Name: Kinomicプロファイリングと薬物反応検査のための3D人間バイオゲル培養システムと患者由来の神経膠芽腫細胞を用いた微小腫瘍の発生 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学ぶ 患者由来の神経膠芽腫細胞を用いた3D微小腫瘍培養システムによるハイスループット薬物検査とキノーム解析。個別化がん治療研究のための現実的な腫瘍モデル構築手法です。

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（：C.ウィリー、CA185712-01 PI）、脳腫瘍SPORE賞（PD：GYギレスピー、P20CA 151129から03）とSBIR契約（PI：R.シン、N43CO-2013から00026）NIH R21グラントによってサポートされています。

<ol><li>Ohgaki, H., Kleihues, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population-based+studies+on+incidence%2C+survival+rates%2C+and+genetic+alterations+in+astrocytic+and+oligodendroglial+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).</li>
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<li>Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+epidermal+growth+factor+receptor+signalling+networks+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma.</a> Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).</li>
<li>Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-microarray+analysis+of+brain+cancer%3A+molecular+classification+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).</li>
<li>Verhaak, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genomic+analysis+identifies+clinically+relevant+subtypes+of+glioblastoma+characterized+by+abnormalities+in+PDGFRA%2C+IDH1%2C+EGFR%2C+and+NF1%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1.</a> Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).</li>
<li>De Witt Hamer, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+profile+of+human+malignant+glioma+is+altered+early+in+primary+cell+culture+and+preserved+in+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids.</a> Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).</li>
<li>Shankavaram, U. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+indicates+orthotopic+xenograft+of+glioma+cell+lines+simulate+a+subclass+of+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma.</a> J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).</li>
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<li>Jarboe, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinomic+profiling+approach+identifies+Trk+as+a+novel+radiation+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother+Oncol%22%5BJournal%5D)">Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator.</a> Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).</li>
<li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Throughput+Kinomic+Profiling+of+Human+Clear+Cell+Renal+Cell+Carcinoma+Identifies+Kinase+Activity+Dependent+Molecular+Subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes.</a> PLoS One. 10 (9), 0139267(2015).</li>
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<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+personalized+medicine+with+a+three-dimensional+micro-scale+perfusion-based+two-chamber+tissue+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system.</a> Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).</li>
<li>Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glioma+cell+phenotype+in+3D+matrices+by+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).</li>
<li>Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+strategies+to+mimic+the+glioblastoma+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment.</a> Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).</li>
<li>Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Derived+Xenografts+as+a+Model+System+for+Radiation+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Radiat+Oncol%22%5BJournal%5D)">Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research.</a> Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).</li>
</ol>

R.S.とR.S.S.は、Vivo Biosciencesの従業員です。J.C.A.は、UABキノメ・コアから一部資金提供を受けています。

プロトコル内の重要なステップは、主に世代をmicrotumorに関連するだけでなく、薬剤投与とメンテナンス。 microtumorビーズが壊れやすく、簡単に引き裂かれたので、細心の注意をアッセイおよびメンテナンスの発達段階の両方で必要とされます。エラーがこれらのプロセスのいずれかの間に発生した場合は、実験的な解釈は、拡張機能や実験の不必要な繰り返しやデータのさえ排除を引き起こし、妥協することができます。 特にmicrotumor開発プロセスの修正およびトラブルシューティングは、microtumorビーズを作るのに使用するためのカスタム疎水性ツールの設計と製造が含まれていました。このツールは、微小腫瘍のより速く、より正確な製造を可能にします。さらに、微小腫瘍の維持に小さな修正は培地を交換し、細胞を投与するプロセスをスピードアップするのに役立ちました。これらの変更のいくつかが含まれるが、マルチチャネルを使用して、これらに限定されないました96ウェルプレートから培地を除去し、交換する電子ピペットと予備混合新鮮な薬剤ソリューションを投与し、対応する2ミリリットルの96ウェルプレートで2倍の...

