放射性標識基質からの二酸化炭素生成での測定キイロショウジョウバエ

このプロトコルの全体的な目標は、無傷のショウジョウバエによって生成される二酸化炭素を測定し、パルミチン酸やグルコースなどの放射性標識基質を設定することです。この方法は、特定の突然変異がエネルギー代謝に影響を与える可能性があるかどうかなど、ショウジョウバエの研究者にとって重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、少数のショウジョウバエの燃料酸化を定量的、高感度、再現性のある測定が可能になることです。

フライポッドの組み立てステップでは、ハエが麻酔から回復する前に実験装置の適切な構造を確保するために小さな部品を迅速に操作する必要があるため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。Carbon-14は低エネルギーのベータエミッターであり、空気中の距離が短いですが、放射性標識分子のこぼれや実験者による偶発的な摂取を防ぐために注意する必要があります。1〜2個のマイクロキュリー放射性標識基質を15マイクロリットルのFD&Cナンバーワン青色食品染料および水と混合して、総容量25マイクロリットルを得る。

放射性標識された基質と青色染料のすべてをパイプヘッドで空のフライフードバイアルの底に混ぜます。フライフードバイアルは転倒しやすいため、転倒を防ぐ容器に収納してください。標準的なフライフードを電子レンジで加熱し、食品が液化するまで加熱します。

高出力レベルで15〜20秒は、通常、10ミリリットルの食品を含む1つのバイアルに十分です。放射性標識基板と青色染料混合物に975マイクロリットルの溶融食品を加え、青色の均一性を監視しながらすばやく渦巻き、完全な混合を確保します。パイプヘッドの先端をハサミで切って狭い端を広げる必要がある場合があり、これによりビスカス溶融食品の正確なパイプヘディングが可能になります。

食品を冷まし、室温で20〜30分間完全に固化させます。多孔質ポリエチレンをアクリルベースに溶かし、圧力調整器で二酸化炭素タンクに連結した二酸化炭素麻酔装置を使用して、成虫のハエを麻酔します。毎分5リットルで二酸化炭素を麻酔装置に流します。

麻酔をかけたハエを、放射性標識された青色に染められた食品が入ったバイアルに移します。各バイアルをフォームストッパーでキャップし、ハエが目を覚ますまで水平に置きます。バイアルを蓋付きのアクリル容器に移します。

短期間の摂食の場合、放射性標識食品に移す前に18〜24時間飢餓状態になり、2〜3時間の給餌ステップ中に食事ができることを確認します。5〜7日間の長期給餌の場合、ハエを飢える必要はありませんが、実験者はバイアル内の放射性標識食品の水分含有量を監視し、針と注射器を使用して乾燥食品の入ったバイアルに水を追加する必要があります。放射性標識基質の供給期間が終了したら、ハエを新しいバイアルに軽くたたいて、ラベルのない食品に移します。

最初の追跡期間は2〜4時間で、ハエは放射性標識された食物粒子をキューティクルからきれいにすることができ、腸内に残っている放射性標識された食物の消化が可能になります。ハエを目視検査して腸内の食物の進行を監視し、青い腹部を探します。その後、ハエを異なる食品の種類または周囲温度に移します。

この追跡期間の長さは、実施される実験によって異なります。二酸化炭素収集装置を作る前に、C-14グルコースまたはC-14パルミチン酸で標識されたハエを含み、大気に対して開いたままにするメッシュキャップ付きチューブであるフライポッドを構築するための材料を組み立てます。カミソリの刃を止血器で固定し、ブンゼンバーナーの炎で赤熱するまで加熱し、加熱した刃を使用して12ミリメートル×75ミリメートルのポリプロピレンチューブの上部50ミリメートルを切り取り、25ミリメートルの長さの丸底チューブを残します。

130ミクロンのナイロンメッシュを35mm×35mm四方に用意します。1インチ半から2インチの長さの透明テープを数枚切ります。次に、二酸化炭素回収装置の材料を組み立てます。

