脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

この手順の全体的な目標は、新たに解剖された脳スライスで全細胞パッチクランプ記録を実行する方法を説明することです。この方法は、実験的制御操作が特定の脳領域の特定のニューロンの活動をどのように変化させるかなど、神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、無傷の覚醒動物で発達したニューロン機能のX vivo調製物の長期にわたる変化を同定するための媒体を提供することです。

この方法は、脳切片のニューロン機能に関する洞察を得ることができますが、培養細胞やin vivoのニューロンなど、他のシステムにも適用できます。この手順を実演するのは、私の研究室の学生であるFrancisco Garcia-Oscosです。この手順を開始するには、プラスチック製のトリム先端のトランスファーピペットを使用して、回復チャンバーから1つの脳スライスを静かに引き出します。

トランスファーピペットを記録チャンバーに置き、ピペットからスライスをチャンバーの下部にあるカバースリップライニングにそっと絞ります。次に、顕微鏡4倍対物レンズを使用して、目的の領域が記録チャンバーの中央に正確に配置されるようにスライスを配置します。目的の位置に到達したら、スライスホールドダウン(ハープとも呼ばれます)でブレインスライスの位置を固定します。

その後、40倍対物レンズに切り替え、チャンバー内のACSFに接触するまでレンズをゆっくりと下げます。次に、微調整ホイールを使用して組織にピントを合わせます。焦点が組織レベルにある場合は、標的領域の細胞を観察します。

次に、ターゲットセルを探します。録音用マイクロピペットをガイドするために、コンピューターの画面に印を付けます。対物レンズを持ち上げて、記録用マイクロピペットを配置するための十分なスペースを確保します。

このステップでは、1ミリリットルのシリンジ、非金属製のマイクロシリンジニードル、および専用フィルターを使用して、事前に準備した内部溶液をマイクロピペットに充填します。マイクロピペットに気泡がないことを確認してください。次に、マイクロピペットを電極ホルダーに入れ、溶液が塩化銀でコーティングされたワイヤー電極に接触します。

ピペットキャップを締めて、コーンワッシャーがマイクロピペットの周りにシールを形成するようにします。次に、ピペットホルダーに接続された空気充填シリンジで陽圧を加えてから、マイクロピペットをACSFに浸し、破片がACSFに入るのを防ぎます。マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットをチャンバーに誘導し、浸漬対物レンズのほぼ中央の下にくるようにします。

マイクロマニピュレーターでマイクロピペットを中速から高速で動かしながら、コンピューター画面上のマイクロピペットの位置を特定し、マイクロピペットをXY軸上のセルの位置に誘導します。その間に、電圧ステップを印加してマイクロピペットの抵抗を測定します。マイクロピペットを塞いでいる気泡やその他の異物を取り除くために、陽圧を加えます。

マイクロピペットをクリアした後、電圧オフセットを実行してピペット電流をゼロに減らします。顕微鏡のファインフォーカスホイールを使用して、マイクロピペットを徐々に下げながらピントを合わせ始めます。常に最初に焦点を合わせてから、マイクロピペットの先端が突然スライスに浸透しないように、マイクロピペットを焦点面まで下げてください。

マイクロピペットがスライスの表面に接触したら、マイクロマニピュレーターの速度を中低速モードに遅くします。軽く正圧をかけて、道上の破片を取り除きます。次に、XYZコントロールノブと交互に押すか、Z軸ノブの回転に伴って両方のXZ軸が変化する対角線上に近づいて、セルに近づきます。

マイクロピペットが細胞に十分近づくと、細胞表面にくぼみが現れます。次に、ピペットホルダーの吸引チューブに接続されているチューブを介して弱く短時間の吸引を適用して、シールを作成します。ギガシールが形成されている間、コンピュータ制御のアンプコマンダーを使用して、細胞の保持電位を生理学的な静止電位に近づけ、膜が破裂した後の突然の変化を防ぎます。

ギガシールが形成されたら、高速または低速の静電容量を補正します。ここでは、加える吸引力が強すぎないことが非常に重要です。そうしないと、シールを確立する前にメンブレンが破裂する可能性があります。

シールが安定していて1ギガオムを超える場合は、短くて強い吸引力を加えて原形質膜を破裂させます。吸引力は短く、シールを確立するときに加えられる圧力よりも強くなければなりません。膜を適切に破裂させ、安定した全細胞構成を実現するため。

メンブレンテストでセルモードに切り替えると、入力抵抗、直列抵抗、メンブレン容量など、セルのさまざまなパラメータが表示されます。全細胞構成を達成した後、記録中もこれらのパラメータを引き続き監視します。ここに示されているのは、単一の側坐殻MSNから誘発されるEPSCの傾きの例です。

温度を24°Cから28°C、32°Cに上げると、誘発されたEPSCの傾きが大きくなります。ここでは、誘発されたEPSCの振幅を、マイナス80ミリボルトの電圧クランプモードで評価します。直列抵抗が増加すると、誘発されたEPSCSの振幅は減少します。

そして、ここには、スパイクを生成するニューロンの能力に対する入力抵抗の影響を示す2つのニューロンからのトレースの例があります。ニューロンは電流でクランプされ、マイナス80ミリボルトに保持されます。入力抵抗が増加すると、活動電位の数も増加します。

この手順を試みる際には、健康な脳スライスを生成することが重要であることを覚えておくことが重要です。また、直列抵抗、入力抵抗、温度など、電気信号の波形に影響を与える可能性のあるパラメータを監視することも重要です。このビデオを見れば、脳スライスにおける全細胞記録技術の基本的な側面を十分に理解できるはずです。