Name: 脱細胞肺足場を使用してESC由来のマウス気道上皮細胞の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: 学ぶ、マウス胚性幹細胞を脱細胞化肺足場を用いた3次元培養系で気道上皮細胞へ分化誘導する方法。血清フリー条件下で肺系譜特異化を効率的に制御し、再生医療や肺疾患研究への応用が期待されます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々は、 図1〜図3に示した実験で使用したNkx2-1のmCherryをEscキー博士Rossant博士Bilodeauに感謝したいです。 FACSはSickKids-UHNフローサイトメトリーの施設で行いました。この作品は、ヘルスリサーチのためのカナダの研究所とイノベーションのカナダの財団からインフラ助成金（CSCCD）からの助成金を操作することによってサポートされていました。

動物実験は、病気の子供の研究所用の病院の動物ケア委員会のガイドラインに従って行いました。 1.足場の準備<ol><li>肺の脱細胞化<ol><li> CO 2チャンバーを用いて大人Wistarラットを安楽死させます。チャンバー内に動物を置き、毎分室容積の10から30パーセントの充填率で100％のCO 2露光を開始。 <ol><li>無意識のために動物を観察します。これは、約2〜3分後に発生します。無意識は、この期間中に発生しない場合は、速度とチャンバシールを埋めるチェック。無意識に続いて、色あせた目の色や呼吸の不足のために動物を観察。両方が認められた場合、1-2分間CO 2の充填性を維持し、その後手続きのためにチャンバーから動物を削除します。 </li></ol></li><li>前足と後ろ足を固定することにより、表面を解剖する動物を固定し、70％エタノールで胸と腹部領域を下にスプレー。心臓やLUにアクセス胸骨に沿って縦切開を使用して胸腔を開いてNGS。 </li><li>肺を穿刺の可能性を低減、肺が撤回させるために第一ダイヤフラムを通して小さな切開を行います。縫合糸と下大静脈を結紮し、小さな解剖ハサミで左心房に小さな切開部を置きます。 </li><li>ヘパリン処理したハンクス平衡塩溶液（HBSS）（HBSS中で10 U / mlのヘパリン）を充填した25 G針を準備し10ミリリットル注射器を用いて、肺循環を介してバッファをプッシュするために右心室に針を挿入することにより、肺灌流を開始（2 ml /分の速度）。肺が白く、左心房から流れる流体が透明に実行されるまで、この手順を続行します。 </li><li>灌流後、甲状軟骨に近いプラスチックカテーテルを気管カニューレを挿入するとを露出させ、縫合糸で所定の位置に固定します。 </li><li>セットアップレトルトスタンドとクランプに10ミリリットル注射器を固定することで、重力の灌流システム。削除およびdiscardシリンジプランジャ。肺上記20センチメートルでシリンジバレル上の最大充填点を固定します。カニューレを挿入し、気管に脱細胞化ソリューションを提供するための活栓の他端にシリンジの最後に2方コック、と長いプラスチックチューブを取り付けます。シリンジにソリューションを注ぎ、溶液が付着したプラスチックチューブ及びカテーテルを埋めることができます。 <ol><li> 1分間の総肺容量（約12ミリリットル）に充填することによって肺を洗浄し、流体が肺の外に流れることを可能にするために気管からプラスチック製のカテーテルを削除します。 H 2 O 20cmの下に圧力を保つために、肺をlavagingとき、シリンジ以上の10ミリリットルを記入しないでください。 </li></ol></li><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で10回洗浄、続いて脱細胞化溶液で8倍に肺の洗浄を繰り返します。 </li><li>首と胸の空洞から無料で気管と肺を解剖し、動物から取り除きます。ビブラトームSEのための準備まで4℃で冷PBSで組織を保ちますctioning。 </li></ol></li><li>肉厚部の生成<ol><li>小さな長方形のブロックにすべてのローブを埋め込むための約15ミリリットルの2％と4％の（w / v）のアガロース、および十分な6％（w / v）のアガロースを準備します。電子レンジによってPBS中の低融点アガロース粉末を溶解します。ヒートブロック上で50ミリリットルチューブにアガロースを移し、ゲル化を避けるために40℃以上の温度を維持します。 </li><li>小さなハサミを使用して、各葉（頭蓋、ミドル、付属品、および尾右葉と左葉）を切り離すために、各葉気管支の最後に脱細胞化肺を解剖。パットは、アガロース加熱ブロック上にある間（w / v）の2％の内側に過剰のPBSと場所を削除するには、吸収性シートを使用して、各葉を乾燥させます。 </li><li>ペトリ皿に置き、アガロースでコーティングの5分後に各葉を取り出して、表面がコールドプレートに1分間ゲル化することができます。 </li><li>穏やかに5分後に、戻って、4％（w / v）のアガロースにクールローブを置き、6％（w / v）アガロースで一回以上のコーティングを繰り返します。 </li><li>シーケンシャル共同後各ローブのati​​ngは、縁からの組織を囲むアガロース少なくとも3 mmの金属ベースモールドを使用して、6％（w / v）のアガロースで別々に各ローブを埋め込みます。オリエント実験者が直面している金型の表面に葉の最大の平らなエッジを配置することによって、鉗子を用いて、各葉。このエッジはビブラトーム切片用試料板に固定された側になります。 </li><li>ブロックは前ビブラトームで切片に少なくとも30分間冷却板にゲル化することを可能にします。 4℃で最大12時間、加湿チャンバー内のストアブロック切片ビブラトームの前に。 </li><li>セットアップ冷PBS 12で切片室を充填することによりビブラ。周囲の氷浴で切片全体に冷たい温度を維持します。組織のエッジから約3ミリメートルを維持しながら、金型からブロックを削除し、ローブを周囲の過剰なアガロースを切り詰めるためにカミソリの刃を使用します。 </li><li>接着剤を使用して試料プレートの中央に組織を固定し、そしてトンにプレートを沈めます彼セクショニング室をPBSで満たされました。 0.2ミリメートル/秒、1.85ミリメートル、および350μmで：それぞれ以下の速度、振幅、および厚さの値を選択することにより、ビブラトーム上の境界をセクショニングセットアップ。 注：葉の向きの縦方向と横方向の両方のセクションでは、許容可能です。 </li><li>項各葉完全に。セクションが完全に部分シーケンスの最後にブレードによって分離されていない場合は、手動カットのセクションでは、小さなはさみを使用して自由に。