Name: ザ ex vivoで文化とパターン認識受容体刺激 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学ぶマウス小腸オルガノイドの採取と培養、PAMPsやListeria monocytogenes処理による遺伝子発現解析とタンパク質正規化技術。腸管免疫と宿主病原体相互作用の研究に有用です。

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技術的な議論について、Dr. Sheryl Coutermarsh-Ott、Dylan McDaniel、Bettina Heidに感謝します。著者らは、Caco-2細胞を提供してくれたNanda Nanthakumar博士に感謝します。著者はまた、バージニア工科大学の多文化アカデミックオポチュニティプログラム(MAOP)に感謝します。この研究は、National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award K01DK092355(ICCAに)の支援を受けました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

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<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
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<li>Zhang, Y. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella-infected+crypt-derived+intestinal+organoid+culture+system+for+host-bacterial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions.</a> Physiol Rep. 2 (9), (2014).</li>
<li>Grabinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+intestinal+crypt+organoids+as+a+model+system+for+assessing+cell+death+induction+in+intestinal+epithelial+cells+and+enteropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy.</a> Cell Death Dis. 5, 1228(2014).</li>
<li>Slater, T. F., Sawyer, B., Straeuli, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+Succinate-Tetrazolium+Reductase+Systems.+Iii.+Points+of+Coupling+of+Four+Different+Tetrazolium+Salts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Studies on Succinate-Tetrazolium Reductase Systems. Iii. Points of Coupling of Four Different Tetrazolium Salts.</a> Biochim Biophys Acta. 77, 383-393 (1963).</li>
<li>Parry, M. F., Neu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+N-acetylcysteine+on+antibiotic+activity+and+bacterial+growth+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of N-acetylcysteine on antibiotic activity and bacterial growth in vitro.</a> J Clin Microbiol. 5 (1), 58-61 (1977).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

腸オルガノイドの文化やメンテナンスは、適切な組織培養技術を用いて任意の個人によって習得することが可能な手順です。そこより、従来の単層で増殖する細胞と比較した場合、微妙な継代しているが、これらの微妙な違いを克服することは困難ではありません。この方法の重要なステップは、最適な播種のために十分に高い密度にオルガノイドを成長させることができるという伴います。一般的に細胞株を用いて達成することができる大規模な播種密度は実用的ではないとして実験はオルガノイドでスケールダウンする必要があります。複数の処置群が存在する場合に特に顕著になります。 このプロトコルは、異なる細菌の様々な腸上皮の宿主 - 病原体相互作用を研究するためのステップバイステップの方法を提供することを目的とします ウイルス、および真菌病原体だけでなく、正規化に関して、このシステムを使用してアドレスの難しさ。レポートはそのdescribご利用いただけます電子細菌性病原体サルモネラと腸オルガノイドの相互作用、まだ分泌されたサイトカイン13を測定する...