最も一般的な原発頭蓋内悪性脳腫瘍は、グレードIII星状細胞腫およびグレードIVの多形性膠芽腫 （神経膠芽腫またはGBM）です。米国1-3でGBMに対する現在の治療と15ヶ月-これらの腫瘍は、12の間の中央値1年生存率と予後不良を提供しています。マルチモダリティ療法は、テモゾロミド（TMZ）およびキナーゼを標的とする薬剤を含む外科手術、放射線、および化学療法が含まれます。キナーゼシグナル伝達は、頻繁に上皮成長因子受容体（EGFR）、血小板由来増殖因子受容体（PDGFR）の増加、シグナリング、増加したホスファチジルイノシトール3キナーゼ（PI3K）とにおける増幅を有する腫瘍のサブセットまたは活性化変異を含む、GBMで調節不全されます血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、ならびに他のキ ​​ナーゼ駆動経路4-6を介して血管新生シグナル伝達を支援する腫瘍。 in vitroおよびin vivoモデルで現在は頻繁にこれらの代表的な変化を失います&lt;SUP&gt; 7。さらに、遺伝的プロファイリングは、遺伝的およびエピジェネティックな変化は常に標的剤、ほとんどのキナーゼが直接作用するタンパク質活性のレベルで変化を予測せず、他の作用機序を持つ治療法がどこに作用することができるという事実を反映している可能性が予想される利益を提供していません間接的に。 無限に継代することができる伝統的な不死化細胞株は、長いによるメンテナンスや再現が容易に薬物検査のための標準となっています。しかし、このモデルは、高速、元の腫瘍から大きく異なる細胞を増殖させるための選択の高い栄養素（人工）成長環境に苦しんでいます。このように、患者に存在するように、より複雑な腫瘍生物系を反映する、より現実的なモデル系を開発することにかなりの関心が集まっています。腫瘍異種移植片は、マウスで増殖させた原発腫瘍（「xenoline、「患者由来の異種移植片またはPDX）専らから直接開発しますそれらは、より確実に臨床的成功を予測することが8以上の反射生物学にもかかわらず感じられるようにデは、特に癌治療の設定で複数の反射モデル系は、これらのモデルは、高価であり、確立し、維持するのが困難です。さらに、それらは、ハイスループット試験に適していません。より良い、より正確に原発腫瘍の分子変化を反映して、遺伝子マーカーの代理、キナーゼ活性の直接的尺度を使用して、これらのモデルをしないプロファイルおよびテストするために生物学的モデルを開発する必要性が、明らかです。 よく、二次元（2D）単層培養とは異なり、3次元または多分析モデルは、より生理学的に関連するエンドポイント9-11を提供することができることが認識されます。一般的な3D培養手法は、マトリックスコートしたマイクロキャリアおよび細胞スフェロイド形成を伴います。腫瘍スフェロイドは、スピナーフラスコのpHEMA板と懸滴技術を使用して細胞凝集を介して生成することができます。トンの制限事項HESEアプローチは、次のとおりです。安定したスフェロイドを形成するためにいくつかの細胞のための不能、混合細胞型と成長と課題の変動を。あるいは、合成（ハイドロゲル、ポリマー）およびマウス肉腫から動物由来エンゲル・ホルム-スウォーム（EHS）行列多く、ウシコラーゲン）行列は3D培養のために開発されてきた12-14を研究しています。マウスEHSマトリックスは、広く使用されるが、in vitroおよびin vivo 15細胞の増殖および分化を促進することが知られています。 3D腫瘍生物学を複製するためには、人間のバイオマトリックスシステムは、博士のRaj Singh氏らによって開発された。16。 天然の、成長因子を含まないヒトのバイオゲルは、複数の細胞型の長期培養をサポートする3D培養の足場（ビーズ、ディスク）を可能にします。 3Dヒトバイオゲル培養設計のシリーズは、腫瘍増殖、接着、血管新生および浸潤特性を研究するための確立されています。利点と人間のバイオゲルのプロパティ共通に比べて、マウスEHSゲルは、表1および表2にまとめます。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> ソース： </td><td> 人間Amnions（プールされた組織） 病原体を含まない、IRB-免除/承認</td></tr><tr><td> ECMの性質： </td><td> 非変性バイオゲル （GLP-生産） </td></tr><tr><td> キー コンポーネント： </td><td> COL-I（38％）、ラミニン（22％）、COL-IV（20％）、COL-III（7％）、エンタクチンおよびHSPG（&lt;3％） </td></tr><tr><td> GF-フリー： </td><td> 検出不可能 EGF、FGF、TGF、VEGF、PDGF（非血管新生性、非毒性） </td></tr></tbody></table> 表1：一般的なEHSゲルと比較して、ヒトバイオゲルのプロパティ。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-wiTH-next.within-ページ= &quot;常に&quot;&gt; <tbody><tr><td> 人間バイオゲル </td><td> EHSゲル </td></tr><tr><td>人間の自然な行列</td><td>再構成されたマウスの行列</td></tr><tr><td>制御された細胞増殖＆分化</td><td>細胞増殖＆分化を促進することができます</td></tr><tr><td>生理学的遺伝子発現</td><td>可変遺伝子発現</td></tr><tr><td> 3D組織様培養モデル</td><td>プレートベース培養モデル</td></tr></tbody></table> 表2：一般的なEHSゲルと比較して、ヒトバイオゲルの利点。

