Name: 脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 学ぶ脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録法。神経細胞の電気的活動を測定し、脳回路内の神経機能を評価する技術です。神経科学における神経活動の理解に不可欠な手法を習得できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、サウスウエスタン大学のスタートアップ資金（SK）によってサポートされていました。

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Cahalan, M., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques: an overview.</a> Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).</li>
<li>Staley, K. J., Otis, T. S., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+properties+of+dentate+gyrus+granule+cells%3A+comparison+of+sharp+microelectrode+and+whole-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Membrane properties of dentate gyrus granule cells: comparison of sharp microelectrode and whole-cell recordings.</a> J Neurophysiol. 67 (5), 1346-1358 (1992).</li>
<li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).</li>
<li>Pusch, M., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+diffusional+exchange+between+small+cells+and+a+measuring+patch+pipette%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette.</a> Pflugers Arch. 411 (2), 204-211 (1988).</li>
<li>Kandel, E. R., Dudai, Y., Mayford, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+systems+biology+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular and systems biology of memory.</a> Cell. 157 (1), 163-186 (2014).</li>
<li>Kourrich, S., Bonci, A. Chapter 5: Synaptic and Neural plasticity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKourrich%2C+S+%22Neurobiology+of+Mental+Illness.+4th+edn%22">Neurobiology of Mental Illness. 4th edn</a>. , Oxford University Press. (2013).</li>
<li>Mozzachiodi, R., Byrne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+synaptic+plasticity%3A+role+of+nonsynaptic+plasticity+in+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">More than synaptic plasticity: role of nonsynaptic plasticity in learning and memory.</a> Trends Neurosci. 33 (1), 17-26 (2010).</li>
<li>Zhang, W., Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+other+side+of+the+engram%3A+experience-driven+changes+in+neuronal+intrinsic+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The other side of the engram: experience-driven changes in neuronal intrinsic excitability.</a> Nat Rev Neurosci. 4 (11), 885-900 (2003).</li>
<li>Kourrich, S., Calu, D. J., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+plasticity%3A+an+emerging+player+in+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intrinsic plasticity: an emerging player in addiction.</a> Nat Rev Neurosci. 16 (3), 173-184 (2015).</li>
<li>Luscher, C., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-evoked+synaptic+plasticity+in+addiction%3A+from+molecular+changes+to+circuit+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drug-evoked synaptic plasticity in addiction: from molecular changes to circuit remodeling.</a> Neuron. 69 (4), 650-663 (2011).</li>
<li>McEwen, B. S., Morrison, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+on+stress%3A+vulnerability+and+plasticity+of+the+prefrontal+cortex+over+the+life+course%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The brain on stress: vulnerability and plasticity of the prefrontal cortex over the life course.</a> Neuron. 79 (1), 16-29 (2013).</li>
<li>Sandi, C., Haller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+the+social+brain%3A+behavioural+effects+and+neurobiological+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stress and the social brain: behavioural effects and neurobiological mechanisms.</a> Nat Rev Neurosci. 16 (5), 290-304 (2015).</li>
<li>Kim, S. J., Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitous+plasticity+and+memory+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ubiquitous plasticity and memory storage.</a> Neuron. 56 (4), 582-592 (2007).</li>
<li>Ganguly, K., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+neural+plasticity+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside.</a> Neuron. 80 (3), 729-741 (2013).</li>
<li>Kullmann, D. M., Moreau, A. W., Bakiri, Y., Nicholson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Plasticity of inhibition.</a> Neuron. 75 (6), 951-962 (2012).</li>
<li>Bar-Yehuda, D., Korngreen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Space-clamp+problems+when+voltage+clamping+neurons+expressing+voltage-gated+conductances%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Space-clamp problems when voltage clamping neurons expressing voltage-gated conductances.</a> J Neurophysiol. 99 (3), 1127-1136 (2008).</li>
<li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 11 (7), 790-798 (2008).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods Enzymol. 207, 123-131 (1992).</li>
