ヒト胆汁からマイクロRNA含有エキソソームの単離とプロファイリング

この手法の全体的な目的は、microRNAプロファイリングなどのさらなる解析のために、ヒト胆汁からエクソソームを単離することです。この手法は、胆管癌やその他の胆道疾患における特定の胆汁マーカーの検出など、肝疾患分野における重要な課題の解決に寄与します。この技術の主な利点は、堅牢性と再現性に優れていることです。

内視鏡的逆行性胆管膵管造影（ERCP）を行うには、まず患者を仰臥位にします。十二指腸鏡を患者の口から挿入し、十二指腸の第2部まで進めて大十二指腸乳頭を確認します。0.35インチまたは0.9mmの親水性ガイドワイヤーをあらかじめ装填したトリプルルーメン乳頭切開刀を挿入し、総胆管を選択的にカニュレーションします。

透視下でガイドワイヤーを左肝管まで進め、その後、安定した位置を確保するために括約筋切開刀を胆管内に5 cm進めます。ガイドワイヤーを抜去した後、下部のロックを介してガイドワイヤーポートに10 mLシリンジを装着し、10 mLの陰圧を用いて胆汁を吸引します。胆汁の入ったシリンジを取り外し、ガイドワイヤーを再挿入した後、注入ポートから造影剤を注入して胆道系を造影します。

次に、回収した胆汁を氷上の15 mLチューブに移します。後で保存する場合は、サンプルを500 ×g、4 °Cで10分間遠心分離し、-80 °Cで凍結保存します。直ちにエクソソームの単離を行う場合は、400 µLの胆汁をマイクロ遠心チューブに移し、300 ×g、4 °Cで10分間遠心分離して細胞および細胞残渣を回収します。さらに上清を清澄化するため、溶液を新しいマイクロ遠心チューブに移し、サンプルを16,500 ×g、4 °Cで20分間遠心分離します。

次に、バイオセーフティキャビネット内で、上清をシリンジで回収し、0.2 µmのポリエーテルスルホン膜フィルターでろ過して、200 nm以上の残存粒子を除去します。ろ過した上清を超遠心管に移し、遠心時のチューブの潰れを防ぐため、PBSを加えてチューブの3分の2以上を満たします。120,000 ×g、4 °Cで70分間超遠心を行い、エクソソームをペレット化します。

小さな黄色のペレットにエクソソームが含まれています。慎重にデカンテーションして上清を廃棄し、最終濃度が10% v/vになるように漂白剤を加えて廃棄物を消毒します。その後、20分間放置してください。

後続の実験に向けて、ペレットを少量の適切な溶液で処理するか、50から100 µLのPBSに再懸濁し、後で使用するために−80 °Cで保存します。テキストプロトコルに従ってコントラスト染色した細胞外小胞（EV）のグリッドを準備した後、加速電圧80 kVの電子顕微鏡を用いて、粒子サイズを決定する際は20,000倍の倍率から開始し、100,000倍まで上げて画像を撮影します。エクソソームは小さすぎるため、通常の顕微鏡やフローサイトメトリーでは検出できません。しかし、この図はエクソソームの代表的なナノ粒子トラッキング解析（NTA）の結果を示しており、この単離したヒト胆汁サンプルにおける濃度とサイズ分布を測定したところ、平均サイズは97 nmでした。

電子顕微鏡を用いて、ヒト胆汁から単離した粒子のサイズを確認することもでき、この図は典型的な透過電子顕微鏡（EM）の結果を示しています。これらのウェスタンブロットでは、テトラスパニンCD63やTsg101などのエクソソームに富むタンパク質をプローブとして検出しました。このリアルタイム増幅プロットは、ヒト胆汁のエクソソームから抽出されたさまざまなマイクロRNA種を示しています。

エクソソームには18Sまたは28SリボソームRNAやハウスキーピング遺伝子のような信頼できる標準物質がないため、標準化には合成microRNAのスパイクインが重要です。エクソソームの分離技術は、適切に行えば3時間で完了します。このビデオを視聴することで、細胞外小胞を分離・分析するために、患者または動物から胆汁を採取し処理する方法を十分に理解できるはずです。

この手順を再現する際は、超遠心分離が不可能な場合、サンプルを500 G、4 °Cで遠心分離してから-80 °Cで凍結させることが重要です。本手順の後、microRNAプロファイルなどのさらなる疑問を解消するために、microRNA解析などの他の手法を実施することが可能です。胆汁には肝炎ウイルスが含まれている可能性があり、取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施中は常に手袋や保護メガネの着用などの予防策を講じてください。

この技術の開発後、胆管癌研究の分野において、PSA閉塞などの胆道疾患を有する患者の胆汁中における潜在的なバイオマーカーとして、細胞外小胞を探索する研究への道が開かれました。