<table><tbody><tr><td>コラゲナーゼ-I&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CO130</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン EDTA (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>15400-054&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>1x 最終濃度</td></tr><tr><td>B-27 サプリメント ビタミン A なし</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td>1x 最終濃度</td></tr><tr><td>組換えヒト FGF-basic</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0266</td><td>10 ng/ml 最終濃度</td></tr><tr><td>組換えヒトEGF</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>PGH0315 10 ng/ml 最終濃度</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Corning Cellgro Mediatech</td><td>25-005-CI</td><td>2 mM 最終濃度</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Omega Scientific</td><td>FG-70</td><td>2.5 &micro;g/ml 最終濃度</td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>オメガサイエンティフィック</td><td>PS-20</td><td>100 U/ml ペニシリン G, 100 & マイクロ;g/ml ストレプトマイシン最終濃度</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td>50 ng/ml 最終濃度</td></tr><tr><td>MTT</td><td>Life Technologies</td><td>M6494</td><td>を PBS で 5 mg/ml まで調製し、滅菌ろ過、ウェル</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher</td><td>BP166</td> で 1 mg/mL を <td>MTT 溶解バッファー用に調製し、0.01&nbsp;M HCl、5%</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>A144SI-212</td> 中 <td>MTT 溶解バッファー用、0.01&nbsp;M (SDS 付き)、5 mM (井戸内</td></tr>) <tr><td>Calcein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C1430</td> 1 <td>mM (DMSO ストック)、2&nbsp;&マイクロ;PBS染色液中のM、1&nbsp;&マイクロ;Mはよく</td></tr><tr><td>止まった's プロテインホスファターゼ阻害剤カクテル&nbsp;</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>78420</td><td>1:100 比率 (MPER) &nbsp;</td></tr><tr><td>Halt's Protein Protease Inhibitor&nbsp;</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>87786</td><td>1:100 比 in MPER</td></tr><tr><td>哺乳類タンパク質抽出試薬 (MPER)</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>PI78501</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>BP231</td> カル<td>セイン AM & 化合物</td></tr><tr><td>Ca/Mg ロンザ</td><td></td><td>を含まないリン酸緩衝生理食塩水の溶解17-517Q</td><td>MiliQ 超純水で 1x に希釈し、滅菌ろ過 (細胞培養用)</td></tr> <tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered 生理食塩水 Ca/Mg</td><td>Corning Cellgro Mediatech</td><td>20-030-CV</td> で <td>1x に希釈 MiliQ 超純水 (事前固定洗浄用)</td></tr><tr><td>10% 中性緩衝ホルマリン</td><td>プロトコル</td><td>032-060</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルー</td><td>ピアス ThermoScientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>高密度 Hubiogel</td><td>Vivo Biosciences</td><td>HDHG-5</td><td></td></tr><tr><td>Halt's Protein Phosphatase Inhibitor</td><td>Pierce</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Halt's Protein Protease</td><td>Inhibitor Pierce</td><td>87786</td><td></td></tr><tr><td>哺乳類タンパク質抽出試薬 (MPER)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78501</td><td></td></tr><tr><td>Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip</td><td>PamGene</td><td>86312</td><td></td></tr><tr><td>PTKキナーゼバッファー</td><td>PamGene</td><td>36000</td><td>300 &micro;l 2.7&nbsp;ml dH2O、PTK試薬キット用カタログ番号</td></tr><tr><td>ATP</td><td>PamGene</td><td>36000</td><td>PTK試薬キット用カタログ番号</td></tr><tr><td>PY20- FITC標識抗体</td><td>PamGene</td><td>36000</td><td>PTK試薬キット用カタログ番号</td></tr><tr><td>PTK添加剤</td><td>PamGene</td><td>32114</td><td></td></tr><tr><td>PTK-MM1チューブ(10x BSA)</td><td>PamGene</td><td>36000</td><td>PTK試薬キット</td></tr><tr><td>用カタログ番号セリン/スレオニンキナーゼ(STK)アレイプロファイリングチップ</td><td>PamGene</td><td>87102</td><td></td></tr><tr><td>STKキナーゼバッファー</td><td>PamGene</td><td>32205</td><td>STK試薬キット用カタログ番号</td></tr><tr><td>STK一次抗体ミックス(DMABチューブ)</td><td>PamGene</td><td>32205</td><td>STK試薬キット用カタログ番号</td></tr><tr><td>FITC-標識二次抗体</td><td>PamGene</td><td>32203</td><td></td></tr><tr><td>STK-MM1チューブ(100x BSA)</td><td>PamGene</td><td>32205</td><td>STK試薬キット用カタログ番号</td></tr><tr><td>STK抗体バッファー</td><td>PamGene</td><td>32205</td><td>カタログ番号 STK試薬キット用</td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#11 ブレード、滅菌済み</td><td>フィッシャー</td><td>3120030</td><td></td></tr><tr><td>#3 メスハンドル、滅菌済み</td><td>フィッシャー</td><td>08-913-5</td><td></td></tr><tr><td>100 mm ガラス製シャーレ</td><td>フィッシャー</td><td>08-748D</td><td></td></tr><tr><td>半湾曲鉗子</td><td>フィ</td><td>ッシャー12-460-318</td><td></td></tr><tr><td>トリプシンフラスコ</td><td>フィ</td><td>ッシャー10-042-12B</td><td></td></tr><tr><td>マグネチックスターラー</td><td>フィ</td><td>ッシャー14-490-200</td><td></td></tr><tr><td>3/4 "攪拌子</td><td>フィ</td><td>ッシャー14-512-125B-D</td><td></td></tr><tr><td>細胞ストレーナー&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>#352340</td><td></td></tr><tr><td>B-D 50 ml 遠心分離管</td><td>Fisher</td><td>#352098</td><td></td></tr><tr><td>PamStation 12</td><td>PamGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioNavigator 6.0 キノミクス解析ソフトウェア&nbsp;</td><td>PamGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evolve キナーゼアッセイソフトウェア</td><td>PamGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UpKin アプリソフトウェア (アップストリームキナーゼ予測)</td><td>PamGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>ロータリー細胞培養システム (RCCS)</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-D</td><td>10 ml ディスポーザブル HARV</td></tr></tbody></table>

