Name: 乳がん転移挙動に関する器官特異的影響を研究するためのオルガン付きメディアおよびアプリケーションの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学ぶマウスのリンパ節・骨・肺・脳由来オルガンコンディションドメディアを用いた乳がん転移挙動の研究法。器官特異的可溶性因子ががん細胞の増殖・移動・遺伝子発現に与える影響を解明するex vivoプラットフォームです。

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この作業は、カナダ乳がん財団-オンタリオ地域からの助成金、カナダイノベーション財団(No.13199)、およびジョン&ドナ・ブリストルからのロンドン健康科学財団を通じた寄付者支援(A.L.A.)によって支援されました。学生資格とフェローシップのサポートは、オンタリオ大学院奨学金プログラム(オンタリオ州、GMPおよびJECへ)、カナダ大学院奨学金-修士プログラム(M.M.P.へ)、カナダ衛生研究所(CIHR)-戦略的トレーニングプログラム(M.M.P.、G.M.P.、J.E.C.へ)、およびロンドン地域がんプログラムのPamela Greenaway-Kohlmeierトランスレーショナル乳がん研究ユニット(M.M.P.、へ、 G.M.P.、J.E.C.、Y.X.)。A.L.A.は、オンタリオ州研究イノベーション省からCIHR New Investigator AwardとEarly Researcher Awardの支援を受けています。