優しく足場セクションを収集し、次のステップまで氷上でPBSに保ちます。 注：生成されたセクションは、近位および遠位の肺区域及び再細胞化に使用することができ、両方のソースの両方を含むことになります。しかしながら、表面の大部分は、遠位肺を含むであろう。 </li></ol></li><li>足場部の除染<ol><li>マイクロ遠心チューブ（最大30セクション/チューブ）にPBSから350ミクロンの厚さの足場部分を転送し、ヌクレアーゼで処理（PBS中90 U / ml）を（材料のリストを参照してください）​​12 - 上でRTで24時間、回転子。 </li><li>ヌクレアーゼ処理に続いて、新しいマイクロチューブに鉗子を使用し、回転子に室温で6時間滅菌条件下（PBS中の200 U / mlのペニシリンストレプトマイシンおよび25μg/ mlのアンホテリシンB）抗菌溶液で扱う転送部。 注：足場は、使用前に4℃で最大1週間の抗菌剤溶液中に保存することができます。 </li><li>抗菌溶液で除染工程に続いて、滅菌条件下でPBSで2回足場をすすぎ、細胞を播種する前に自由分化培地（SFDMを）血清への転送。 </li></ol></li></ol> 2.内胚葉細胞の調製<ol><li>胚体内胚葉誘導<ol><li> 2iの条件13を使用した無フィーダー、無血清培養下でのマウスESCのラインを維持します。トリプシン処理により接着性多能性培養物から細胞を除去することによって、内胚葉誘導を開始します。 </li><li> 20,000密度でSFDMと種子中の細胞を再懸濁EB形成を可能にするメディア変更せずに3日間の低接着性プレート中の細胞/ mlです。 </li><li> 3日後、静かに10ミリリットルピペットを用いて50ミリリットルコニカルチューブをしたEBを転送し、それらを室温で3分間の底に収集することができます。 </li><li>慎重に培地を吸引し、50 ngの/ mlのアクチビンAを補った新鮮なSFDMメディアを追加</li><li>胚体内胚葉分化を達成するための3つの追加日間2密度と文化：バック1での低接着性プレート上に種子細胞。 </li></ol></li><li>胚体内胚葉の濃縮<ol><li> 、6日目のEBを収集し、トリプシンで解離し、共役蛍光抗体14を使用してC-KITおよびCXCR4発現のためにラベルを付けます。 </li><li>両方のマーカーの発現のための蛍光活性化細胞選別（FACS）を使用してソート標識された細胞は、濃縮された胚体内胚葉集団15を得ました。 </li></ol></li></ol> 3.再細胞化のセットアップ<ol><li>気液界面文化のセットアップ<ol><li>滅菌ピンセットを用いた疎水性浮遊膜（8μmの細孔サイズ）にSFDMから各脱細胞足場セクション（ステップ1.2.9）を転送します。足場を確認のセクションでは、膜上に均一に広がっています。 </li><li>それぞれ、SFDMの1または0.5ミリリットルでウェルを充填することにより、6-または12ウェルプレートを準備します。ゆっくり膜は、空気 - 液体培養セットアップを作成、メディアの上に浮いているようにできるように、ウェルに膜を配置します。 </li></ol></li><li> 3D足場の播種<ol><li>胚体内胚葉マーカーのための次のFACS（ステップ2.2.2）はSFDM中で5分間再懸濁し、400×gでスピンダウンし、血球計数器を使用して選別された細胞を数えます。約100,000細胞/10μlの/足場を含むボリュームを得るために細胞を再懸濁します。 </li><li>そのままステップ3.1.2から各準備セクションの上に足場、細胞のピペット10μLを再細胞化するには。 </li><li>培養物中に48時間ごとにSFDMメディアを交換してください。わずかな傾斜でプレートを保持することによって、古いメディアを吸引文化の中断を避けるため。ゆっくりと浮遊膜の沈没を防ぐために、ウェルの側面に沿って培養液に新鮮なSFDMを追加します。 </li><li>成熟した気道上皮にに播種された細胞の分化を達成するために、最大21日間の空気 - 液体培養を維持します。 注：再細胞化のセクションでは、細胞培養物16中の任意の時点で組織染色および免疫蛍光（IF）顕微鏡検査のために処理することができます。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+Factors%2C+Matrices%2C+and+Forces+Combine+and+Control+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells.</a> Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).</li>
<li>Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+dynamics+in+development+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine.</a> J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).</li>
<li>Ghaedi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-derived+alveolar+epithelium+repopulates+lung+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix.</a> J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).</li>
<li>Huang, S. X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).</li>
<li>Jensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+lung+de-cellularization+protocol+supports+embryonic+stem+cell+differentiation+in+vitro+and+following+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation.</a> Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).</li>
<li>Longmire, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+purified+lung+and+thyroid+progenitors+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).</li>