kinomicプロファイリングと薬物反応検査のための3d人間バイオゲル培養システムと患者由来の神経膠芽腫細胞を用いた微小腫瘍の発生

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

患者由来の異種移植片の使用は、がんの生物学と薬物反応性に関する重要な洞察を提供しました。しかし、それらは時間と費用がかかり、労働集約的です。これらの障害を克服するために、多くの研究グループががん細胞のスフェロイド培養に目を向けています。腫瘍スフェロイドまたは凝集体は有用ですが、in vivoで見られるような細胞-マトリックス相互作用を複製しません。そのため、細胞外マトリックスの足場を利用した3次元(3D)培養アプローチは、より現実的な研究モデルシステムを提供します。皮下または頭蓋内の異種移植片から開始して、腫瘍組織は癌幹細胞ニューロスフェアに似た単一細胞懸濁液に解離します。その後、これらの細胞をヒト由来の細胞外マトリックスである3Dヒトバイオゲルに埋め込み、多数の微小腫瘍を作製します。興味深いことに、微小腫瘍は高い生存率で約1ヶ月間培養することができ、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)などの標準的な細胞毒性アッセイを用いた薬物反応試験や、カルセイン-AMを用いた生細胞イメージングに使用することができます。さらに、免疫組織化学によって分析したり、アレイベースのハイスループットキノミクスプロファイリングなどの分子プロファイリングのために回収することもできます(これについてもここで詳しく説明します)。したがって、3D微小腫瘍は、従来のアプローチよりもin vivo腫瘍生物学をより密接に再現できる、汎用性の高いハイスループットモデルシステムを表しています。

我々は、3Dバイオゲル培養系は、複数の細胞型の長期的成長と機能をサポートしていることを示しています。この共同プロジェクトでは、患者由来のGBM xenolines（PDX）は微小腫瘍の数百を製造するために使用されています。解離した細胞（3×10 5）またはニューロスフェア（40 - 50）バイオゲルビーズ（2mm）に包埋し、迅速なゲル化した後、それらはNB-媒体充填カスタムバイオリアクター中で培養されます。細胞生存性（カルセインAM）、増殖プロフィール（MTT）、およびkinomicアクティビティアレイベースの分析を測定しました。 PDXの微小腫瘍は&gt; 3週間の多細胞組織と高い生存性（&gt; 80％）を維持しました。我々は、このin vivoでの様生物学は、3D細胞-マトリックスアーキテクチャのメンテナンス（2Dまたはスフェロイド文化を持つことはできません）が原因であると考えています。また、3D腫瘍はおそらく、コラーゲンI 14がないため、脆弱なゼラチン状タンパク質足場と製造が困難であることが観察されま...