すべての動物実験は、ウェスタン大学の動物利用小委員会によって承認されたプロトコルの下で、動物ケアに関するカナダ評議会の勧告に従って行いました。 1.臓器の単離（肺、脳、骨、リンパ節） <ol><li> 4滅菌50ミリリットルにコニカルチューブを準備し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の約30ミリリットルを含む（各臓器のための1を分離することにします）。電子天秤を用いて、PBSの各チューブを事前に重量を量ります。 </li><li> CO 2吸入によって6-12週齢のマウスを安楽死させます。 2分またはマウスが移動し、呼吸停止するまで-マウスは、約1のためにCO 2チャンバー内に残されるべきです。指を使って手動でチェックすると成功した安楽死は、さらにハートビートの欠如によって確認することができます。この方法として、頸椎脱臼を回避する腋窩リンパ節を除去することが困難につながる首の血管を破裂することができます。 注：以前の研究は、具体的に使用しています健康な女性のヌードマウス、HSD：無胸腺Nude- Foxn1 nuの 13。 </li><li>滅菌組織培養フードでは、ポリスチレンフォームパッドの上に仰向けにマウスを置いて手足を広げて、場所でそれらを保つためにピンを使用します。 </li><li>滅菌ピンセットやハサミを使用して、生殖器で正中線で腹部の皮膚を切ると口に向かって上向きにカット。ゆっくりポリスチレンフォームパッドの上に所定の位置に腹筋とピンから腹部の皮膚を引き戻します。 </li><li>腋窩、上腕および鼠径リンパ節の位置を確認します。 注：リンパ節は、通常、脂肪組織に囲まれています。鼠径リンパ節は、それらが引き戻さ腹部皮膚上の2つの血管の接合部に表面的に見られるように配置することが最も簡単です。腋窩及び上腕リンパ節を組織内に深く位置し、組織の穏やかな操縦を必要としています。 <ol><li>あなたはリンパ節を見つけた後、静かに、慎重に何のリンパ節をカットするはさみを使用しませんデ肌、脂肪や血管から、マウスから削除します。適切な解剖を確認するには、削除された組織の上に鉗子をロールバックします。組織の上に鉗子を転がすときに硬いしこりが存在する場合は、リンパ節は、おそらく正常に削除されました。 </li><li>氷冷PBSで削除リンパ節を置きます。 </li></ol></li><li>ピンセットやハサミを使用して、胸に向かって上昇運動にさらさ腹壁を切開により腹腔を開きます。慎重に胸腔を露出し、胸骨を切断。 </li><li>肺下の横隔膜の位置を確認し、振動板をカット。それは緊張に起因するリブに向かって引っ張る必要があります。 </li><li>下から肺を持ち上げて、気管に向かって下にある組織をカット。これは、肺が胸腔から自由に削除することができます。氷冷PBSでブロックし、場所エン心臓や肺を削除します。心臓は、ステップ2に計量前に必ずこちらか、単に肺から除去することができます。 </li><li>削除しますピン、ポリスチレンフォームパッド上の所定の位置でマウスを保ちます。マウスを裏返しと隣接するすべての方法サイドから全体の腰の皮膚をカット。 </li><li>マウスの胴体を保持するために、ガーゼの滅菌片を用いて、マウスの足と足の上にマウスの背中の皮膚の皮をむきます。 </li><li>滅菌ガーゼの同じ部分を使用して、慎重に、所定の位置に下肢を保持するマウスの足の足首関節を破壊し、膝関節に向かって近位関節上の皮膚の皮をむきます。 </li><li>はさみを使用して、氷冷PBSで膝関節と場所から自由に脛骨を削除します。 </li><li>繰り返して、反対側の手足に）1.12）1.11を繰り返します。 </li><li>鉗子を使用して、氷冷PBSに置く、はさみを使用して、周囲の筋肉組織を切り取ると大腿骨を除去し、所定の位置に大腿骨を保持します。 </li><li>反対側の手足と手順を繰り返し1.14）。 </li><li>滅菌ガーゼの新しい作品を使用して、所定の位置にマウスの頭部を保持します。ピンセットやハサミを使用して、そっと秒を公開するために皮膚を除去カル。はさみを使用して、慎重に後部脳を露出するようにまっすぐ下方ラインの上部中央から後頭部頭蓋骨をカット。 </li><li>鉗子を使用して、前方に向かって脳の下にスクープと脳全体を削除します。氷冷PBSで脳を置きます。 </li><li>少なくとも4匹のマウスのためのステップ1.1）1.17へ）を繰り返します。 </li></ol> 2.オルガン計量<ol><li>臓器単離後、電子天秤を用いて、肺および脳組織を含む各PBSチューブの重量を量ります。 </li><li> PBS管の重量+臓器（肺及び脳）からプレ分離重量（PBSのみ）を差し引くことにより、重量差を計算します。 </li><li>計算された重量差から組織片を再懸濁するために必要なメディアの量を決定します。 注：1メディア：組織比（容量/重量）肺および脳組織を4に再懸濁することによって正規化量です。 </li></ol> Lung-と脳 - 馴化培地の3世代<ol><li>無菌トンで問題培養フード、血液を含む臓器や吸引PBSから残留血液を除去するために、肺や脳の3回を含むPBSチューブを反転。解決策は、血液の証拠と透明になるまで新鮮な冷PBSで繰り返します。 </li><li>独立した60ミリメートル2ガラスペトリ皿に肺や脳を置きます。 2滅菌メスの刃を使用して、組織フラグメントのサイズが〜1ミリメートル約3になるまで繰り返し前後にスライスして、肺や脳をミンチ。 </li><li>再懸濁組織断片は、適切な音量にダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の（ステップ2.3で事前に決定）：1×を補充したF12培地は、マイトジェンサプリメントとペニシリン（50μg/ mlの）/ストレプトマイシン（50μg/ ml）を濃縮しました。 </li><li> 6ウェルプレートの1ウェルに再懸濁させ、肺や脳組織断片を追加します。 </li><li> 37℃で24時間、5％CO 2のメディアに組織片をインキュベートします。インキュベーション後、各組織およびfのための馴化培地を収集urther 50ミリリットルコニカルチューブに新鮮な培地の3同等のボリュームを追加することによって希釈します。 </li><li>大規模な組織片を除去するために15分間、4℃で各器官のための希釈された馴化培地1,000×gで遠心分離します。メディア上清を収集し、0.22μmのシリンジフィルターでろ過します。 </li><li>プールは、各臓器からの馴化培地（ すなわち 、脳と肺や脳と肺）は、複数のマウスからのマウス・ツー・マウスの変動を考慮するために。