<li>Defelice, L. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDefelice%2C+LJ+%22Electrical+Properties+of+Cells-Patch+Clamp+for+Biologists%22">Electrical Properties of Cells-Patch Clamp for Biologists</a>. , Plenum Press. (1997).</li>
<li>Kornreich, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+patch+clamp+technique%3A+principles+and+technical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Cardiol%22%5BJournal%5D)">The patch clamp technique: principles and technical considerations.</a> J Vet Cardiol. 9 (1), 25-37 (2007).</li>
<li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMolleman%2C+A+%22Patch+Clamping%3A+An+Introductory+Guide+To+Patch+Clamp+Electrophysiology%22">Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).</li>
<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+patch+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Am%22%5BJournal%5D)">The patch clamp technique.</a> Sci Am. 266 (3), 44-51 (1992).</li>
<li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Exp Neurol. 131 (1), 133-143 (1995).</li>
<li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> J Neurosci Methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li>
<li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices%3A+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> J Neurosci Methods. 158 (2), 251-259 (2006).</li>
<li>Kourrich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+interaction+between+sigma-1+receptor+and+Kv1.2+shapes+neuronal+and+behavioral+responses+to+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic interaction between sigma-1 receptor and Kv1.2 shapes neuronal and behavioral responses to cocaine.</a> Cell. 152 (1-2), 236-247 (2013).</li>
<li>Kourrich, S., Klug, J. R., Mayford, M., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPAR-Independent+Effect+of+Striatal+aCaMKII+Promotes+the+Sensitization+of+Cocaine+Reward%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">AMPAR-Independent Effect of Striatal aCaMKII Promotes the Sensitization of Cocaine Reward.</a> J Neurosci. , (2012).</li>
<li>Kourrich, S., Rothwell, P. E., Klug, J. R., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+experience+controls+bidirectional+synaptic+plasticity+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cocaine experience controls bidirectional synaptic plasticity in the nucleus accumbens.</a> J Neurosci. 27 (30), 7921-7928 (2007).</li>
<li>Kourrich, S., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+neurons%2C+opposite+adaptations%3A+psychostimulant+experience+differentially+alters+firing+properties+in+accumbens+core+versus+shell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Similar neurons, opposite adaptations: psychostimulant experience differentially alters firing properties in accumbens core versus shell.</a> J Neurosci. 29 (39), 12275-12283 (2009).</li>
<li>Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+novelty+causes+stress-like+adaptations+at+nucleus+accumbens+synapses%3A+implications+for+studying+addiction-related+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Environmental novelty causes stress-like adaptations at nucleus accumbens synapses: implications for studying addiction-related plasticity.</a> Neuropharmacology. 61 (7), 1152-1159 (2011).</li>
<li>Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+adaptations+in+the+nucleus+accumbens+caused+by+experiences+linked+to+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Synaptic adaptations in the nucleus accumbens caused by experiences linked to relapse.</a> Biol Psychiatry. 69 (11), 1124-1126 (2011).</li>
<li>Koya, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+synapses+in+selectively+activated+nucleus+accumbens+neurons+following+cocaine+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Silent synapses in selectively activated nucleus accumbens neurons following cocaine sensitization.</a> Nat Neurosci. 15 (11), 1556-1562 (2012).</li>
<li>Conrad, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+accumbens+GluR2-lacking+AMPA+receptors+mediates+incubation+of+cocaine+craving%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving.</a> Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).</li>
<li>Kruskal, P. B., Jiang, Z., Gao, T., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+patch+clamp%3A+nanotechnologies+for+intracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Beyond the patch clamp: nanotechnologies for intracellular recording.</a> Neuron. 86 (1), 21-24 (2015).</li>
<li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale-targeted+patch-clamp+recordings+of+functional+presynaptic+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Nanoscale-targeted patch-clamp recordings of functional presynaptic ion channels.</a> Neuron. 79 (6), 1067-1077 (2013).</li>
</ol>