収穫する能力と文化の一次オルガノイドは、小腸、大腸、膵臓、肝臓および脳のために説明し、組織の生物学1-5のためのより多くの生理学的に代表的な現象の理解に密接エキサイティングな進歩ですされています。小腸オルガノイドの文化とメンテナンスを記述する最初の方法は、佐藤らによって報告された。ハンスClevers 1の研究室の外に。一次腸上皮細胞のこの方法、収穫培養前には、上皮細胞の成長を維持する上で制限され、無効であることが判明しました。方法は、最終的に混在し、一次線維芽細胞6の成長につながるようなコラゲナーゼおよびディスパーゼなどの酵素、とのインキュベーションを介した組織の解離が含まれていました。これらの条件は、時間は、上皮細胞の培養を維持するに制限されることになります。上皮細胞が起因してアポトーシスを入力しますようのない上皮細胞ニッチに最小限のは、形成するであろう適切な成長因子又は接触の完全性の損失の欠如は、anokis 7と呼ばれます。 3D-オルガノイド培養システムの出現は、持続的な文化1に腸の細胞型のスペクトルを含む培養一次腸細胞への方法を提供してきました。これらの上皮オルガノイドは、それらがいくつかの分化した細胞で構成されていることである細胞株上の利点を有し、より良いそれらはインビボ 8 に由来する器官を模倣します。最終的に「皿の中のミニ腸を成長させる」ためのプロセスは、様々な刺激下での腸上皮の応答を評価するための貴重なツールであることが証明されています。これらの分子パターンは、ホストと微生物9の両方からの多様な応答を調節することができるように微生物病原体関連分子パターン（のPAMPs）との一次腸細胞の相互作用を調査することは、免疫学の分野に関連します。研究者らは今、マウスオルガノイドとこれらの相互作用を探るが、彼らすることができますだけでなく、ウェル2のようなヒトから培養することができます。この技術は飛躍的にオーダーメイド医療を変える可能性を持っており、この技術は、近い将来に可能になることを進歩について推測したくなります。 この方法の全体的な目標は、種々の刺激で文化、拡張のためのプロトコル、および腸オルガノイドの治療を提供することにあります。このような刺激は、最終的なワクチン、細菌のPAMP、生きた病原体、胃腸（GI）癌治療の範囲とすることができます。マウスの腸オルガノイドの単離および培養は、佐藤らから適応されています。元のメソッドから若干のずれがありますが、このプロトコルを以下のとき、オルガノイド培養される最終製品がまだ達成されています。この方法は、セルnに基づいて分析を行う際に考慮されなければならない不均一なセル構造を操作するとき、適切な正規化のための適切な手法を説明に焦点を当てていますアンバー。