アリコートとストアが使用するまで-80℃で馴化培地。 </li></ol>骨髄馴化培地の4世代<ol><li>滅菌組織培養フードでは、骨から過剰な組織をトリミングして、ハサミで骨から骨端（エンドピース）を取り外します。 </li><li>各ボーンの中心を通って1mlのPBSを押すことによって、骨の27½G針、フラッシュ髄腔を使用しました。これは、PBSを含有する新鮮なチューブに骨髄間質細胞（BMSC）を収集することができます。 </li><li> 1,00での遠心分離0は、4℃で5分間XGおよびPBSで2回BMSCを洗います。骨間質細胞増殖培地20ml中に再懸濁した骨髄間質細胞（DMEMは：1×を補充したF12培地は、マイトジェンサプリメント、ペニシリン（50μg/ mlの）/ストレプトマイシン（50μg/ ml）および10％胎児バルボーベン血清（FBS）を濃縮しました）。 </li><li>プレート1 T75フラスコ中で再懸濁した骨髄間質細胞を10ml。 注：各T75フラスコ内の各2匹のマウスから合わせて、プレートの細胞; 4匹のマウスのために、2 T75フラスコを（約1×10 7細胞/フラスコ）必要とされています。 </li><li> 37℃で24時間、5％CO 2のための骨間質細胞の増殖培地に骨髄間質細胞をインキュベートします。インキュベーション後、両方のT75フラスコからメディアを削除し、新しいT75フラスコに入れ、「フローターフラスコ」として、このフラスコにラベルを付けます。前の2フラスコに新鮮な骨間質細胞増殖培地を追加し、全37℃で3フラスコおよび5％CO 2をインキュベートします。 </li><li> 7 - 細胞は、約70％の集密度（約5に到達した後日）継代細胞。これを行うには、培地を除去し、PBS（3ミリリットル各洗浄）で2回細胞を洗浄します。 PBSを削除し、トリプシン/ EDTA溶液の3ミリリットルを追加し、そのトリプシンをフラスコの表面全体を覆​​っている確保します。細胞がオフフラスコ持ち上げた後（約2 - 3分間）3mlの骨間質細胞の増殖培地を添加することによりトリプシン処理反応を停止させます）。遠心分離機は、900×gで4℃で5分間、新鮮な骨間質細胞増殖培地10mlにメディア、再懸濁細胞を廃棄します。 </li><li>すべてのフラスコおよび継代1からプール細胞：5つの新しいT75フラスコに、37℃、5％CO 2でインキュベートします。細胞は再び70％に到達した後、ステップ4.6およびプールとの通路すべての付着細胞をもう一度繰り返します。再プレートすべての4つのT75フラスコに細胞とは、37℃、5％CO 2をインキュベートします。骨間質細胞の増殖培地は、全ての工程のために使用されるべきです。 </li><li>細胞は、骨間質細胞収集メディアを、コンフルエンスに達するPBSで細胞を3回洗浄し、追加することができます（DMEM：F12培地+ 1倍に濃縮マイトジェンのsupplement +ペニシリン（50μg/ mlの）/ストレプトマイシン（50μg/ mlの）;このメディアは、FBSの自由であることを確認して10ミリリットル/ T75）、。 72時間後に骨髄馴化培地を収集し、使用するまで-80℃で0.22μmのフィルター、プール、アリコート、およびストアを介してフィルタリングします。 </li><li>所望であれば、以前に13に記載のような標準的なフローサイトメトリー技術を用いて、マウスのSca-1、CD105、CD29、およびCD73、CD44に対する抗体を用いて単離した骨髄間質細胞（BMSC）の表現型を確認します。 </li></ol>リンパ節付きメディアの5世代<ol><li>無菌組織培養フード中で、リンパ節および吸引血のPBSから残留血液を除去するためにリンパ節を3回含むPBSチューブを反転させます。解決策は、血液の証拠と透明になるまで新鮮な冷PBSで繰り返します。 </li><li> 60ミリメートル2ガラスシャーレ内のリンパ節を置きます。繰り返しTISSUまで前後にスライスして2滅菌メスの刃、ミンチリンパ節を使用して、E断片のサイズは約1mm 3です。 </li><li>円錐管では、ロズウェルパーク記念研究所1640（RPMI1640）ペニシリン（50μg/ ml）を添加した培地/ストレプトマイシン（50μg/ mlの）、5×10 -5 Mの滅菌βメルカプトエタノールの10ml中に再懸濁組織断片（ 1.75μL/ 500mLの培地）および10％FBS。 </li><li> 4℃で5分間、900×gで遠心分離し、30mLの培地中のすべての細胞を再懸濁。 5ミリリットルメディア/ 6ウェルプレートに加え、37℃で7日間、5％CO 2インキュベートします。 </li><li> 7日間のインキュベーションの後、培地を捨て、温かいPBS 5mlで接着細胞を洗浄し、各ウェルに5ミリリットルを新鮮な培地を追加します。細胞が密集するまで増殖させ（約5から7日間）、トリプシン処理、ステップ4.6で説明したように、すべてのセル、および流路をプールします。 6ウェルプレートに再プレート細胞。この手順を3回繰り返します。 </li><li> 3継代後、PBSでウェルを3回洗浄し、追加し、細胞がコンフルエントになるまで成長することを可能にする2ミリリットル/ウェルのDMEM：F12 + 1×このメディアは、FBSの自由であることを確実に濃厚マイトジェンサプリメントとペニシリン（50μg/ mlの）/ストレプトマイシン（50μg/ mlの）、。使用するまで-80℃で72時間、プール、アリコート、およびストアの後にリンパ節馴化培地を収集します。 </li><li>所望であれば、以前に13に記載のような標準的なフローサイトメトリー技術を用いて、マウスCD45およびGP38に対する抗体を用いて単離されたリンパ節間質細胞（LNSC）の表現型を確認します。 </li></ol>癌細胞の転移挙動に関連するダウンストリームのアッセイのためのオルガン付きメディアの6. <ol><li> 5、癌細胞の転移挙動の可溶性器官由来の因子の影響を決定するために、別の下流の細胞および分子生物学アッセイを実施するために使用 - 器官馴化培地たらステップ1に記載したように生成されています。 （文献の他の箇所に記載）の標準的なアッセイの例としては、タンパク質アレイ13、細胞増殖アッセイ、&lt;SUP&gt; 13、細胞遊走アッセイ13、tumorsphere形成14、およびRT-PCR 15。元のベース媒体は、（臓器馴化培地を生成するために使用される、すなわち 、無条件DMEM：1×を補充したF12培地）をマイトジェンサプリメント及びペニシリン（50μg/ mlの）/ストレプトマイシン（50μg/ mlの濃縮陰性対照として使用されるべきです。 </li></ol>