著者はいずれも、競合する利益や利害を持っていません。

このプロトコルは、脳切片におけるニューロンの全細胞パッチクランプ実験を行うための基本的な手順を説明します。しかし、この技術の複雑さ、可能性と感度は完全にこの資料に記載することはできません。ここでは、最も基本的な手順を描写し、成功と厳格なホールセル記録を達成するために制御されなければならない重要なパラメータを強調しようとしています。さらに理論的な学習のために、多くの本や記事は、脳スライス3,21-24にし、細胞生存率を高めるために25から27を使用したソリューションを絞り込むことができます方法の両方の全細胞パッチクランプ記録に公開されています。日常的に適切な録音を行うためには、集中的な練習を通じて技術的なスキルの向上が必要です。それにもかかわらず、前述の手順の適切なアプリケーションと、細胞がシナプスの機能および固有excitabiの変更に関する重要な情報を提供し、時間死後パッチを適用することができますリティ。 一般的には、慎重にACSFと内部マイクロピペット・ソリューションの両方を準備することの重要性に加えて、脳の解剖からの各ステップは、成...

パッチクランプ法、1970年代後半1,2に開発された電気生理学的技術は、生きている組織では、単一または複数のイオンチャネルの機能を研究するための主要なツールです。達成することができる別のパッチ構成の中で、全細胞パッチクランプ記録は、ニューロンの要部の電気的​​挙動の研究を可能にします。古典的には、この技術は、脳スライス、新たに解離ニューロンの、または細胞培養モデル3のいずれかでインビトロで行われます。脳スライス中のニューロン上で実行するとき、この手法にはいくつかの利点を提供します。具体的には、（i）ニューロンは、ある程度相対的に保存脳回路に記録され、そして細胞培養調製物と比較して、3生理学的に関連する環境を提供します。これは、急性pharmacologのいずれかのタイプによってトリガされた細胞および分子事象を早期に取り込む、あるいはリアルタイムでモニタリングすることができますiCalの操作- 生体内条件の古典用いて達成することができない時間分解能。視覚的に脳スライスに脳領域を識別するために、（ii）の機能は、両方の彼らは、蛍光マーカーを発現時に脳領域が研究のために、特定のニューロンのための高い地域の特異性3を可能にします。 （ⅲ）（細胞内記録のための鋭いマイクロピペットで膜に穴を開けるとは対照的に）形質膜4のかなりの部分を開放することにより、細胞の細胞内空間へのアクセスを。今度は、これは、内部​​液を構成する特定のイオンの含有量または濃度が非常に分子標的を変更するか、細胞のメカニズムが異なる条件下で研究することができることができます。例えば、全細胞構成、任意の特定の薬理学的薬剤（ 例えば 、アンタゴニスト）を確立時に1が記録マイクロピペット（パッチピペット）溶液は、直接細胞質内に拡散し、そのputatに作用しに追加できます隣接するセル内のターゲット関数を変更することなく、細胞内標的をアイブ。さらに、シャープなマイクロピペットの記録と比較して、パッチクランプ電極の先端の大きな開口部は低抵抗、あまり競合ノイズ、ひいてはセル4の内側へのより良い電気的アクセスを提供します。しかし、ピペットチップでの大きな開口部はセル透析、および研究5,6の下にある生物学的現象の発現に重要であり得る細胞内分子機構のそれによって損失につながる可能性があることに注意してください。この場合には、シャープ電極記録は、より適切であり得ます。録音のこのタイプは、それによって細胞内空間と内部ピペット溶液との間のイオン交換を最大限に防止する、全細胞記録のために使用されるものよりもはるかに小さい孔を有するマイクロピペットを必要とします。 7月10日の学習を含む（急性または慢性）経験のいずれかの形、乱用11,1の薬物への曝露2 等ストレス13,14は 、特定の脳領域における神経機能の様々な態様を変化させることができます。