<table><tbody><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>アトランタバイオロジカルズ</td><td>S11050</td><td>(セクション1,3,6)または同等のブランド</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR遠心分離</td><td>機サーモ</td><td></td><td>(セクション1,3)</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GEヘルスケア</td><td>Sh30243.01</td><td>(セクション1,6)Caco-2およびHEK293 Rspondin1細胞</td></tr><tr><td>HEK293T-Rspondin1分泌細胞株</td><td></td><td></td><td>用(セクション1)Kim, K.A. et al. より記述および修正GeneCopoeiaからカスタムオーダーおよび購入したpReceiver-Lv105バックボーンにクローニングされたRSPO1(NM_138683)ORF cDNAを含むレンチウイルス粒子。</td></tr><tr><td>50 mlコニカルチューブ</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>(セクション1)または同等のブランド</td></tr><tr><td>T-175フラスコ</td><td>コーニング</td><td>431079</td><td>(セクション1)または同等のブランド&nbsp;</td></tr><tr><td>タンパク質マトリックス</td><td>コーニング</td><td>356231</td><td>(セクション2,3,4,5,6)マトリゲル成長因子の減少&nbsp;</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's (DPBS)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30264.01</td><td>(Section 2,3)</td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td>(セクション2,3)アドバンスドDMEM / F12</td></tr>コー<tr><td>ニング24ウェルTCプレート</td><td>コーニング</td><td>3524</td><td>(セクション2)</td></tr><tr><td>N2サプリメント100x&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ<td>17502-048</td><td>(セクション2)</td></tr><tr><td>ビタミンAなしのB27 50倍&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td>12587-010&nbsp;</td><td>(セクション2)</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>(セクション2)</td></tr><tr><td>グルタミンサプリメント(Glutamax)</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>(セクション2)高度なDMEM / F12</td></tr><tr><td>HEPES(1 M)</td>と組み合わせることができます<td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>(セクション2)高度なDMEM / F12と組み合わせることができます&nbsp;</td></tr><tr><td>10ml Serological Pipet</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td>(セクション 2) または同等のブランド</td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>(セクション 2) ストック = 100 mg/ml</td></tr><tr><td>N-アセチル-L-システイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>(セクション 2) ストック = 1M</td></tr><tr><td>組換えマウス EGF</td><td>バイオレジェンド</td><td>585608</td><td>(セクション 2) ストック = 500 mg/ml</td></tr><tr><td>ロッカー 可変</td><td>バイオエクスプレ</td><td></td><td>(セクション3)</td></tr><tr><td>解剖ハサミ</td><td></td><td></td><td>(セクション3)</td></tr><tr><td>鉗子</td><td></td><td></td><td>(セクション3)</td></tr><tr><td>スライド</td><td></td><td></td>ガラス<td>(セクション3)</td></tr><tr><td>解剖ピンセット</td><td></td><td></td><td>(セクション3)</td></tr><tr><td>25ml血清ピペット</td><td>ファルコン</td><td></td><td>(セクション3)</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9821</td><td>(セクション3) 0.5Mまたは代替TCグレードのEDTA</td></tr><tr><td>滅菌ペトリ皿 100mm x 15mm</td><td>フィッシャー</td><td>FB0875712</td><td>(セクション3) または等サイズのTCディッシュ</td></tr><tr><td>1mlシリンジ</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>309659</td><td>(セクション4)</td></tr><tr><td>精密グライドニードル</td><td>ベクトン・ディッキンソン</td><td>305120</td><td>(セクション4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm)</td></tr>枯<tr><td>草菌由来の鞭</td>毛<td>Invivogen</td><td>tlrl-bsfla&nbsp;</td><td>(セクション5,6)</td></tr><tr><td>リステリア菌 monocytogenes</td><td>ATCC</td><td>19115</td><td>(Section 5,6)&nbsp;(マレー&nbsp;et&nbsp;al.)&nbsp;</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td>(Section 5,6)または同等のブランド</td></tr><tr><td>BBL Brain Heart Infusion Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>211065</td><td>(Section 5)</td></tr><tr><td>Bacto Brain Heart Infusion</td><td>Becton Dickinson</td><td>237500</td><td>(Section 5)</td></tr><tr><td>Caco-2</td><td>ATCC</td><td>HTB-37</td><td>(Section 6)</td></tr><tr><td>Trypsin&nbsp;</td><td>gibco</td><td>25200056</td><td>(セクション6)</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィ</td><td>ッシャーA412-4</td><td>(セクション6)</td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Molecuar Devices</td><td></td><td>(セクション6)</td></tr><tr><td>96ウェルアッセイプレート</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>(セクション6)ブラックプレート、クリアボトムTC処理</td></tr><tr><td>核染色色素</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>(セクション6)Hoechst 33342</td></tr><tr><td>T-75フラスコ</td><td>コーニング</td><td>430641</td><td>(セクション6)または同等のブランド</td></tr><tr><td>15 mlコニカルチューブ</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>(セクション1,3)または同等のブランド</td></tr><tr><td>1.7 mlポリプロピレンチューブ</td><td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td>または同等のブランド</td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep</td><td>Zymo Research</td><td>R1054</td><td>または同等のブランド</td></tr><tr><td>TNF-alpha&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm</td><td>00443260_g1 Taqman遺伝子発現アッセイキット</td></tr><tr><td>IL-6&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>(Mm 00446190_m1</td><td>Taqman遺伝子発現アッセイキット</td></tr><tr><td>IL-1beta</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm</td><td>00434228_m1 Taqman遺伝子発現アッセイキット</td></tr><tr><td>IL-18</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00434225_m1</td><td>Taqman遺伝子発現アッセイキット</td></tr><tr><td>18s</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs 99999901_s1</td><td>Taqman遺伝子発現アッセイキット</td></tr><tr><td>7500 高速リアルタイムPCRシステム</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nexus Gradient Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>大容量cDNA逆転写キット</td><td>Life Technologies/Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL</td><td>Life Technologies/Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4346907 組換えマウス R-Spondin 1 タンパク質</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ3474-RS-050</td><td>500 ng / ml</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>C7559</td><td></td></tr></tbody></table>