<li>Wong, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+mature+airway+epithelia+expressing+functional+CFTR+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein.</a> Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).</li>
<li>Gilpin, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Lung+Epithelial+Specification+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+on+Decellularized+Lung+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Annal.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix.</a> Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).</li>
<li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Acellular+Natural+Lung+Matrix+on+Murine+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation+and+Tissue+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).</li>
<li>Princivalle, M., De Agostini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+roles+of+heparan+sulfate+proteoglycans%3A+a+comparative+review+in+Drosophila%2C+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human.</a> Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).</li>
<li>Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+in+lung+morphogenesis%3A+The+elephant+in+the+room%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+Part+C%2C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room.</a> Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).</li>
<li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+reproducibility+in+preparing+precision-cut+liver+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices.</a> Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).</li>
<li>Ying, Q. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Fox, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Culture+and+FGF+Signaling+Drive+Differentiation+of+Murine+Pluripotent+Cells+to+Distal+Lung+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells.</a> Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546(2010).</li>
<li>Shojaie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+lung+scaffolds+direct+differentiation+of+endoderm+to+functional+airway+epithelial+cells%3A+requirement+of+matrix-bound+HS+proteoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans.</a> Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).</li>
<li>Kubo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+definitive+endoderm+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.</a> Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).</li>
<li>Longmire, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Derivation+of+Purified+Lung+and+Thyroid+Progenitors+from+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells.</a> Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).</li>
<li>Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3D+mouse+embryo+atlas+based+on+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT.</a> Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).</li>
</ol>