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

転移は、携帯一連のイベントは、組織浸潤および遠隔腫瘍の確立4,30,31のための最終的な責任であることにより、複雑なプロセスです。特定の臓器（「そこの取得」）およびその器官（「そこに成長している」）の成長に癌細胞のホーミングまたは移行：ここで紹介するのex vivoモデル系は、転移性進行の二つの重要な側面を研究するために利用することができます。多くの研究は、以前に転移プロセスに貢献する癌細胞自体に関連付けられたキー分子的特徴を同定することに焦点を当てています。例えば、ジョアンMassaguéのグループによって行われた仕事は、肺特異的、骨特異的、およびスプレッド10-12,32の脳特異的なパターンに関連付けられた個別の遺伝子シグネチャーを同定しました。この作品は、このプロセスへの癌細胞の寄与に関して重要な洞察を提供していますが、はるかに少ないトンで貢献臓器特異的因子の役割についてはほとんど知られていません13を研究することは比較的困難なままであった彼の二次微小環境、。 このex vivoでの<...

乳がんは女性で最も頻繁に診断される癌および癌関連死1の第二の主要な原因です。乳がんの死亡率の高さは、主に転移性疾患を軽減し、排除する従来の治療の失敗によるものです。癌関連死の約90％は、転移2によるものです。転移カスケードの根底にある分子機構を理解することは、初期および後期段階の乳癌の両方で効果的な治療法の開発に最も重要です。 過去の研究では、乳癌転移の多段階の性質の解明に役立っており、癌の進行および転移の両方の結果は、癌細胞と宿主環境3との間の相互作用に大きく依存すると仮定されます。臨床観察は、多くの癌、 すなわち 、臓器向性を表示することを示している。、傾向が優先CAS organs.In特定に転移します乳癌のEは、患者の疾患は、典型的には、広がるか、骨、肺、リンパ節、肝臓、および脳4-6を含む5つの主要な部位に転移します。多くの理論は、このプロセスを説明するために開発されてきたが、わずか数は、時の試練に耐えてきました。転移のユーイング理論は、1920年代に提案され、転移のthatthe分布が厳密に機械的要因によるものであった仮定しました。腫瘍細胞は正常な定義された生理の血流パターンによって身体全体に運ばれ、単に最初の毛細血管床に逮捕されたことにより、彼らは7に遭遇します 。これとは対照的に、スティーブン・パジェット1889「種と土壌」仮説は、癌細胞（「シード」）は自分自身だけと適切な分子の要因（「土を生成proliferatein臓器微小環境を確立することができる、追加の分子相互作用は、転移の生存と成長のための責任があったことを示唆しました&quot;）8。ほぼ一世紀後に、レナード・ワイスの下で以前に発表された剖検データのメタ分析を取り、剖検時に検出多くの転移性腫瘍が転移臓器向性は、単独での血流パターンによって決定した場合に予想される予想される割合で発見されたことをユーイング予測を確認しました。しかし、manyinstancesでその後ユーイング提案機械的要因9によって予想される特定の部位に形成され、より少ないまたはそれ以上の転移がありました。これらのアカウントと理論は、特定の臓器微小環境が普及パターンと乳癌を含む多くの癌のその後の成長と生存に重要な役割を果たしていることを示唆しています。 過去の研究努力は、主に腫瘍細胞由来因子に着目し、乳癌転移10-12で観察された臓器向性への貢献、しかし少し研究は、設立のための有利なニッチを提供することができる臓器微小環境由来の要因を検討していています乳癌転移の。これは、in vitroでの臓器微小環境の成分を研究する技術的課題に負うところが大きいです。 現在の記事は、ヒト乳癌細胞の転移挙動のリンパ節、骨、肺、および脳の可溶性成分の影響を研究するための包括的なのex vivoモデルシステムが記載されています。以前の研究は、異なる乳癌細胞株は、それらのin vivoでの転移能13に対応する器官馴化培地に応答して、細胞株特異的および器官特異的悪性の挙動を示すことを実証することによって、このモデル系を検証しています。このモデル系は、増殖、遊走、幹様挙動、および遺伝子発現に影響を​​含む乳癌癌細胞の他のタイプの転移挙動において役割を果たし得る特定の器官由来の可溶性因子を同定および評価するために使用することができ、同様の識別癌のための潜在的な新規治療標的。これは、具体的に器官特異的転移挙動を研究するために、および癌転移の過程を駆動する器官由来の可溶性因子の役割を評価するために使用することができる第一のex vivoモデル系です。