ザ<em&gt; ex vivoで</emマウス腸オルガノイドの&gt;文化とパターン認識受容体刺激

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

主要腸オルガノイドを大幅粘膜免疫学の分野に影響を与える可能性があり、貴重なモデル系です。しかし、オルガノイド成長特性の複雑さは、研究者のための重要な注意事項を運びます。具体的には、各個々のオルガノイドの成長パターンは非常に可変であり、培養中の上皮細胞の異種集団を作成します。このような警告と、一般的な組織培養の実践は、単にによる細胞構造の複雑さオルガノイドシステムに適用することはできません。いくつかの正規化技術が適用されない限り、カウントし、このような細胞株として個々に分離された細胞のための一般的な細胞数、のみに基づいてメッキオルガノイドのための信頼できる方法はありません。総タンパク質含量に対して正規化が常駐タンパク質マトリックスによる複合体形成されています。分泌されたコンを評価する際に、セル数、形状、および細胞型の点でこれらの特性を考慮しなければなりませんオルガノイド塊からテント。このプロトコルは、文化に簡単な手順の概要を説明し、微生物病原体や病原体関連分子パターン（のPAMPs）と小腸オルガノイドを治療するために生成されています。それはまた、タンパク質の分析は、そのようなチャレンジ後に行われているときに適用されるべき正規化技術を強調する。

腸のオルガノイドを育成するには、このプロトコルを、以下の場合には、特徴的な球体状のオルガノイドは、収穫後に存在するであろう。 R-spondin1馴化培地の添加は、毎日オルガノイドの成長と出芽を開始します。オルガノイドの成長は、 図 1Aに示されている- F、および1日目に、腸オルガノイドの代表、2、4、5、6と14日目、図1Fは、14日目オルガノイドの不均一な成長特性を示しています。 オルガノイドは、適切な数まで増殖させた後、それらを再プレーティングし、種々のPAMPおよび/または微生物で攻撃することができます。発現解析は、標準的な技術によって行うことができます。これは、以下の分析された炎症性サイトカインIL-18、IL-6、およびTNFαのmRNA発現を示している。図2A-Cに示さ...

ここでは、収穫維持、および病原体関連分子パターン（のPAMPs）とリステリア菌でマウス小腸オルガノイドを治療するためのプロトコルが記載されているだけでなく、遺伝子発現やタンパク質のための適切な正規化技術を重視。

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

この手順の全体的な目的は、総細胞数に対する標準化技術に重点を置き、病原体チャレンジが小腸オルガノイドに及ぼす影響を測定することです。この手法は、細菌と腸上皮細胞の宿主病原体相互作用をin vitroで調査する手段を提供することで、自然免疫および粘膜免疫分野における重要な疑問への回答に寄与します。この手順において不可欠なのは、総細胞数に対する標準化の手法であり、これはELISAなどの手法を用いてオルガノイド分泌タンパク質を測定する際に必要となります。オルガノイド培養のためにマウス小腸陰窩を回収するには、まず滅菌済みのガラススライドを用いて、小腸の腔側表面から絨毛をそっと掻き取ります。次に、解剖用ハサミを使用して組織を1-2 centimeterの長さのストリップ状に切断します。そして、これらのストリップを10 millilitersの氷冷PBSを含む50 milliliterコニカルチューブに入れます。内容物を緩やかに転倒混和し、組織がチューブの底に沈殿するまで待ちます。その後、PBSを吸引し、新鮮な10 millilitersのPBSでさらに3回、同様の方法でストリップを洗浄します。最後の洗浄が終わったら、チューブを氷上に10分間置きます。次に、PBSを2 millimolar EDTAを添加した25 millilitersのPBSに交換し、ロッキングプラットフォーム上の氷バケツ内で45分間置きます。インキュベーション終了後、組織ストリップをチューブの底に沈殿させ、PBS-EDTAを10%FBSを添加した10 millilitersのPBSに交換します。チューブを手で10回激しく振ります。その後、組織をチューブの底に沈殿させ、上清をFraction 1とラベルした15 milliliterコニカルチューブに移します。PBS FBS中で組織をさらに5回撹拌します。その都度、上清を新しい分画チューブに移します。最後の撹拌後、すべてのサンプルを遠心分離し、ペレットを成長因子を添加していない、あらかじめ加温した5 millilitersのDMEM/F12に再懸濁します。ここで、サンプルを再度遠心分離し、各チューブから4 millilitersの上清を吸引します。残りの1 milliliterの培地でペレットを再懸濁し、各分画から20 microliterのアリコートを用いて、ガラススライド上で陰窩とデブリを可視化します。陰窩とデブリの比率が最大となる適切な分画をプールした後、プールした分画を遠心分離し、上清の最後の50-100 microliters以外をすべて吸引します。チューブを氷上に保持したまま、プールした分画に1 milliliterのプロテインマトリックスを加え、気泡が混入しないようゆっくりとピペッティングします。その後、プロテインマトリックス/陰窩懸濁液50 microlitersを、37の各ウェルの中央に加えます。