各フライポッドについて、20ミリリットルのガラスシンチレーションバイアル、オフセンター穴のあるゴムトップストッパー、センターウェル、およびグレードGFBガラスマイクロファイバーフィルターペーパーを組み立てます。上部ストッパーの穴にセンターをしっかりと挿入します。使用日に5%の水酸化カリウムを新鮮に調製します。

フライポッドに移すためにハエを麻酔する直前に、円形のGFB濾紙を折りたたんで、ゴム製のトップストッパーの穴に通されている中央のウェルに置き、100マイクロリットルの5%水酸化カリウムで飽和させます。麻酔をかけたハエをフライポッドに移すことは、このプロトコルの最も難しいステップです。成功を確実にするには、必要なすべての材料を至近距離に置き、ハエの二酸化炭素への曝露を制限し、メッシュがチューブにしっかりと固定される前にハエが目を覚まして逃げるのを避けるために迅速に作業します。

非標識培地でのインキュベーションに続いて、ハエに二酸化炭素を麻酔します。麻酔をかけたフライを切断したポリプロピレンチューブにブラシをかけ、ナイロンメッシュでキャップをし、透明なテープを使用してメッシュをチューブに接着します。特定の実験では、各ハエポッドに同数のハエを使用する必要があります。

フライポッドあたり10〜20匹のハエは、シンチレーションカウントによる測定に十分な放射性標識二酸化炭素を生成します。フライポッドを20ミリリットルのガラスシンチレーションバイアルに移します。ガラスバイアルをゴム製のトップストッパーでキャップし、水酸化カリウム飽和GFBフィルターペーパーを含むセンターウェルを保持します。

ゴムで覆われたストッパーの広い上部をガラスシンチレーションバイアルの縁に折ります。ハエの入ったガラスバイアルを蓋付きのアクリル容器にセットし、さまざまな時間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、ガラスバイアルのキャップを外し、水酸化カリウム飽和GFBフィルターペーパーを4ミリリットルのシンチレーションカクテルを含む6ミリリットルのプラスチックシンチレーションバイアルに移します。

追加のシンチレーションバイアルを準備し、1つはバックグラウンドとして機能する未使用のGFB濾紙を含み、1つは0.1〜0.5マイクロキュリー放射性標識基質を含む他の1〜2バイアルを準備して、マイクロキュリーあたりの1分あたりのカウントを決定します。シンチレーションカウンターを使用して、メーカーのプロトコルに従って各サンプルの1分あたりのカウントを測定します。その後、議定書のテキストに記載されているように、総二酸化炭素排出量を計算します。

ハエを18時間絶食させ、放射性標識パルミチン酸を2時間給餌した後、12匹または25匹の動物からなるグループで放射性標識二酸化炭素の生成を3時間または6時間のインキュベーションで試験しました。このグラフが示すように、25匹のハエが生成する二酸化炭素の量は12匹のハエが生成する量とほぼ2倍になり、インキュベーション時間を3時間から6時間に増やすと各グループの量は2倍になりました。ピコモラ放射性標識二酸化炭素は、1ハエあたり1時間あたり、各グループでほぼ同等でした。

空腹時はベータ酸化による脂肪酸の分解を刺激するため、空腹時動物では脂肪酸酸化による二酸化炭素産生が、給餌動物と比較して上昇するはずです。これを試験するために、18時間絶食したハエに放射性標識パルミチン酸を2時間与え、2つのグループに分けて、標識されていないハエの餌、または1%寒天に移しました。2つの別々の実験では、寒天に追いかけられたハエは、食物に追いかけられたハエよりも有意に多くの放射性標識二酸化炭素を生成し、絶食した動物でベータ酸化が増加したことを示しています。

この手順に続いて、総二酸化炭素排出量、総酸素消費量の測定、呼吸交換率の計算などの補完的な方法を実行して、好ましい燃料源が何であるかなどの追加の質問に答えることができます。このビデオを見た後、このプロトコルを使用して、特定の突然変異または実験的操作が特定の燃料をエネルギー源として使用する能力に及ぼす影響を判断する方法を十分に理解しているはずです。放射能を扱う作業は危険な場合があり、この手順を実行するときは、手袋、白衣、ゴーグルの着用、適切なシールドの使用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。