<table><tbody><tr><td>50 mlコニカルチューブ</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>339652</td><td>滅菌済みに保つ</td></tr><tr><td>1x リン酸緩衝生理食塩水</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>滅菌済みヌー</td></tr><tr><td>ドマウス</td>を保つ <td>Harlan Laboratories</td><td>Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu</td> 6<td>〜12週齢での使用</td></tr><tr><td>発泡スチロールパッド</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>発泡スチロールの輸送用コンテナの廃棄された蓋(~4 x 8インチ以上)は、この目的に使用できます。エタノールで拭いて滅菌します。</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11050-10</td><td>滅菌保持</td></tr><tr>は<td>さみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14058-11</td><td>滅菌保持</td></tr><tr><td>ガーゼパッド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-246069</td><td>滅菌保持</td></tr><tr><td>60 mm2ガラスシャーレ</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>CLS7016560</td><td>滅菌保持</td></tr><tr><td>メスブレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>S95937A</td><td>無菌状態に保つ</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Life Technologies</td><td>21331-020</td><td>37°C;Cウォーターバス使用前に、滅菌状態に保ちます&nbsp;</td></tr><tr><td>1x Mito + Serum Extender</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td>原稿では「濃縮マイトジェンサプリメント」と記載されています。無菌ペ</td></tr><tr><td>ニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>無菌状態を保つ</td></tr><tr><td>Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>37°Cで暖かい;Cウォーターバス使用前に、滅菌状態に保ちます&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051-500ML</td><td>滅菌済み</td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R-001-100</td><td>Warm in 37 &deg;Cウォーターバス使用前に、滅菌状態に保ちます&nbsp;</td></tr><tr><td>6ウェル組織培養プレート</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>140675</td><td>無菌状態を保つ</td></tr><tr><td>0.22 &mu;mシリンジフィルター</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359904</td><td></td></tr><tr><td>T75組織培養フラスコを</td>無菌に保つ <td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>178905</td><td>無菌状態を保つ</td></tr><tr><td>トランズウェル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3464</td><td>無菌状態を保ち、移行アッセイに使用</td></tr><tr><td>抗マウスSca-1</td><td>R&Dシステムは</td><td>10 FAB1226P</td><td>マイクロで使用します。l/106細胞</td></tr><tr><td>抗マウスCD105</td><td>R&D Systems</td><td>FAB1320P</td><td>10 & microで使用します。l/106細胞</td></tr><tr><td>抗マウスCD29</td><td>R&Dシステム</td><td>FAB2405P-025</td>は<td>10&microで使用。l/106細胞</td></tr><tr><td>抗マウスCD73</td><td>R&D Systems</td><td>FAB4488P</td><td>10 & microで使用します。l/106細胞</td></tr><tr><td>抗マウスCD44</td><td>R&D Systems</td><td>MAB6127-SP</td><td>は 0.25 & マイクロで使用。g/106細胞</td></tr><tr><td>抗マウスCD45</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>5 & micro で使用;l / 106細胞</td></tr><tr><td>抗マウスgp38</td><td>eBioscience</td><td>12-5381-80</td><td>10 & microで使用;L/106細胞</td></tr><tr><td>&β;-メルカプトエタノール&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>M6250&nbsp;</td><td>無菌状態に保つ</td></tr><tr><td>タンパク質アレイ</td><td>RayBiotech Inc.</td><td>AAM-BLM-1-2</td><td>メディア条件(ネガティブコントロールを含む)ごとに1つのアレイをトリプリケートで使用</td></tr></tbody></table>

乳がん転移挙動に関する器官特異的影響を研究するためのオルガン付きメディアおよびアプリケーションの生成

Generation of Organ-conditioned Media and Applications for Studying Organ-specific Influences on Breast Cancer Metastatic Behavior

