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2016年5月18日
ここでは、収穫維持、および病原体関連分子パターン（のPAMPs）とリステリア菌でマウス小腸オルガノイドを治療するためのプロトコルが記載されているだけでなく、遺伝子発現やタンパク質のための適切な正規化技術を重視。
この手順の全体的な目的は、総細胞数に対する標準化技術に重点を置き、病原体チャレンジが小腸オルガノイドに及ぼす影響を測定することです。この手法は、細菌と腸上皮細胞の宿主病原体相互作用をin vitroで調査する手段を提供することで、自然免疫および粘膜免疫分野における重要な疑問への回答に寄与します。この手順において不可欠なのは、総細胞数に対する標準化の手法であり、これはELISAなどの手法を用いてオルガノイド分泌タンパク質を測定する際に必要となります。オルガノイド培養のためにマウス小腸陰窩を回収するには、まず滅菌済みのガラススライドを用いて、小腸の腔側表面から絨毛をそっと掻き取ります。次に、解剖用ハサミを使用して組織を1-2 centimeterの長さのストリップ状に切断します。そして、これらのストリップを10 millilitersの氷冷PBSを含む50 milliliterコニカルチューブに入れます。内容物を緩やかに転倒混和し、組織がチューブの底に沈殿するまで待ちます。その後、PBSを吸引し、新鮮な10 millilitersのPBSでさらに3回、同様の方法でストリップを洗浄します。最後の洗浄が終わったら、チューブを氷上に10分間置きます。次に、PBSを2 millimolar EDTAを添加した25 millilitersのPBSに交換し、ロッキングプラットフォーム上の氷バケツ内で45分間置きます。インキュベーション終了後、組織ストリップをチューブの底に沈殿させ、PBS-EDTAを10%FBSを添加した10 millilitersのPBSに交換します。チューブを手で10回激しく振ります。その後、組織をチューブの底に沈殿させ、上清をFraction 1とラベルした15 milliliterコニカルチューブに移します。PBS FBS中で組織をさらに5回撹拌します。その都度、上清を新しい分画チューブに移します。最後の撹拌後、すべてのサンプルを遠心分離し、ペレットを成長因子を添加していない、あらかじめ加温した5 millilitersのDMEM/F12に再懸濁します。ここで、サンプルを再度遠心分離し、各チューブから4 millilitersの上清を吸引します。残りの1 milliliterの培地でペレットを再懸濁し、各分画から20 microliterのアリコートを用いて、ガラススライド上で陰窩とデブリを可視化します。陰窩とデブリの比率が最大となる適切な分画をプールした後、プールした分画を遠心分離し、上清の最後の50-100 microliters以外をすべて吸引します。チューブを氷上に保持したまま、プールした分画に1 milliliterのプロテインマトリックスを加え、気泡が混入しないようゆっくりとピペッティングします。その後、プロテインマトリックス/陰窩懸濁液50 microlitersを、37の各ウェルの中央に加えます。
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概要
本記事では、マウス小腸オルガノイドの採取、維持、および病原体関連分子パターン（PAMPs）やListeria monocytogenesを用いた処理のプロトコルについて解説します。また、遺伝子発現およびタンパク質解析における適切なノーマライズ（標準化）技術についても重点的に説明します。
主要研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 微生物学
- 細胞生物学
背景
- マウス小腸オルガノイドは、腸管生物学の研究において有用です。
- 病原体関連分子パターン（PAMPs）は、免疫応答において役割を果たします。
- 遺伝子発現を理解することは、実験結果を解釈する上で極めて重要です。
- 正確なタンパク質分析には、標準化手法が不可欠です。
研究の目的
- マウス小腸オルガノイドを用いた操作の詳細なプロトコルを提供する。
- これらのオルガノイドに対するPAMPsおよびListeria monocytogenesの影響を検討する。
- 遺伝子発現解析と標準化の重要性を強調する。
使用した手法
- マウス小腸オルガノイドの回収。
- 特定の条件下でのオルガノイド培養の維持。
- PAMPsおよびListeria monocytogenesによるオルガノイドの処理。