宣言しない競合する金融利害関係はありません。

ここで説明するプロトコルは他の補充との差別化を指示するために唯一の天然の肺足場を使用して、成熟したESC由来の気道上皮を生成します。この培養のセットアップは、無血清、安価で、かつ再現性の定義されています。ベース分化培地のない成長因子の補充が必要とされません。幹細胞由来の肺上皮細胞を生成するための、以前に公表された方法は、系統限定3,4,8,18,19を促進する成長因子の補充と2次元の戦略を使用しています。定義された培養条件、機能性気道細胞、他の内胚葉系統（甲状腺、肝臓、膵臓）から限定された汚染への高い分化効率、および3D分化微小環境：ここに記載された技術は、以下を含むいくつかの理由のためにこれらの方法よりも有利です。この技術は、マウス由来のECMと同様の結果が得られ、したがって、マウス肺を用いて脱細胞化スカフォールドを生成するように修飾することができます。ラット由来のESCは、胚体内胚葉に分化し、また、気道上皮に分化このプロトコルを使用して足場に播種しました。 脱細胞化された足場は、前再細胞化に最大7日間、4℃で汚染除去溶液中に保存することができます。足場は、...

肺系統への多能性細胞の監督分化は、微小環境1,2で正確なシグナル伝達事象に依存しています。これにより、プロセスの動的な性質のために、in vitroで肺器官の正確なイベントを模倣するために挑戦されています。最近の報告は、肺分化3-8を達成するために、二次元培養物の可溶性増殖因子の補充と段階的系統制限戦略を使用しています。段階的な分化プロトコルにおいて、多能性細胞は、胚性幹細胞（ESC）または人工多能性幹細胞かどうかを、まず胚体内胚葉胚葉に分化させました。ホメオドメイン含有転写因子NKX2-1の表現によって識別されるように内胚葉細胞は、その後、前方内胚葉の運命に、その後、肺前駆細胞にプッシュされました。これらの肺前駆細胞はさらに、近位（気道）または遠位（肺胞）肺上皮細胞のwiに分化させました継続的な成長因子補充番目。このような2次元の戦略が肺上皮細胞を生成する際に、いくつかの成功を収めている、しかし、そこに不明瞭効率、他の内胚葉系統からの汚染の可能性、3次元（3D）構造の欠如を含むいくつかの制限があり、場合によっては、未定義の培地の使用血清補充を持ちます。脱細胞肺足場上の多能性又は分化した細胞の培養は、ますます肺上皮構造3,5,6,8,9を形成する際に播種した細胞の再生可能性を評価するためのアッセイとして使用されています。このようなレポートの文化は継続的な成長因子または血清補充と足場に細胞を播種しました。 肺の開発は、環境の合図に応答して個々の細胞の分裂、遊走、遺伝子発現および分化を含みます。細胞外マトリックス（ECM）は、構造的支持を提供することに加えて、TISSUを指示する糖タンパク質の格子でありますこれらのプロセス10,11を統合し、調節することにより、電子形態形成。優れたin vivoでの肺の発達環境を模倣するために内胚葉培養のために自然なプラットフォームとしての肺のECMスキャフォールドを使用することにより、我々は、高効率と再現性で設定定義された3D-培養中の細胞由来の気道上皮幹細胞生成しています。 ラット肺のECMスキャフォールドは、脱細胞化によって生成されただけでなく、マウスESC由来の内胚葉細胞が生成され、その後、これらの足場に播種しました。 CXCR4＆C-KITタンパク質の二重発現は、気道（近位肺）前駆細胞として同定されるSOX2＆NKX2-1発現の両方に陽性胚体内胚葉細胞のアイデンティティと細胞を示します。胚体内胚葉細胞は、 インビトロでの機能的気道上皮細胞を生成するために、最大3週間、空気液体界面（ALI）で培養しました。 このプロトコルは、definiの肺系統への分化を促進します早ければ7日のような的な内胚葉、NKX2-1 + / SOX2 +早期近位肺前駆細胞の出現で観察しました。日によって14と文化の21成熟した気道上皮細胞集団は、ネイティブマウス気道への形態学的および機能的類似性を持つ繊毛（TUBB4Aの+）、クラブ（SCGB1A1の+）、および基底（TRP63 +、KRT5 +）細胞を含む出現します。このプロトコルは、上皮細胞を気道する堅牢な差別化を実現するための3次元マトリックスの微小環境の重要性を示しています。