乳がんは、乳がん患者のリンパ節、骨、肺、脳、肝臓に優先的に転移します。これまでの研究努力は、この観察された転移パターン(臓器親和性と呼ばれる)の原因となる乳がん細胞に固有の因子を特定することに焦点を当ててきましたが、このプロセスに寄与する特定の臓器内に存在する因子についてはほとんど知られていません。これは、臓器微小環境を正確に再現するin vitroモデルシステムが不足していることが一因です。これに対処するために、さまざまな臓器微小環境内に存在する可溶性因子の研究を可能にするex vivoモデルシステムが確立されました。このモデルは、正常な胸部ヌードマウスから分離された臓器(リンパ節、骨、肺、および脳)から条件付け培地を生成することからなる。このモデルシステムは、異なる乳がん細胞株が、in vivo転移能に対応する臓器条件培地に応答して細胞株特異的および臓器特異的な悪性挙動を示すことを実証することにより、検証されています。このモデルシステムは、成長、遊走、幹様挙動、遺伝子発現への影響など、乳がん細胞や他の種類のがん細胞の転移行動に関与する可能性のある特定の臓器由来可溶性因子を同定および評価するために使用できるほか、がんの新たな治療標的候補の同定にも活用できます。これは、臓器特異的な転移挙動を詳細に研究し、がん転移の進行過程における特定の臓器由来可溶性因子の役割を評価するために使用できる最初のex vivoモデルシステムです。

オルガン付きメディアの生成 臓器の単離および馴化培地の生成のプロセスの概要図/概略図を図2に示す手順の代表的な写真画像と、 図1に示されている。このプロトコルは、最初の開発中であった場合、肝臓が含まれていたことに留意すべきです我々の分析では、乳癌転移の一般的な部位であるためです。しかし、肝臓によって産生され、分泌されたプロテアーゼの大量の、良好な品質の馴化培地を生成するのに十分に長く生存肝臓を維持することは非常に困難です。肝臓馴化培地を単離した後も安定していない、と同じ理由のための可能性が高いタンパク質沈殿物の多くは、なるように傾向があります。したがって、肝臓は、任意のさらなる分析には含まれていませんでした。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-ページ= &quot;1&quot;&...

この原稿は、マウスのリンパ節、骨、肺、および脳に由来する臓器条件培地で構成されるex vivoモデルシステムについて説明しています。このモデル系は、臓器由来の可溶性因子と、それらががん細胞の臓器親和性および転移挙動に及ぼす影響を同定し、研究するために使用できます。

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused ...