- 遺伝子発現の解析およびタンパク質正規化の手法。
主な結果
- オルガノイドの維持および処理に成功した。
- 処理後に遺伝子発現の変化が観察された。
- 標準化の手法により、タンパク質分析の精度が向上した。
- 本プロトコルは、腸生物学に関するさまざまな研究に適用可能である。
結論
- 記載されたプロトコルは、腸管オルガノイドの研究に有効です。
- PAMPsおよびListeria monocytogenesは、遺伝子発現に大きな影響を与えます。
- 信頼性の高い結果を得るためには、適切な正規化手法が不可欠です。
よくある質問
産業界における重要性
マウス腸管オルガノイドのex vivoモデルは、粘膜組織における宿主と病原体の相互作用および自然免疫シグナリングを解析するための生理学的に妥当なシステムを提供します。本プロトコルでは、総細胞数に対する標準化を重視しており、不均一なオルガノイド培養から再現性のある定量的なデータを生成するという重要な課題を解決しています。この機能により、免疫学やマイクロバイオームに焦点を当てた治療プログラムにおける初期探索およびターゲット検証において、予測的な信頼性を高めることが可能になります。
バイオ製薬研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 一次上皮細胞のコンテキストにおいて、パターン認識受容体経路のメカニズム的な解析を可能にします。
- 複雑な宿主・病原体相互作用をex vivoでモデル化することで、生物学的なリスク低減をサポートします。
- 自然免疫調節因子の機能的なターゲットバリデーションを促進します。
- 免疫学的に有用なアセットを推進させるための予測的信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 免疫調節化合物のダウンストリームスクリーニングに向けた、検証済みオルガノイドシステムを調製します。
- 厳格な正規化手法を通じて、アッセイの標準化と再現性を確保します。
- 分泌タンパク質の定量的な測定を可能にし、信頼性の高い化合物評価をサポートします。
- 創薬プログラム全体におけるプラットフォームの拡張性と再利用性を向上させます。
翻訳および前臨床研究
- 疾患に関連する粘膜生物学に準拠しており、トランスレーショナルなバイオマーカー探索に適しています。
- 免疫およびバリア機能研究において、発見から前臨床検証までの連続性を提供します。
- 生理学的に適切な上皮応答をモデル化することで、開発進展における意思決定のリスクを軽減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このプロトコルは、粘膜免疫学および宿主・微生物相互作用プログラムにおいて、初期の仮説検証からリード化合物の同定、さらには前臨床検証に至るまでのディスカバリー・コンティニュアムに統合されます。
- 探索生物学：先天性免疫シグナル伝達および宿主・病原体メカニズムの仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：オルガノイドアッセイにおける分泌タンパク質分析に対し、再現性のある定量的なリードアウトを提供します。
- 分析：総細胞数による標準化を可能にし、異なる実験条件間での比較性を向上させます。
- トランスレーショナルリサーチ：in vitroでの知見をin vivoの粘膜生物学へと橋渡しし、バイオマーカーの整合性を図ります。
- 企業内での再利用：免疫学およびマイクロバイオームのR&Dポートフォリオ向けに、再利用可能なオルガノイドベースのワークフローを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させ、メカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用の価値：複雑なオルガノイドシステムにおける正規化および定量化を標準化する。
- 戦略的価値：情報に基づいたGO/NO-GO判断と、資本効率の高いポートフォリオの推進を可能にする。
- ポートフォリオへの影響：免疫学およびマイクロバイオーム資産のリスク調整後の優先順位付けを支援する。
実施上の検討事項
- オルガノイド培養および上皮生物学に関する専門知識が必要です。
- 特殊な組織培養設備およびタンパク質定量機器へのアクセスが不可欠です。
- 標準化および分析プロトコルについて、チーム間での統一を図る必要があります。
- 異なるオルガノイドの種類や疾患モデルに合わせて調整が必要な場合があります。
- オルガノイドの成長やマトリックス組成の不均一性が、アッセイの再現性に影響を及ぼす可能性があります。