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>灌流液</td><td>Sigma</td><td>H0777</td><td>10 U/ml ヘパリン</td></tr><tr><td>灌流液</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td>ハンクの平衡塩溶液 (HBSS-)</td></tr><tr><td>脱細胞化液</td><td>BioShop</td><td>CHA003</td><td>8&nbsp;mM CHAPS</td></tr><tr><td>脱細胞化ソリューション</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td>25&nbsp;mM EDTA</td></tr><tr><td>脱細胞化ソリューション</td><td>BioShop</td><td>SOD002</td><td>1&nbsp;PBS</td></tr>ベンゾナーゼヌクレアーゼに<tr><td>溶解した</td>M NaCl脱<td>細胞化溶液</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td></tr><tr><td></td><td>Novagen</td><td>70664-3</td><td>90&nbsp;U/mlベンゾナーゼヌクレアーゼ&nbsp;</td></tr><tr><td>ベンゾナーゼヌクレアーゼ</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>をPBS抗菌溶液で希釈</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>ギブコ</td><td>15140</td><td>200&nbsp;U/ml ペニシリンストレプトマイシン</td></tr><tr><td>抗菌剤溶液&nbsp;</td><td>ギブコ</td><td>15290</td><td>25&nbsp;&mu;g/ml アンホテリシンB</td></tr><tr><td>抗菌剤溶液&nbsp;</td>PBSトリプシン化<td>で希釈した</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>TrypLE</td></tr><tr><td>無血清分化培地 (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>IMDM 2440-053, F12 11765-054</td><td>IMDM とハムの 3:1 の比率s modified F12 medium</td></tr><tr><td>無血清分化培地 (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td>B27 supplement (50x dilution)</td></tr><tr><td>無血清分化培地 (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>N2 supplement (100x dilution)</td></tr><tr><td>無血清分化培地 (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>0.05% (Fraction V) wevine serum albumin</td></tr><tr><td>Serum free differentiation media (SFDM)</td><td>ギブコ</td><td>35050-061</td><td>200&nbsp;mM グルタマックス</td></tr><tr><td>セラム フリー分化培地 (SFDM)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td>4&nbsp;&mu;Mモノチオグリセロール</td></tr><tr><td>無血清分化培地(SFDM)</td><td>Sigma</td><td>A4403&nbsp;</td><td>0.05&nbsp;mg / mlアスコビック酸</td></tr><tr><td>内胚葉誘導</td><td>R&D</td><td>338-AC/CF</td><td>アクチビン A</td></tr><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDH1</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>マウス、非標識、1:100</td></tr><tr><td>C-KIT</td><td>BD Biosciences</td><td>558163</td><td>ラット、PE-Cy7、1:100</td></tr><tr><td>CXCR4</td><td>BD Biosciences</td><td>558644</td><td>ラット、APC、1:100</td></tr><tr><td>KRT5</td><td>Abcam</td><td>ab24647</td><td>ウサギ、非結合、1:1,000</td></tr><tr><td>NKX2-1</td><td>Abcam</td><td>ab76013</td>ウサギ<td>、非結合、1:200</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-144</td>ウサギ<td>、非結合、1:200</td></tr><tr><td>SCGB1A1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9772&nbsp;</td><td>ヤギ、非共役、1:1,000</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>R&Dシステムズ</td><td>AF2018&nbsp;</td><td>ヤギ、非共役、1:400</td></tr><tr><td>TRP63</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8431</td><td>マウス、非標識、1:200</td></tr><tr><td>TUBB4A</td><td>BioGenex</td><td>MU178-UC</td><td>マウス、非標識、1:500</td></tr><tr><td>ヤギ IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td>Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>マウス IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21202</td><td>Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>マウス IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200</td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>Rabbit IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31573</td><td>Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200</td></tr><tr><td>Other Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low adherent plates</td><td>Nunc</td><td>Z721050&nbsp;</td><td>低細胞結合プレート、&nbsp; 6ウェル&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>気液界面膜&nbsp;</td><td>Whatman</td><td>110614</td><td>疎水性核膜、8&nbsp;&mu;m 細孔径</td></tr><tr><td>ビブロート</td><td>ライカ</td><td>VT1200S&nbsp;</td><td>ライカビブラトーム</td></tr><tr><td>ティッシュ接着剤</td><td>テッドペラ</td><td>10033</td><td>Pelcoティッシュ接着剤</td></tr></tbody></table>

