ワクチン接種のための発現およびウイルス様粒子の精製

ここでは、バキュロウイルスまたは哺乳動物発現系、および超遠心分離精製のいずれかを使用してウイルス様粒子を合成するためのプロトコルを提示します。この高度にカスタマイズ可能なアプローチは、安全かつ柔軟な方法で、ワクチン標的としてウイルス抗原を同定するために使用されます。

この手順の全体的な目標は、哺乳類または昆虫細胞の発現システムによって発現および分泌されるウイルス様粒子(VLP)を精製することです。この方法は、コンフォメーションに関連するウイルス抗原を安全かつ柔軟に発現および精製する方法など、ワクチン接種の分野における重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、ポリエチレングリコールを使用したタンパク質の沈殿や、VLPを濃縮するための複数の密度層の調製を必要としないことです。

この方法は、ワクチンの標的としてのウイルス抗原の同定に関する洞察を提供しますが、VLPは疾患の診断や血清学のツールとしても使用できます。初心者が適切な技術を行使できない可能性があるため、VLP再懸濁ステップのグリセロールアンダーレイを学ぶのが難しいため、この方法を視覚的に示せることが重要です。トランスベクション当日は、メーカーの推奨に従ってリポソームとDNA溶液を調製してください。

HAからNAからGagまでの1〜1〜2のDNA組成と、T150フラスコあたり40マイクログラムの総DNA量でDNA細胞をトランスベクトします。この手順を繰り返して、合計容量200ミリリットルのT150フラスコを9個作成します。次に、DNAおよびリポソーム溶液を抗生物質を含まない無血清トランスベクション培地で希釈し、各フラスコに総容量24ミリリットルが含まれるようにします。

フラスコをインキュベーターに戻し、ウイルス様粒子(VLP)が収穫される日まで、細胞とトランスベクション培地を維持します。上清を50ミリリットルの円錐管に移し、トランスベクション後72〜96時間後に細胞から培養物を回収します。細胞をスピンダウンして、細胞の破片をペレット

上清を収集し、0.22ミクロンの注ぎ膜でろ過します。以前に調製したSpodoptera frugiperda(Sf9細胞)をスピナーフラスコ内の懸濁液中で、マルチポイントスターラープレートシステム上で130rpmで連続的に攪拌することにより培養します。適切な曝気のために、培養量をスピナーフラスコの半分以下の容量に維持します。

次に、スピナーフラスコに250ミリリットルのSf9細胞を1ミリリットルあたり6細胞の2倍の密度で、あらかじめ調製した組換えバキュロウイルスに感染させてCHIK VLPを発現させ、細胞を摂氏28度のインキュベーターに戻します。トリパンブルー排除を使用して、細胞の生存率が70〜80%に低下したかどうかを判断します確認後、培養物を懸濁液から直接50ミリリットルの円錐管に移し、細胞をスピンダウンします。上清を収集し、沈殿する前に0.22ミクロンの注ぎ膜でろ過します。

25mm×89mmのオープントップ超遠心チューブ6本を70%エタノールで滅菌します。次に、エタノールが完全に乾いていることを確認します。きれいなチューブに32ミリリットルの上清を入れます。

次に、上清を3ミリリットルの滅菌20%グリセロールとPBSで慎重に下に置きます。グリセロールとVLP溶液の間の薄い密度層が乱れないように、グリセロールをゆっくりと下敷きします。グリセロールの分注が早すぎると、グリセロールとVLP溶液が混ざり合い、VLPの沈降が減少します。

チューブのバランスが取れていることを確認してから、スピンを開始します。4時間後、チューブを遠心分離機から取り外します。ペレットがチューブから外れないように注意しながら、上清を吸引します。

沈殿したVLPをチューブの底に少なくとも100マイクロリットルで滅菌PBSとともに、穏やかかつゆっくりとピペッティングして再懸濁します。VLPペレットの再懸濁は、ピペットを使用してPBSを穏やかにゆっくりと繰り返し吸引し、排出して実行する必要があります。.VLPの損失を制限するために、気泡の作成は避けてください。

従来のBCAアッセイからのVLP容量および総タンパク質収量は、さまざまなSVPおよびVLPコンストラクトから得られました。CHIK SVPは、Sf9細胞から得られる総タンパク質量を上清1ミリリットルあたり0.008〜0.016ミリグラム

一方、哺乳類の293T細胞による産生は、タンパク質の10倍の減少をもたらします。この電子顕微鏡写真は、HA GagコアインフルエンザVLPがVLPとして発現、アセンブル、精製に成功していることを示しています。この手順を試みるときは、健康で生存可能な細胞培養物のみをトランスベクションして感染させることを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、BCA、ELIZA、HAアッセイなどの他の方法を実行して、機能的なHAの総タンパク質含有量、特異的抗原含有量、および発現を測定することができます。超遠心分離機での作業は危険な場合があり、この手順を実行する際には、チューブのバランスをとる、推奨されるローターと速度のみを使用する、新しいラボ担当者の適切な監督などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。