これらの変化は、多くの場合、（数時間から数日）を開発するために時間が必要であるため、具体的な経験を受けた動物からの脳スライスにおける全細胞記録は、研究者は、これらの変更を識別することができます。基本的に、（すべてではない）、ニューロンの機能に関与する成分（ 例えば 、リガンド活性化イオンチャネル、電位依存性イオンチャンネル、神経伝達物質トランスポーター）、それによって脳回路の活動および行動の多くは、経験によって変化させることができる（経験に依存可塑性）10,15-17。神経細胞レベルでは、脳の回路の活動は、シナプスの間に一定の相互作用（ 例えば 、グルタミン酸伝達）および固有細胞の興奮因子（ 例えば 、axosomato樹状イオンチャネルから出：;カリウム、K +、ナトリウム、Na +およびカルシウム、 の Ca 2+ ）。 wholを使用して、特定の条件の下で電子細胞は、パッチクランプ電気生理学的手法、シナプス対固有興奮性の変化から、具体的発信信号の変化を単離することができます。 ほとんどの場合、シナプスの興奮は、全細胞電圧クランプ技術を用いて評価され 、この記録モードは、αアミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4- isoxazolepropionic酸受容体（によって媒介される、 例えば [イオン電流の測定を可能にしますAMPA受容体）および神経原形質膜を介してN-メチル-D-アスパラギン酸受容体（NMDA受容体）]のセット電圧で膜電位を保持しています。ここでは、実験者は、セシウム（Cs +）を含有する内部マイクロピペットソリューション、K +チャネル（キー固有興奮要因）の幅広いブロッカーを使用します。全細胞構成の確立時に、細胞内空間内のCs +の拡散は、K +チャンネルを遮断し、それによって、比較的効率的なスペースでクランプと事前の両方を許可します他の測定上の本質的な興奮の要因の影響をベント。不規則な形の細胞（ 例えば 、ニューロン）、および18,19アーバ広大で複雑 ​​な樹状で、特にニューロンを記録するときにスペースクランプの問題は、 すなわち 、電圧クランプに難易全細胞は、発生します。体細胞電圧クランプ不十分コントロールニューロンの樹状突起における電圧ので、研究対象の樹状電気信号の様々な態様は、樹状距離依存的に歪んでいます。 （人工脳脊髄液、ACSF）細胞外溶液に溶解し、このようなピクロトキシン（ガンマ-アミノ酪酸、GABA受容体拮抗薬）またはキヌレン酸（グルタミン酸受容体の広いブロッカー）などの薬理学的なツールと組み合わせることで、この技術は、グルタミン酸の測定を可能にしますそれぞれ受容体とGABA A R媒介電流。 対照的に、本質的な興奮性は、通常、電流 - クランプ記録モードで評価されます。電圧クランプ記録とは対照的に、この記録モードは、神経細胞膜を通って流れるイオン電流により誘導される膜電位の変化を測定することができます。典型的には、内因性の興奮性の変化は、両方のNa +及びK +チャネルを必要とする活動電位を生成するニューロンのための能力の変化を介して評価されます。電流クランプ記録を行う際したがって、マイクロピペットは、K +の代わりのCs +を含有する内部溶液で満たされています。グルタミン酸やGABA ACSFに溶解し、受容体媒介電流を遮断する薬理学的薬剤と組み合わせることで、この実験デザインは、シナプスの興奮の潜在的な変化によって汚染されることなく、ニューロンの発火に固有の要因（ 例えば 、K +チャネル）の寄与を測定することができます要因。 この記事では、トンの基本的な必要な手続きの手順を説明しますO（ⅰ）健康な脳スライスを準備します。 （ii）の全細胞構成を達成し、および（iii）シナプスおよび固有興奮性を評価するための基本的なパラメータを監視します。