脱細胞肺足場を使用してesc由来のマウス気道上皮細胞の生成

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

肺系統への分化は、増殖因子シグナル伝達、細胞 - 細胞相互作用および細胞 - マトリックス相互作用を含む複雑な環境手がかりの統合を必要とします。これにより、複雑に、肺上皮細胞への幹細胞の分化を促進するために、インビトロで肺の発達の要約は、困難でした。このプロトコルでは、脱細胞化肺足場は、肺の3次元環境を模倣し、幹細胞由来の気道上皮細胞を生成するために使用されます。マウス胚性幹細胞を、まず脱細胞化の足場上に播種されたアクチビンA内胚葉細胞と胚様体（EB）培養法を用いて内胚葉系統に分化し、最大21日間、空気 - 液体界面で培養します。この技術は、追加の増殖因子を補充せずに機能的気道上皮細胞（繊毛細胞、クラブ細胞、および基底細胞）に播種した細胞の分化を促進します。この培養の設定が定義されている、SERUメートルのない、安価で、かつ再現可能。文化の中で非肺内胚葉系統からの限られた汚染があるが、このプロトコルは、気道上皮集団を生成し、肺胞上皮細胞に上昇を与えるものではありません。このプロトコルを用いて生成された気道上皮、肺器官中および疾患モデルまたは嚢胞性線維症などの気道に関連した病態の創薬プラットフォームの細胞 - マトリックス相互作用を研究するために使用することができます。

このプロトコルで概説したように、胚体内胚葉の堅牢な分化は上皮細胞が脱細胞化肺足場セクションに播種した細胞の拡張文化を使用して達成することができる気道を成熟します。脱細胞化スカフォールドは、（1）宿主細胞が完全に除去されているを確保するために特徴付けられ、および（2）は、細胞外マトリックスタンパク質は、分化のための足場を使用する前に保存されることをお勧めします。 図1Aに示されるように脱細胞化は、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）および4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を用いて組織染色を用いて評価することができます。足場の高倍率走査型電子顕微鏡（SEM）分析は、 図1Bに示されるように、宿主細胞と無傷の基質のアーキテクチャが存在しないことを確認します。マトリックスタンパク質のための引張試験および免疫染色によって残りの足場のさらなる特徴付けはpreservatを確実にするために行うことができます脱細胞化16以下ECMのイオン。 <p class...

このプロトコルは、効率的に気道上皮細胞を成熟するために、マウスの胚性幹細胞由来の胚体内胚葉を指示します。この分化技術は、定義された、無血清培養の設定において、肺系統の仕様を指示するために3次元の脱細胞化肺足場を使用します。