この手順の目的は、マウスのリンパ節、骨、肺、および脳を用いて条件付き培地を調製し、臓器由来の水溶性因子を特定・解析し、それらががん細胞の転移挙動に及ぼす影響を研究することです。本手法は、「臓器特異的な因子が、がん細胞の増殖、遊走、および遺伝子発現にどのように影響するか」といった、転移研究における重要な問いに対する答えを得るのに役立ちます。この技術は、がん細胞の表現型や挙動に影響を与える臓器特異的なin vivo水溶性因子を代表する、簡便なex vivoプラットフォームを提供します。リンパ節を単離するために、まず6〜12週齢のマウスを滅菌済み組織培養フード内のポリスチレンフォームパッド上に置き、四肢を伸ばした状態で固定します。次に、ピンセットとハサミを用いて、生殖器から口にかけて腹部の皮膚正中線に切開を加えます。その後、腹筋から皮膚を慎重に剥がし、解剖パッドにピンで固定します。ハサミを使用して、リンパ節を皮膚、脂肪、および血管から慎重に切り出し、採取しながら30 millilitersの氷冷PBSに入れます。すべてのリンパ節を回収した後、ピンセットとハサミを用いて、露出した腹壁を胸骨に向かって上方に慎重に切り開き、胸腔を露出させます。横隔膜を切断します。肺を下から持ち上げ、気管に向かって下層の組織を切断します。次に、肺を氷冷したPBSが入った新しい容器に移します。心臓は、この工程中または臓器の重量測定前に肺から除去することが可能です。下肢骨を採取するため、マウスを腹臥位にし、腰部の皮膚を側腹部から側腹部にかけて切開します。次に、滅菌ガーゼを用いて体幹および脚と足の上の皮膚をつかみます。同じガーゼで下腿を保持しながら、片足の足関節を慎重に脱臼させ、関節上の皮膚を膝方向に向かって近位に剥離します。次に、ハサミを使用して膝関節から脛骨を取り出し、脚の骨を氷冷したPBSに入れます。2本目の脛骨を採取した後、ピンセットで大腿骨を固定し、ハサミで周囲の筋肉組織を切り離します。その後、脚の骨を氷冷したPBSに入れます。脳を採取するには、新しい滅菌ガーゼで頭部を保持し、ハサミとピンセットで皮膚を慎重に取り除いて頭蓋骨を露出させます。次に、ハサミを用いて、頭蓋骨の中央上部から後頭骨にかけて直線的に下方へ切り込みを入れ、後脳を露出させます。その後、頭蓋骨の前方に向かって組織の下側からすくい上げるようにして、脳全体を氷冷したPBSに移します。肺条件培地を作製するために、肺組織の入ったチューブを3回転倒混和し、臓器から残留血液を除去します。次に、洗浄液を新鮮な冷PBSに交換し、生理食塩水に血液が含まれなくなるまでこの操作を繰り返します。続いて、マウス1匹につき1枚の60mm角ガラス製ペトリ皿に肺を移し、2枚の滅菌メス刃を用いて、繰り返し前後に切り刻むことで組織を細切します。組織片のサイズが約1 mm³になったら、抗生物質を添加した適切な量のDMEM:F12培地で再懸濁し、マウス1匹につき6ウェルプレートの1ウェルに入れ、37 °C、5% CO2条件下で培養します。24時間後、各ウェルの全内容物を個別の50 mLコニカルチューブに移し、各チューブの条件付き培地を3等量の新鮮なDMEM:F12培地で希釈します。チューブを遠心分離し、大きな組織破片を除去します。次に、コンディショニング培地を0.22 micronのシリンジストレーナーでろ過し、1本の50 milliliterコニカルチューブにまとめます。骨髄コンディショニング培地を作製するには、骨を滅菌済みの組織培養フード内に移し、骨に付着している余分な組織を取り除きます。また、ハサミを用いて骨端を切り取ります。次に、27.5ゲージの針を用いて、各骨の髄腔から1 mLのPBSを新鮮なPBSが入ったチューブ内へ洗い出します。すべての骨髄ストローマ細胞を回収した後、細胞をPBSで3回洗浄します。最後の洗浄後、ペレットを10%胎児牛血清を添加した骨ストローマ細胞増殖培地20 mLに再懸濁し、T75フラスコ1本あたり10 mLの細胞を播種します。細胞が約70%コンフルエンスに達したとき、培養物を3 mLのPBSで2回洗浄します。次に、0.025%トリプシン/EDTA溶液 3 mLを用いて細胞を剥離させます。その際、トリプシンがフラスコ表面全体に行き渡るように注意してください。2〜3分後、骨ストローマ細胞増殖培地 3 mLを加えて酵素反応を停止させ、細胞を50 mLチューブに回収します。細胞を遠心分離します。次に、ペレットを10 millilitersの新鮮な培地で再懸濁します。その後、3つの新しいT75フラスコに1:5の比率で継代し、コンフルエンシーが70%に達するまで培養します。次に、先ほど示した方法で細胞をPBSで3回洗浄し、ミトゲンおよび抗生物質を添加した無血清骨ストローマ細胞回収培地を加えて72時間培養します。培養3日後、培地を0.22 µmストレーナーで回収します。ストローマ細胞は培養皿に接着しており、リンパ節ストローマ細胞培養では伸長した線維芽細胞様の形態が観察され、骨髄ストローマ細胞培養ではより小さく円形に近い形態を示します。フローサイトメトリー解析により、リンパ節基質細胞の大部分がCD45陰性かつgp38陽性であることが確認されます。骨髄基質細胞は、CD-44およびCD-29が陽性、CD-105およびSca-1が弱陽性、そしてCD-73が陰性である必要があります。遺伝的背景が異なるヒト乳がん細胞は、特定の臓器条件に対して異なる遊走および増殖パターンを示します。例えば、この代表的な実験において、骨への親和性を持つ231-BoM変異体は、脳および肺の条件培地よりも骨髄条件培地へと優先的に遊走します。同様に、肺への親和性を持つ231-LM2変異体は、骨髄および脳の条件培地よりも肺条件培地へと優先的に遊走します。さらに、RT-qPCR解析により、親株であるMDA-MB-231乳がん細胞を骨または肺の条件培地に曝露させると、in vivoにおける乳がん細胞の骨または肺特異的な転移に関連する遺伝子の発現が上昇することが示されました。適切に実施すれば、組織の採取および調整培地の調製セットアップは、習熟後であれば2〜3時間で完了します。その後、後日の継代操作には1日あたり15〜30分かかります。これらの手順を行う際は、常にすべてを無菌状態に保つことが重要です。条件付き培地の調製後、タンパク質アレイ、細胞増殖および遊走アッセイ、腫瘍圏（tumorsphere）形成、RT-PCRなどのその他の手法を用いて、臓器特異的因子が癌細胞の挙動に及ぼす影響について、さらなる疑問を検討することが可能です。本手法の開発により、乳癌研究分野の研究者がex vivoモデルシステムを用いて臓器特異的な転移挙動を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、マウスの骨、肺、および脳を用いて条件付き培地を調製する方法について十分に理解できるはずです。鋭利な解剖器具の使用には危険が伴うため、本手順の実施中は、正確かつ慎重な解剖技術を用いるなど、常に十分な注意を払ってください。