<table><tbody><tr><td>アイソレーションパルススティミュラスジェネレーター</td><td>A.M.P.I</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>アイソレーションユニット (ISO-Flex)</td><td>A.M.P.I</td><td>ISO-Flex</td><td></td></tr><tr><td>コンピュータ制御アンプ&nbsp;</td><td>モレキュラーデバイス</td><td>マルチクランプ 700B</td><td></td></tr><tr><td>デジタルアクイジ</td><td>ションシステム モレキュラーデバイス</td><td>Digidata 1500</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX-51</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>サッター機器</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>チャンバー・インラインヒーター</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>ビブラトームスライサー</td><td>ライカ&nbsp;</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>成重</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>イメージングカメラ</td><td>Q イメージング</td><td>QIClick-F-M-12</td><td></td></tr><tr><td>成重ピペットプーラー PC-10</td><td>成重</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー</td><td>WPI</td><td>TW150F-3</td><td></td></tr><tr><td>スライスホールドダウン(ハープ)</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-0255</td><td></td></tr><tr><td>スライスチャンバー</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>非金属シリンジニードル</td><td>ワールドプレシジョン</td><td>MF28G67-5</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td><td>ナルゲン</td><td>176-0045</td><td></td></tr><tr><td>グルーガン</td><td>ホームデポ</td><td>各種</td><td></td></tr><tr><td>ガス分散管</td><td>エースグラス</td><td>様々な</td><td></td></tr><tr><td>斬首はさみ</td><td>ホームデポ</td><td>100649198</td><td></td></tr><tr><td>メスハンドル#3</td>世界の<td>精密機器</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>小さなまっすぐな鋭い先端はさみ</td><td>世界の精密機器</td><td>14218</td><td></td></tr><tr><td>血管カニューレーション鉗子&nbsp;</td><td>ワールドプレシジョンインスツルメン</td><td>ツ500453</td><td></td></tr><tr><td>湾曲止血鉗子</td><td>ワールドプレシジョンズ</td><td>501288</td><td></td></tr><tr><td>エコノミーピンセット #3</td><td>ワールドプレシジョンツ</td><td>501976-6</td><td></td></tr><tr><td>スパチュラ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14357Q</td><td></td></tr><tr><td>スパクーピングスパチュラ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>フィッシャーScientific</td><td>08-747B</td><td></td></tr><tr><td>濾紙</td><td>ラボデポ</td><td>CFP1-110</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Solutions</td></tr><tr><td colspan="4">Cs-グルコン酸内部溶液 (pH 7.2&ndash;7.3、280&ndash;290 mOsm)</td></tr><tr><td>D-グルコン酸 50%&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ/</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>セシウム-OH (CsOH) 50%&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich/各種</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>NaCl、2.8 mM</td><td>Sigma Aldrich/各種</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>HEPES、20 mM</td><td>Sigma Aldrich/各種</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA、0.4 mM</td><td>Sigma Aldrich/各種</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>テトラエチルアンモニウム-Cl、5 mM</td><td>Sigma Aldrich/各種</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>Na2GTP、0.3 mM</td><td>SigmaAldrich/various</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>MgATP, 2 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>A9187<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">K-グルコン酸内部溶液 (pH 7.2&ndash;7.3、280&ndash;290 mOsm)</td></tr><tr><td>K D-グルコン酸、120 mM</td><td>Sigma Aldrich/各種</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>KCl、20 mM</td><td>Sigma Aldrich/各種</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES、10 mM</td><td>Sigma Aldrich/各種</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA、0.2 mM</td><td>Sigma Aldrich/各種</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich/各種</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Na2GTP, 0.3 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>MgATP, 2 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Standard 人工脳脊髄液 (ACSF, 浸透圧 & 漸近; 300-310 mOsm)</td></tr><tr><td>KCl, 2.5 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 119 mM</td><td>Sigma Aldrich/さまざまな</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&#8226;H2O、1 mM</td><td>Sigma Aldrich/各種</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3, 26.2 mM</td><td>Sigma Aldrich/各種</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>グルコース、11 mM</td><td>Sigma Aldrich/各種</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7H2O、1.3 mM</td><td>Sigma Aldrich/各種</td><td>230391 CaCl</td><td></td></tr><tr><td>2-2H2O, 2.5 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">溶液調製に使用される追加化合物</td></tr><tr><td>KOH</td><td>各種</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キヌレン酸</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>K3375</td><td></td></tr></tbody></table>