脱細胞肺足場を使用してESC由来のマウス気道上皮細胞の生成

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

この手順の全体的な目的は、脱細胞化肺スキャフォールドを用いた3D培養系を用いて、マウス胚性幹細胞を成熟した気道上皮細胞へと分化誘導することです。この手法は、肺の系統分化における細胞マトリックスの収縮や成長因子のシグナル伝達の役割など、肺発生領域における重要な疑問への回答に寄与します。本技術の主な利点は、定義された無血清条件下で3D培養システムを使用し、他の内胚葉系統からの混入を抑えつつ、堅牢な気道上皮分化を達成できる点にあります。テキストプロトコルに従って成体Wistarラットを安楽死させた後、前肢と後肢を固定して動物を解剖台に固定し、70% ethanolを胸部と腹部にスプレーします。肋骨縁の直下に切開を加えます。皮膚を切開し、横隔膜を露出させます。次に、横隔膜に小さな切開を入れて肺を後退させ、肺を穿刺する可能性を低減します。次に、胸骨に沿って垂直に切開を加え、胸腔を開いて心臓と肺にアクセスします。その後、縫合糸で下大静脈を結紮し、小型の解剖用ハサミを使用して左心房に小さな切開を加えます。ヘパリン化したHank's Balance salt solutionを満たした25ゲージ針付きの10mlシリンジを用い、針を右心室に挿入して肺灌流を開始し、緩衝液を肺循環に押し込みます。肺が白くなり、左心房から流出する液が透明になるまで灌流を続けます。灌流後、気管を露出し、挿管のために甲状軟骨付近に小さな切開を加えます。次に、プラスチックカテーテルで気管に挿管し、縫合糸で固定します。ここで、10mlシリンジをレトルトスタンドとクランプに固定して、重力灌流システムを構築します。その後、シリンジのプランジャーを取り外して廃棄します。シリンジシリンダーの最大充填点を肺の20 cm上に固定し、シリンジの端に2方活栓を、活栓のもう一方の端に長いプラスチックチューブを取り付けます。気管からカテーテルをゆっくりと引き抜き、プラスチックチューブの端に取り付けます。次に、脱細胞化溶液をシリンジに注ぎ、接続されたプラスチックチューブとカテーテルを溶液で完全に満たします。溶液で満たされたカテーテルを気管に戻し、全肺気量まで満たして1分間肺を洗浄（ lavage）します。その後、カテーテルを気管から抜き、液体が肺から流出するようにします。脱細胞化溶液による肺の洗浄を8回繰り返し、続いてPBSで10回すすぎます。洗浄ステップが完了すると、肺は白く見えます。その後、頸部と胸腔から気管と肺を摘出します。食道や心臓を含む摘出肺から余分な組織を取り除き、ビブラトームによる切片作成まで肺を冷PBSに保存します。厚切片を準備するために、PBSを用いて2%および4%の低融点アガロースを約15ml作成し、また、すべての葉を小さな長方形のブロックに包埋するのに十分な量の6%アガロースを作成します。アガロースを15mlチューブに移した後、チューブをヒートブロックに置き、ゲル化を防ぐために温度を40 degrees celsius以上に維持します。小型のハサミを用いて、各葉気管支の末端で脱細胞化肺を切断し、各葉を分離します。次に、吸収シートで余分なPBSを取り除き、葉をヒートブロック上の2%アガロースに移して5分間組織をコーティングします。各葉をペトリ皿に移した後、皿をコールドプレートに置き、表面を1分間ゲル化させます。葉を4%アガロースにそっと配置し、5分間インキュベートして冷却した後、6%アガロースで再度コーティングします。コーティング後、金属ベースの型を用いて各葉を個別に6%アガロースに包埋し、組織の端から少なくとも3mlのアガロースで周囲を囲みます。次に、ピンセットを用いて、組織の最も広い平坦な面が実験者側を向くように金属型の表面に配置して各葉の向きを整え、プラスチックカセットを用いて包埋を完了させます。ビブラトームで切片を作成する前に、コールドプレート上でブロックを少なくとも30分間ゲル化させます。あるいは、ビブラトームによる切片作成まで、加湿チャンバー内で4 degrees celsiusで最大12時間ブロックを保存します。切片を準備するために、切断チャンバーを冷PBSで満たしてビブラトームをセットアップします。切断中、低温を維持するために周囲に氷浴を設置します。ここで、金属型からブロックを取り出し、カミソリを用いて、組織の端から約3 millimetresを残して葉の周囲の余分なアガロースを削り取ります。接着剤を用いて組織を標本プレートの中央に固定し、プレートをPBSで満たした切断チャンバーに浸します。ビブラトームに切断用ブレードを装着します。ビブラトームの切断境界を設定し、速度、振幅、厚さの値をそれぞれ選択します。各葉を完全に切断し、切片が完全に分離しない場合は、小型のハサミを用いて手動で切片を切り離します。その後、スキャフォールド切片を慎重に回収し、冷PBSに移します。ピンセットを用いて、周囲のアガロースから各切片を慎重に分離します。スキャフォールド切片を除染するために、PBSからマイクロ遠心チューブに移した後、PBSに溶かした90 units per milliliterのヌクレアーゼを加え、回転させながら室温で12〜24時間インキュベートします。切片を新しいマイクロ遠心チューブに移した後、テキストプロトコルに従い、無菌条件下で抗菌溶液を加え、回転させながら室温で6時間インキュベートします。その後、無菌条件下でPBSを用いてスキャフォールドを2回すすぎ、細胞を播種する前に無血清培地（SFDM）に移します。気液界面（air liquid interface）培養を構築するために、滅菌ピンセットを用いて疎水性メンブレンをペトリ皿に配置します。次に、各脱細胞化スキャフォールド切片をSFDMからメンブレン上に移し、切片がメンブレン上に均一に広がるようにします。6ウェルまたは12ウェルプレートの各ウェルに、それぞれ1mlまたは0.5mlのSFDMを満たして準備します。その後、メンブレンをウェルにそっと配置し、メンブレンを培地の上に浮かせて気液界面培養系を作成します。3Dスキャフォールドに播種するために、内胚葉細胞の調製およびフローサイトメトリー（fluorescence activated cell sorting）による分化内胚葉の濃縮を行った後、血球計数器を用いて分取した細胞を計数します。その後、細胞を400 Gsで5分間遠心分離します。SFDMを用いて、ペレット化した細胞を10 µLあたり約100,000個になるように再懸濁します。