generation-organ-conditioned-media-applications-for-studying-organ

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JoVE Journal

Medicine

医学

このビデオでは、マウスの肝臓に由来する臓器馴染培地を生成する方法について説明しています。このモデル系は、臓器由来の可溶性因子と、それらががん細胞の臓器親和性および転移挙動に及ぼす影響を同定し、研究するために使用できます。...

臓器馴化培地:転移性がん研究のための採取臓器細胞からの培地の生成

無傷の組織オルガノイドを用いた初代培養細胞は、多細胞のin vivoでの微小環境を模倣するモデル系を提供する。我々は、酵素的組織破壊することなく、形態分化混合細胞培養系統や展示を永続無血清原発性乳房上皮組織培養モデルを開発した。乳オルガノイド&gt;は6ヶ月間生存したまま。...

マンモスフィアの自然発生の事前侵襲乳房病変の非酵素的、無血清組織培養

プロトコルは、ヒト骨組織外植片モデル系において乳癌細胞の移動、増殖およびコロニー形成を研究するために記載されている。...

培養ヒト大腿骨組織外植するための方法は、転移性ニッチの乳癌細胞コロニー形成を研究する

マウス乳腺から開発されたオルガノイドを照射し、上皮形質および免疫細胞との相互作用を評価することを特徴とした。照射されたオルガノイドは、照射正常組織における腫瘍細胞動員につながる可能性のある細胞間相互作用をよりよく評価するために使用することができる。...

乳腺からの照射オルガノイドの成長とキャラクタリゼーション

前立腺腫瘍解剖に焦点を当て、マウス前立腺癌モデルの壊死および解剖の方法を示す。マウス前立腺腫瘍オルガノイドの生成のためのステップバイステッププロトコルも提示される。...

前立腺癌の遺伝子組み換えマウスモデルからの腫瘍オルガノイドの生成

上皮細胞と間質細胞からなるヒト原発性子宮内膜オルガノイドを生成し、天然子宮内膜組織の特性を保持するプロトコルが提示される。このプロトコルは、子宮組織獲得から子宮内膜オルガノイドの組織処理までの方法を記述する。...

多細胞ヒト初等子宮内膜オルガノイドの生成

乳腺は二重構造であり、外筋上皮および内皮上皮細胞を含む。提示は、微分トリプシン法を用いてオルガノイドを調製するためのプロトコルである。この効率的な方法により、研究者はこれら2つの細胞タイプを別々に操作して、乳腺の形態と機能における彼らの役割に関する質問を探求することができます。...

微小トリプシン法によるモザイク乳腺オルガノイドの生成

この原稿は、同所注射された乳房腫瘍からの自然肺転移の確立および縦断的成長モニタリングの方法論を説明しており、転移カスケードのすべての段階での介入に適しています。...

インビボ 同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

このプロトコルでは、一次正常および腫瘍乳腺組織から差動遠心分離によって上皮オルガノイドを生成するためのアプローチについて説明します。さらに、包埋オルガノイドの3次元培養および免疫蛍光イメージングのための説明書が含まれています。...

継代なしの正常および腫瘍乳腺組織からのマウスおよびヒト上皮オルガノイドの生成とイメージング

患者由来の乳房腫瘍切除術または正常な乳房組織からヒト乳房オルガノイドを確立するための詳細なプロトコルがここに提供される。このプロトコルは、ヒト患者由来の乳房オルガノイドを培養、凍結、解凍するための包括的なステップバイステップの手順を提供します。...

患者由来乳房オルガノイドの確立と培養

学ぶマウスのリンパ節・骨・肺・脳由来オルガンコンディションドメディアを用いた乳がん転移挙動の研究法。器官特異的可溶性因子ががん細胞の増殖・移動・遺伝子発現に与える影響を解明するex vivoプラットフォームです。

乳がん転移挙動に関する器官特異的影響を研究するためのオルガン付きメディアおよびアプリケーションの生成

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