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

全細胞パッチクランプ記録は、ニューロンの要部の電気的​​特性の研究を可能にする電気生理学的手法です。この構成では、マイクロピペットは、リーク電流を防止し、それによって以前に使用され、細胞内シャープ電極記録方法よりも正確なイオン電流の測定値を提供する細胞膜と密着しています。古典的には、全細胞記録は、細胞培養モデル、解離ニューロン、脳切片におけるニューロンを含む製剤の各種におけるニューロン上で実行し、完全な麻酔または覚醒動物であることができます。要約すると、この技術は非常に興奮性細胞のパッシブとアクティブの生物物理学的特性の理解に貢献してきました。この手法の主な利点は、特定のニューロンの機能またはCを変化させることができる方法の特定の操作（ 例えば 、薬理学的、実験誘起塑性）に関する情報を提供することですリアルタイムでhannels。また、原形質膜の重要な開口部は、特定の細胞内タンパク質の薬物、 例えば 、アゴニストまたはアンタゴニストを導入し、そして隣接セルにおけるそれらの機能を変更することなく、これらのターゲットを操作するための手段を提供し、自由に細胞質中に拡散するための内部ピペット溶液を可能にします。この記事では、脳切片におけるニューロンの生理学的に関連する文脈で、 すなわち 、比較的よく保存され、脳の回路内のニューロンを記録するという利点があるの準備を行って全細胞記録に焦点を当てます。具体的には、適切な薬理学と組み合わせたときに、この技術は、このような学習、乱用薬物への曝露、ストレスなどの経験、任意のタイプ以下の発生した特定の神経適応の同定を可能にする強力なツールです。要約すると、脳切片における全細胞パッチクランプ記録は、ex vivoで調製長期的な変化を測定する手段を提供します無傷の覚醒した動物で開発した神経細胞の機能インチ

温度、容易に実験者によって制御される因子は、イオンチャネル及び受容体の生物物理学的特性に影響を及ぼし、それによってシナプス後電流（のPSC）（EPSCと性IPSC）のスパイクを誘発するニューロンの能力の波形は図3 図4は、ニューロン発火とそれぞれ誘発EPSCs（eEPSCs）の傾きに対する温度の効果を示します。発火パターン（ 図3）（1 回目のスパイクに、すなわち 、待ち時間、数、周波数、および活動電位波形をスパイク）は、特定の電位依存性イオンチャネルのタイミングと協調開閉し（Na +、のCa 2によって形作られています+、およびK +）、温度に敏感なプロセス。平均スパイク数は温度に依存して増加する方法を図3に示す図 。実験条件でここに記載ことに注意してください（MSNs録音）ス...

このプロトコルは、全細胞パッチクランプ記録を実行するための基本的な処理手順を説明します。この技術は、神経細胞の電気的挙動の研究を可能にし、脳スライスに行ったときに、まだ比較的よく保存脳の回路に集積されているニューロンからの様々な神経機能の評価を可能にします。

