます。次に、ピンセットを用いて、組織の最も広い平坦な面が実験者側を向くように金属型の表面に配置して各葉の向きを整え、プラスチックカセットを用いて包埋を完了させます。ビブラトームで切片を作成する前に、コールドプレート上でブロックを少なくとも30分間ゲル化させます。あるいは、ビブラトームによる切片作成まで、加湿チャンバー内で4 degrees celsiusで最大12時間ブロックを保存します。切片を準備するために、切断チャンバーを冷PBSで満たしてビブラトームをセットアップします。切断中、低温を維持するために周囲に氷浴を設置します。ここで、金属型からブロックを取り出し、カミソリを用いて、組織の端から約3 millimetresを残して葉の周囲の余分なアガロースを削り取ります。接着剤を用いて組織を標本プレートの中央に固定し、プレートをPBSで満たした切断チャンバーに浸します。ビブラトームに切断用ブレードを装着します。ビブラトームの切断境界を設定し、速度、振幅、厚さの値をそれぞれ選択します。各葉を完全に切断し、切片が完全に分離しない場合は、小型のハサミを用いて手動で切片を切り離します。その後、スキャフォールド切片を慎重に回収し、冷PBSに移します。ピンセットを用いて、周囲のアガロースから各切片を慎重に分離します。スキャフォールド切片を除染するために、PBSからマイクロ遠心チューブに移した後、PBSに溶かした90 units per milliliterのヌクレアーゼを加え、回転させながら室温で12〜24時間インキュベートします。切片を新しいマイクロ遠心チューブに移した後、テキストプロトコルに従い、無菌条件下で抗菌溶液を加え、回転させながら室温で6時間インキュベートします。その後、無菌条件下でPBSを用いてスキャフォールドを2回すすぎ、細胞を播種する前に無血清培地（SFDM）に移します。気液界面（air liquid interface）培養を構築するために、滅菌ピンセットを用いて疎水性メンブレンをペトリ皿に配置します。次に、各脱細胞化スキャフォールド切片をSFDMからメンブレン上に移し、切片がメンブレン上に均一に広がるようにします。6ウェルまたは12ウェルプレートの各ウェルに、それぞれ1mlまたは0.5mlのSFDMを満たして準備します。その後、メンブレンをウェルにそっと配置し、メンブレンを培地の上に浮かせて気液界面培養系を作成します。3Dスキャフォールドに播種するために、内胚葉細胞の調製およびフローサイトメトリー（fluorescence activated cell sorting）による分化内胚葉の濃縮を行った後、血球計数器を用いて分取した細胞を計数します。その後、細胞を400 Gsで5分間遠心分離します。SFDMを用いて、ペレット化した細胞を10 µLあたり約100,000個になるように再懸濁します。