the-ex-vivo-culture-pattern-recognition-receptor-stimulation-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

一次マウス結腸腫瘍オルガノイドを確立するための簡単​​な方法が記載されている。通常のコロンは上皮ないのに対し、この方法では、結腸腫瘍細胞が生き残ると限られた成長因子を含む培地中でオルガノイドに成長するという特徴を利用しています。...

プライマリマウス大腸腫瘍のin vitroオルガノイド培養で

改良されたイメージング技術により、発生中の臓器の3次元イメージングが可能になりました。ここでは、マウス胎児の腸で発生中の絨毛をライブイメージングできる全臓器培養システムについて説明します。...

マウス胎児腸全体培養システム生体外シグナル伝達経路の操作と絨毛開発の3次元ライブイメージング

小腸の陰窩オルガノイド培養ex vivoで幹細胞およびそれらのニッチに依存する陰窩の成長を再現する組織培養系を提供する。私たちは、初代マウス陰窩オルガノイドリアルタイムで代謝プロフィールをアッセイする方法を確立した。私たちは、オルガノイドは、それらのソースで定義された生理学的特性を維持した。...

における代謝プロファイルのリアルタイム分析エクスビボマウス腸陰窩オルガノイド培養

このビデオプロトコルでは、一次腸上皮のオルガノイドにおけるレンチウイルス形質導入と、定量的RT-PCR、RNA-マイクロアレイ、免疫組織化学によるこれらの培養物の処理と下流分析について、段階的に説明します。...

レンチウイルス形質導入と腸オルガノイドの下流分析のためのプロトコル

ex vivo臓器培養は、無傷の組織構造の文脈で生物学的プロセスを調査することを可能にします。ここでは、腸管内の自然免疫や抗菌宿主防御の研究に利用できるマウス大腸のex...

ザ<em&gt; ex vivoで</em&gt;コロン器官培養および抗菌生体防御研究におけるその使用

本稿では、新しい腸器官培養システムを用いて、 生体 実験を行うホストとマイクロバイオームの相互作用を分析する独自の方法を紹介する。...

宿主-微生物叢相互作用を解析するための腸腸器官培養システム

このプロトコルは、マウス小腸オルガノイドの樹立、マウス小腸固有層からの1型先天性リンパ系細胞の単離、および腸上皮細胞と1型先天性リンパ系細胞との間の双方向相互作用を研究するための両方の細胞型間の3次元(3D)共培養を確立するための詳細な指示を提供する。...

マウス小腸上皮オルガノイドと先天性リンパ球細胞との共培養

本プロトコルは、クローディン-7ノックアウトモデルにおける結腸幹細胞の活性および機能を研究するためのマウス結腸オルガノイド系の確立を記載する。...

腸幹細胞機能をex vivoで研究するためのマウス結腸陰窩の三次元培養

マウス小腸陰窩を単離し、陰窩から腸3Dオルガノイドを培養するためのプロトコルについて説明します。さらに、上皮下細胞ニッチの非存在下で単一の腸幹細胞からオルガノイドを生成する方法について述べる。...

オルガノイド研究のためのマウス腸陰窩および単一幹細胞からのオルガノイドの3D培養

学ぶマウス小腸オルガノイドの採取と培養、PAMPsやListeria monocytogenes処理による遺伝子発現解析とタンパク質正規化技術。腸管免疫と宿主病原体相互作用の研究に有用です。

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