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

本手順の目的は、新鮮に切片化した脳スライスを用いてホールセルパッチクランプ記録を行う方法を説明することです。この手法は、実験的な操作が特定の脳領域における特定のニューロンの活動をどのように変化させるかなど、神経科学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、覚醒状態の個体で生じたニューロン機能の長期的な変化を、ex vivoの調製物において同定するための手段を提供できることです。この手法は脳切片におけるニューロン機能の知見を得るために有用ですが、培養細胞やin vivoのニューロンなど、他の系にも適用可能です。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の学生であるFrancisco Garcia-Oscosが行います。まず、先端をカットしたプラスチック製転送ピペットを用いて、回復チャンバーから脳切片を1枚、静かに吸い上げます。転写ピペットを記録チャンバーに入れ、ピペットをゆっくりと絞って、スライスをチャンバー底面のカバーガラス上に押し出します。次に、顕微鏡の4倍対物レンズを用いて、目的の領域が記録チャンバーのちょうど中心に位置するようにスライスを配置します。目的の位置に固定できたら、スライスホールドダウン（ハープとしても知られる）を用いて脳スライスの位置を固定します。その後、40倍対物レンズに切り替え、レンズがチャンバー内のACSFに接触するまでゆっくりと下げます。次に、微動ネジを使用して組織に焦点を合わせます。組織のレベルで焦点が合ったところで、標的領域の細胞を観察します。次に、標的細胞を探します。記録用マイクロピペットの誘導を容易にするため、コンピューター画面上で標的をマークします。記録用マイクロピペットを配置するための十分なスペースを確保するため、対物レンズを上げます。このステップでは、1 mLシリンジ、非金属製マイクロシリンジ針、および専用フィルターを使用して、あらかじめ調製した内部液をマイクロピペットに充填します。マイクロピペット内に気泡がないことを確認してください。その後、溶液が塩化銀コート電極線に接触するように、マイクロピペットを電極ホルダーにセットします。マイクロピペットの周囲をコーンワッシャーで密閉するように、ピペットキャップを締めます。次に、ゴミが内部に混入するのを防ぐため、ピペットホルダーに接続した空気充填済みのシリンジで正圧をかけ、その後マイクロピペットをACSFに浸します。マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットをチャンバー内へ誘導し、浸漬した対物レンズのおよそ中心下に配置します。マイクロマニピュレーターを用いて中速から高速でマイクロピペットを移動させながら、コンピュータ画面上でマイクロピペットの位置を確認し、XY軸に沿って細胞の方向へ導きます。その間に、電圧ステップを印加してマイクロピペットの抵抗値を測定します。正圧をかけて、マイクロピペットを塞いでいる気泡やその他の異物を除去してください。マイクロピペットをクリアした後、電圧オフセットを行い、ピペット電流をゼロに下げます。顕微鏡の微動Cフォーカスホイールを使用し、マイクロピペットを徐々に下げながらフォーカスを合わせ始めます。マイクロピペットの先端がスライスに急激に刺入しないようにするため、必ず先にフォーカスを合わせ、その後マイクロピペットを焦点面にまで下げてください。マイクロピペットがスライスの表面に接触したら、マイクロマニピュレーターの速度を中低速モードに下げます。軽く正圧をかけ、経路上のデブリを除去します。次に、XYZコントロールノブを交互に操作するか、Z軸ノブの回転によりXZ軸の両方を変化させて斜めに接近し、細胞にアプローチします。マイクロピペットが細胞に十分に近づくと、細胞表面にディンプル（くぼみ）が現れます。ここで、ピペットホルダーの吸引チューブに接続されたチューブを通じて、弱く短時間の吸引を行い、シールを形成させます。ギガシールが形成される間、膜が破砕された際に急激な変化が起こるのを防ぐため、コンピュータ制御のアンプコマンダーを使用して、細胞の保持電位を生理学的な静止電位に調整してください。ギガシールが形成された後、キャパシタンスの高速または低速の補正を行います。ここでは、適用する吸引力が強すぎないようにすることが非常に重要です。さもないと、シールが確立される前に膜が破裂する可能性があります。シールが安定し、1 GΩ以上を維持している場合は、短時間で強力な吸引を行い、細胞質膜を破裂させます。吸引は短時間で行い、シール形成時にかけた圧力よりも強くする必要があります。これにより、膜を適切に破裂させ、安定したホールセル構成を実現します。膜試験においてセルモードに切り替え、入力抵抗、直列抵抗、膜容量などの細胞の異なるパラメータを確認します。ホールセル構成を達成した後、記録中もこれらのパラメータを継続的にモニタリングしてください。ここでは、単一の側坐核シェルMSNから得られた誘発EPSCスロープの例を示しています。温度を24℃から28℃、さらに32℃へと上昇させると、誘発EPSCの傾きが増大します。ここでは、誘発EPSCの振幅を-80 mVの電圧クランプモードで評価しています。直列抵抗が増加すると、誘発EPSCの振幅は減少します。ここでは、入力抵抗がニューロンのスパイク生成能に及ぼす影響を示す、2つのニューロンからのトレースの例を挙げます。ニューロンは電流クランプされ、-80 mVに保持されています。入力抵抗が増加すると、活動電位の数も同様に増加します。この手順を行う際は、健全な脳スライスを作成することが極めて重要であるということを忘れないでください。また、直列抵抗、入力抵抗、温度など、電気信号の波形に影響を与える可能性のあるパラメータを監視することも重要です。このビデオを視聴することで、脳スライスにおけるホールセル記録法の基本について十分に理解できるはずです。