generation-esc-derived-mouse-airway-epithelial-cells-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

私たちは、脱細胞肺癌細胞外マトリックスと機能的な肺組織を生成するために使用することができる新規バイオミメティックバイオリアクターを開発している。バイオリアクターにおけるマトリックスと培養に細胞を播種することにより、我々は短期間のためのin...

肺のエンジニアリングのための手順

このビデオでは、組織工学アプリケーションのための、その生化学的構造と組成が保存された脱細胞化ブタ食道足場の準備を示しています。...

脱細胞化ブタ食道足場調製:ブタ食道から無細胞足場を生成する技術

全臓器の脱細胞化は、再生医療に使用できる可能性のある天然の生物学的足場を生成します。肺全体の細胞が脱細胞化され、血管循環と液体媒体の換気を促進するバイオリアクターで成体幹細胞と内皮細胞が播種される肺再生の非ヒト霊長類モデルの説明が提示されます。...

非ヒト霊長類の肺脱細胞化と特殊大型臓器バイオリアクターを用いた再細胞化

このプロトコルは、マウスの心臓と肺の細胞化を解除することを目的としています。得られた細胞外マトリックス(ECM)足場は、免疫染色され、それらの成分の位置およびトポロジーをマッピングするために画像化することができる。...

マウス心肺複合体の脱細胞化

本稿では、近位および遠位上皮肺細胞と共に近位および遠位上皮肺細胞の両方を含む3次元全肺オルガノイドに対する誘導多能性幹細胞のステップ指向分化について説明する。...

肺発生生物学と疾患をモデル化するための人工多能性幹細胞からの3D全肺オルガノイドの生成

このプロトコールは、脱細胞化された精密切断肺スライスに肺胞上皮2型細胞、線維芽細胞、および内皮細胞を再移入することによって、再現性のある小規模の操作された肺組織を生成する方法を記載している。...

脱細胞化肺スライスから調製された人工肺組織

このプロトコルは、ラット気管からの内因性上皮の選択的除去および管腔表面上の外因性細胞の均質な分布、続いて細胞組織構築物の長期 インビトロ...

バイオエンジニアリング気道組織を生成するためのイメージング誘導バイオリアクター

ヒト人工多能性幹細胞分化プロトコールにおける最近の進歩は、器官特異的細胞型の段階的な誘導を可能にする。ここでは、気液界面培養におけるiPSC由来気道基底細胞の維持・拡大と粘液繊毛上皮への分化のための詳細な手順を述べる。...

ヒト多能性幹細胞からの気道上皮細胞気液界面培養物の生成

この記事では、人工多能性幹細胞(iPSC)由来の肺上皮、間葉、内皮細胞、およびマクロファージで構成される複雑な多細胞気道バリアモデルを気液界面培養で生成する方法について説明します。...

iPSC由来の上皮細胞、間葉系、内皮細胞、免疫細胞の共培養による肺の健康と疾患における気道バリア完全性のモデル化

この論文では、脱細胞化および再細胞化法を使用してバイオエンジニアリングされたマウス肺を作成する方法を説明します。また、その後の同所性肺移植についても詳しく説明しています。...

脱細胞化マウス肺と初代ヒト内皮細胞を用いた生体工学的肺移植

学ぶ、マウス胚性幹細胞を脱細胞化肺足場を用いた3次元培養系で気道上皮細胞へ分化誘導する方法。血清フリー条件下で肺系譜特異化を効率的に制御し、再生医療や肺疾患研究への応用が期待されます。

脱細胞肺足場を使用してESC由来のマウス気道上皮細胞の生成

さらに動画を探す