患者由来の多形性膠芽腫の異種移植片は、3Dヒトバイオゲル培養システムを使用して生きた微小腫瘍に小型化することができます。このin vivo様3D腫瘍アッセイは、薬物反応試験やキノミクス解析を含む分子プロファイリングに適しています。

Kinomicプロファイリングと薬物反応検査のための3D人間バイオゲル培養システムと患者由来の神経膠芽腫細胞を用いた微小腫瘍の発生

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

この患者由来の膠芽腫（グリオブラストーマ）3Dマイクロ腫瘍培養システムの全体的な目的は、キノーム解析などの対応する分子プロファイリングアッセイを用いて、ハイスループットな薬剤試験を可能にすることです。この手法は、「なぜ特定の治療法が、ある患者の腫瘍には有効であるにもかかわらず、別の患者には有効ではないのか」という、がん研究分野における重要な疑問への回答に寄与します。本手法の主な利点は、治療試験に適した、小型ながらも現実的な腫瘍培養システムを提供できる点にあります。一般に、この手法に不慣れな人は、患者由来ゼノグラフト（PDX）細胞の取り扱いが、確立された不死化腫瘍細胞の取り扱いとは異なるため、習得に苦労します。これは、PDX細胞が脆弱であり、培養条件の変化に敏感であるためです。マイクロ腫瘍の作製ステップは、その手法が独特かつ複雑であり、記述だけでは習得が困難であるため、視覚的なデモンストレーションによる解説が極めて重要となります。腫瘍の分散手順を実演するのは、私の研究室のシニアテクニシャン兼ラボマネージャーであるCatherine Langfordです。マイクロ腫瘍の作製および薬剤投与の手順を実演するのは、私の研究室のテクニシャンのRachael Shevinです。ピンセットを用いて、腹壁と皮膚から腫瘍塊を慎重に剥離し、腫瘍塊を滅菌済みのガラス製ペトリ皿に移します。次に、11番ブレードの滅菌メスと滅菌セミカーブ鉗子を用いて、腫瘍組織から壊死組織および膜状の宿主結合組織を除去します。洗浄済みの腫瘍を滅菌RPMIで3〜5回洗浄して過剰な血液を取り除き、洗浄液を捨てる際はディッシュをゆっくりと傾けます。最後の洗浄後、2本の11番メスブレードを用いて腫瘍を細かく刻みます。次に、滅菌済みの半曲鑷子を用いて、腫瘍を酵素溶液の入った解離チューブに移します。チューブを細胞解離機にセットし、「Tumor 2」プログラムを選択します。「Start」をクリックして、解離機を37秒間作動させます。次に、チューブをローテーターに移し、37 °Cのインキュベーター内で40分間静置します。インキュベーション終了後、チューブをディソシエーターに戻し、Tumor 3プログラムを37秒間実行します。プログラム終了後、細胞を遠心分離し、ペレットを10 mLの無血清RPMIに緩やかに混ぜ合わせて再懸濁します。次に、細胞を新しい50 milliliterチューブに入れた40 micronのセルストレーナーにゆっくりと負荷し、懸濁液を重力でフィルターに滴下させます。細胞を新しく追加するたびに、セルストレーナーのタブをそっと持ち上げ、ストレーナーとチューブ間の真空状態を解消して、懸濁した細胞がメッシュを自由に通過できるようにします。すべての細胞のろ過が完了したら、単一細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを10 millilitersの完全 Neurobasal Mediumで再懸濁します。次に、トリパンブルー排除法により生存細胞数を測定し、細胞を氷上に置きます。マイクロ腫瘍を作成するため、解離させた患者由来グリオブラストーマ・ゼノライン細胞を遠心分離し、沈殿物をFBS 2 µLあたり50,000個の細胞になるように再懸濁します。続いて、氷冷した高密度ヒトバイオゲルを用い、細胞とバイオゲルの比率が1:4になるように細胞を希釈します。次に、電子マルチチャンネルピペットを使用して、疎水性コーティングを施した96ピン鋼製プレートの各ピンに、細胞混合液を10 µLずつ分注します。細胞、培地、およびバイオゲルの混合時に気泡が入らないようにすることが重要ですが、同時に、ヒューマンバイオゲルがピン上で凝固し始める前にマイクロ腫瘍を形成できるよう、迅速かつ効率的に作業を行う必要があります。