whole-cell-patch-clamp-recordings-in-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、マウスの脳スライスにおける全細胞パッチクランプ技術を示しています。この技術により、マイクロピペットとニューロン膜との間に安定した接続が確立され、さらに破壊されてニューロンの健康と生理学的応答を研究するための全細胞構成が確立されます。...

パッチクランプ法による全細胞構成の確立

このビデオでは、樹状膜表面からのパッチクランプ記録の手法を示しています。これは、ドーパミン作動性ニューロンの樹状突起とその下にある電位依存性イオンチャネルの電気的特性を直接調べるのに役立ちます。...

脳スライスにおけるドーパミン作動性ニューロンの樹状突起からのパッチクランプ記録

このビデオでは、細い先の尖ったピペットを脳スライスの近くに配置して、ニューロン細胞とシールを形成する方法を示します。吸引により細胞膜が破壊されるため、電気生理学実験の電流測定を可能にする全細胞パッチクランプが形成されます。...

脳スライスにおける電気生理学的記録のための全細胞電圧クランプ構成の確立

このビデオは、全細胞パッチクランプ技術を使用してニューロンの発火パターンを分析するために、脊髄切片のゼラチノーサ(SG)ニューロンで電気生理学的記録を実行する手順を示しています。この方法により、脊髄のSGニューロンの刺激に対する神経応答の研究が可能になります。...

脊髄切片のゼラチノーサニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録

このビデオでは、脳スライスを固定し、ピペットを配置して全細胞構成を実現し、シナプス前ニューロンを刺激してシナプス後応答を記録することで、ニューロンの接続性を解明する手順を示しています。...

急性脳切片におけるニューロン接続のペアパッチクランプ記録

急性脳切片におけるシナプス結合ニューロンのパッチクランプ記録と同時細胞内バイオサイトン充填により、それらの構造的および機能的特性の相関分析が可能になります。このプロトコルの目的は、ニューロンのマイクロ回路からの電気生理学的記録とその後の形態学的分析の本質的な技術的ステップを説明することです。...

急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

このプロトコルは、最適化されたNの実装方法を示します-メチル-D-glucamine (NMDG) 保護回復法脳スライス標本。1 つのメディアの定式化は、確実にあらゆる年齢層の様々...

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

細胞内パッチクランプ記録は、樹状突起の機能的特性を調査する可能性を提供します。しかし、これらの微細な構造物は、直径が小さいため、簡単にはアクセスできません。ここで説明するプロトコルは、in...

黒質ドーパミンニューロンの細胞体樹状突起のドメインからの亜細胞パッチクランプ記録

スライス パッチ ・ クランプの技術学習によって誘発される可塑性を分析するため

ここでは、急性脳スライスにおける全細胞パッチ クランプ電気生理学を使用して機能的なシナプスの多様性を評価するためのプロトコルを提案する.

全細胞パッチク電気生理学を用いたシナプスの多様性の評価

ここでは、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)細胞の主要なモジュレーターであるキスペプチンニューロンを含む脳スライスに対して全細胞パッチクランプを実行するためのプロトコルを提示します。キスペプチンニューロンの活動に関する知識を加えることにより、この電気生理学的ツールは、過去20年間に神経内分泌学分野の重要な進歩の基礎として機能してきました。...

全細胞パッチクランプ記録の標的としての視床下部キスペプチンニューロン

学ぶ脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録法。神経細胞の電気的活動を測定し、脳回路内の神経機能を評価する技術です。神経科学における神経活動の理解に不可欠な手法を習得できます。

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

さらに動画を探す