ワンステップの負のクロマトグラフィー精製

この精製の総合的な目的は、ジエチルアミノエチル（DEAE）イオン交換樹脂を用いたネガティブモードバッチクロマトグラフィーにより、機能的なHelicobacter pylori好中球活性化タンパク質（HP-NAP）を、高純度かつ高収量で、天然の状態のまま得ることです。この手法の主な利点は、HP-NAPを天然の状態のまま、一段階で高純度かつ高収量に精製できることです。HP-NAPのネガティブ精製は、細菌溶解液からの可溶性タンパク質画分をDEAE樹脂に加えるバッチ結合工程から始まります。

混合物をインキュベートし、全タンパク質をレジンに結合させます。その後、重力流による遠心分離により、未結合分画に含まれるHP-NAPを回収します。この手法の意義は、Helicobacter pylori関連疾患の10:1の予防治療および予後診断、ならびにがん治療にあります。

HP-NAPは免疫原性および免疫調節特性を有しています。一般的に、この手法に慣れていない方は、滅菌中にHP-NAPが凝集しやすいため、苦労することがあります。

手順の実演は、当研究室の大学院生であるZhi-Wei Hongが行います。4°Cの条件下で、テキストプロトコルに従って調製した50 mLの細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤混合物を含むpH 9.0の低塩Tris緩衝液20 mLに懸濁します。タンパク質の凝集を防ぐため、サンプルを4°Cに維持することが極めて重要です。

4 °Cで15,000から20,000 PSIの範囲で動作する高圧ホモジナイザーに細菌懸濁液を7回通過させ、細菌細胞を破砕します。ライセート（溶解物）が得られたら、直ちに遠心分離を行います。ホモジナイズしたサンプルを遠心管に移します。

超遠心機を用いて、細胞溶解液を4°C、30,000 ×gで1時間直ちに遠心分離し、可溶性タンパク質画分と不溶性タンパク質画分を分離します。遠心分離後、上清を可溶性タンパク質画分としてビーカーに移します。メーカーの指示に従い、牛血清アルブミンを標準物質とした市販のキットを用い、ブラッドフォード法で可溶性タンパク質画分のタンパク質濃度を測定します。

次に、可溶性タンパク質画分 20 mL に 1 N HCl を 177.6 µL 加え、pH 値を pH 9.0 から pH 8.0 に調整します。タンパク質溶液に 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) と 50 mM NaCl を加え、最終タンパク質濃度が 0.5 mg/mL となるようにします。15 mL の DEAE レジンを調製するには、0.6 g の DEAE レジン乾燥粉末を 30 mL の Tris-HCl バッファーに懸濁させ、室温で少なくとも 1 日間静置します。

レジンを4°Cで10,000 ×gにて1分間遠心分離し、上清を除去して廃棄します。次に、15 mLのTris-HClバッファーを加えます。この遠心分離と再懸濁の工程をさらに4回繰り返した後、沈殿した15 mLのレジンを4°Cで保存し、後で使用します。

4 °Cで作業を行い、調製した可溶性タンパク質 45 milliliters をレジンの milliliters に加え、撹拌子を入れた 100 milliliter のビーカーに移します。スターラーを用いて 4 °Cで1時間、タンパク質レジンスラリーを撹拌します。次に、タンパク質レジンスラリーをストップコック付きのプラスチック製またはガラス製カラムに注ぎ、重力下でレジンを沈殿させます。

ストップコックを開き、コラム内の液面がレジンの直上になるまで、重力流によってタンパク質溶液をカラムに通します。流出液を、精製された好中球活性化タンパク質を含む非結合分画として回収します。氷冷したTris-HClバッファー15 millilitersをカラムに加えます。

再びストップコックを開き、カラム内の液面が樹脂の直上になるまで、洗浄バッファーを重力流で流します。流出液を洗浄分画として回収します。氷冷したバッファーで洗浄をさらに4回繰り返し、追加の洗浄分画を回収します。

次に、氷冷した20 mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 M NaCl溶液を15 mL、カラムに加えます。前回と同様に、流出液を溶出分画として回収します。溶出ステップをさらに4回繰り返し、追加の溶出分画を回収します。

E.coli溶解液におけるHP-NAPの溶解度に対するpHの影響をここに示します。この可溶化画分で検出されたHP-NAPの量は、pH 7.5から9.5において著しく増加しました。pH 9.0で細胞溶解を行った際、組換えHP-NAPはほぼ完全に可溶化画分に回収されました。

ここでは、バッチモードでのDEAEレジンを用いたE.coli発現組換えHP-NAPのネガティブ精製におけるpHの影響を示します。pH 8.0では、溶出分画にわずかな量のHP-NAPしか存在しませんでした。非結合分画に含まれるHP-NAPの量は、pH 8.0で最大となりました。

E.coliからの不純物を吸収する樹脂の最大容量を達成するために、DEAE樹脂にロードする最適タンパク質量は、樹脂1mLあたり1.5mgのタンパク質である。pH 8.0において、バッチモードでDEAE樹脂を用いた場合、非結合画分として回収されるタンパク質は、天然形態のHP-NAP以外にほとんど存在しない。HP-NAPの純度は95%を超えていた。

ゲルろ過クロマトグラムおよび遠紫外円二色性スペクトルにより、精製されたHP-NAPはαヘリックスの二次構造を持つマルチマーとして折りたたまれていることが明らかになりました。ルミノール依存性化学発光アッセイにより、精製されたHP-NAPが好中球による活性酸素種の産生を誘導できることが示されました。これらの手法に習熟すれば、適切に実施することで5時間以内に完了させることができます。

このビデオを視聴することで、DEAEおよび陰イオン交換樹脂を用いたネガティブモードバッチクロマトグラフィーにより、天然形態の機能的なHP-NAPを高収率かつ高純度で精製する方法を十分に理解することができます。この手順を行う際は、バッチクロマトグラフィーの滅菌ステップにおいて適切なpHの緩衝液を使用することが重要です。私たちは、天然形態のHP-NAPを精製するために、ろ過の代わりに他のクロマトグラフィー手法を適用しようとした際に、初めてこの手法を考案しました。

本手法は、E.coliで発現させた組換えHP-NAPによるアピールを目的として設計されていますが、per-sida sep-tidasなどの他の細菌発現システムにも適用可能です。この手法の視覚的な実演は、クイックコードで示されています。

さらに、滅菌およびバッチクロマトグラフィーの手順は習得が困難です。これらの工程は、時間を置かずに4 °Cで実施しなければならないためです。精製目的のタンパク質がネガティブモードでのイオン交換クロマトグラフィーに適している場合、この手順を精製プロセスの開発における出発点として適用することも可能です。

この手法の開発後、臨床研究分野の研究者は、がん治療におけるHP-NAPの活用の可能性や、Helicobacter pylori関連疾患に対するワクチン、薬剤、および診断法の開発を模索することが可能となりました。