すべてのマイクロ腫瘍をプレートに分注した後、3D腫瘍を組織培養インキュベーターに20分間移し、腫瘍ビーズをゲル化させます。インキュベーション終了後、マイクロ腫瘍を完全Neurobasal Mediumを含む10 centimeterの培養ディッシュに移し、インキュベーターに戻します。1～2日後、広口のディスペンシングピペットを使用して、マイクロ腫瘍を1ウェルあたり50 microlitersのNeurobasal Mediumを含む96ウェル培養プレートの各ウェルに移し、さらに各ウェルに適切な投与溶液50 microlitersを加えます。処理したマイクロ腫瘍を組織培養インキュベーター内で1～14日間維持し、週に2回、新鮮な培地と薬剤溶液で給餌します。微小腫瘍細胞の形態を評価するため、培養1日目、7日目、および14日目に、組織培養インキュベーター内で1ウェルあたり1 $\mu\text{M}$に希釈した新鮮なCalcein-AMを用いて微小腫瘍を20分間染色します。その後、蛍光顕微鏡を用いて、2倍、4倍、および10倍の倍率で腫瘍を撮影します。微小腫瘍の増殖を評価するため、1日目、7日目、および14日目に、組織培養インキュベーター内で新鮮に調製したMTT 20 $\mu\text{L}$を培養細胞に添加し、2時間処理します。インキュベーション終了後、培養ウェルの容量と同量（1:1の比率）で、調製したばかりの10% SDS溶解バッファーを用いて腫瘍を溶解し、プレートを密閉します。次に、溶解バッファー中のマイクロ腫瘍を37 °Cで一晩インキュベートし、翌朝、マルチプレートリーダーを用いて570 nmの吸光度を測定します。前述したCalcein-AMによる生細胞イメージングを通じて、マイクロ腫瘍の細胞増殖能および生存率と、これらの機能に対する薬物療法の効果を評価することができます。観察された通り、未処理のマイクロ腫瘍および実験的薬剤治療に対して既知の耐性を持つマイクロ腫瘍は、2週間の培養期間にわたって持続的な成長パターンを示します。しかしながら、これらのTMZ感受性腫瘍細胞は、MTTアッセイにおいて、最高濃度のTMZ処理に反応して、培養終了時に細胞増殖の抑制を示します。興味深いことに、TMZ耐性マイクロ腫瘍におけるキナーゼシグナリングでは、10 micromolarのTMZ処理後に強度が著しく変化した多くのペプチドが明らかになりました。実際に、この代表的な実験において、これらの変化したキノームプロファイルを上流キナーゼ予測ソフトウェアを用いて解析したところ、SYK、LCK、CTKチロシンキナーゼおよび多くのセリン/スレオニンキナーゼの強度に特異的な変化が認められました。これは、腫瘍治療への耐性を克服するのに役立つ可能性のある、新たな治療標的を示唆しています。習得すれば、腫瘍の分散操作は適切に行えば2時間で完了できます。また、マイクロ腫瘍の作製と薬剤投与の手法は、適切に行えば合計で3時間で完了できます。将来的には、このモデルシステムをプロバンド形式のアバターシステムとして利用することが考えられます。これにより、患者の腫瘍を既存の患者由来マイクロ腫瘍ライブラリと分子レベルで照合し、臨床医に最適な治療法の選択を提示することが可能になります。

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この動画では、3次元ヒトバイオゲルを用いて患者由来の腫瘍細胞から微小腫瘍を作製しています。これらの微小腫瘍は、in...

微小腫瘍の生成:薬物治療に対する反応を解析するための3D微小腫瘍を培養するIn vitro培養技術

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学ぶ 患者由来の神経膠芽腫細胞を用いた3D微小腫瘍培養システムによるハイスループット薬物検査とキノーム解析。個別化がん治療研究のための現実的な腫瘍モデル構築手法です。

Kinomicプロファイリングと薬物反応検査のための3D人間バイオゲル培養システムと患者由来の神経膠芽腫細胞を用いた微小腫瘍の発生

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