ザ ex vivoで文化とパターン認識受容体刺激

この手順の全体的な目標は、全細胞数に対する正常化技術に重点を置いて、小腸オルガノイドに対する病原性チャレンジの影響を測定することです。この方法は、in vitroで細菌と腸上皮細胞との宿主病原体相互作用を調査する手段を提供することにより、自然免疫学および粘膜免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。この手順に不可欠なのは、総細胞数に対する正規化の方法であり、オルガノイド培養用の ELISA.To 採取マウス小腸陰窩などの技術を介してオルガノイド分泌タンパク質を測定する際には、滅菌ガラススライドを使用して小腸の管腔表面から絨毛を優しくこすり落とすことから始まります。次に、解剖ハサミを使用して、組織を1〜2センチメートルの長さのストリップにカットします。そして、ストリップを10ミリリットルの氷冷PBSを含む50ミリリットルの円錐形チューブに入れます。内容物を穏やかに反転させて混合し、組織内容物がチューブの底に沈殿するのを待ちます。次に、PBSを吸引し、ストリップを10ミリリットルの新鮮なPBSでさらに3回、毎回同じ方法で洗浄します。最終洗浄の最後に、チューブを氷の上に10分間置きます。次に、PBSを25ミリリットルのPBSに2ミリリットルのEDTAを補充し、ロッキングプラットフォームの氷バケツに45分間交換します。インキュベーションの終わりに、組織ストリップがチューブの底に落ち着くのを待ち、PBS-EDTAを10%FBSを補充した10ミリリットルのPBSと交換します。チューブを手で激しく10回振る。次に、組織をチューブの底に沈殿させ、上清をラベル付けされた15ミリリットルの円錐形チューブに移します。毎回、上清を新しいフラクションチューブに移します。最後の攪拌後、すべてのサンプルを遠心分離し、成長因子を添加せずに5ミリリットルの予熱したDMEM/F12にペレットを再懸濁します。次に、サンプルを再度スピンダウンし、各チューブから上清を4ミリリットル吸引します。残りの培地の最後のミリリットルにペレットを再懸濁し、各画分から20マイクロリットルのアリコートを使用して、陰窩とスライドガラス上の破片を視覚化します。陰窩と破片の比率の最大の割合を達成するために適切な画分をプールした後、プールされた画分を遠心分離し、上清の最後の50〜100マイクロリットルを除くすべてを吸引します。チューブを氷上に保持し、プールしたフラクションに1ミリリットルのタンパク質マトリックスを加え、気泡の追加を防ぐためにゆっくりとピペッティングします。次に、50マイクロリットルのタンパク質マトリックス/陰窩懸濁液を37個の各ウェルの中央に加えます