Name: 放射性標識基質からの二酸化炭素生成での測定キイロショウジョウバエ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 学ぶ放射性標識基質を用いたDrosophila melanogasterの燃料酸化測定法。シンチレーションカウンティングでCO₂生成を定量的に評価し、遺伝子変異がエネルギー代謝に与える影響を解析できます。

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著者は、NIDDK(R21DK089391)からの有益なアドバイスと資金援助について、Mingjian Lu博士とMorris Birnbaum博士に感謝します。

放射性標識代謝基質を含有するフライ食品の調製<ol><li> 2μCiの放射性標識された基質（D- -グルコース[6- 14 C] -グルコース、D- [1- 14 C]または[1- 14 C] -パルミチン酸、40 - - 60 mCiの/マイクロチューブでは、1を混ぜます総容量25μlと等しくなるように15μlのFD＆C第1の青色食用色素及びH 2 Oとのミリモル）。 注意：カーボン-14は、低エネルギーβ放射体であり、空気中の短距離を持っています。しかし、実験者によって、放射性標識分子または誤飲のこぼれを防止するために注意してください。食品のバイアルが簡単にひっくり返るフライ。放射性標識は、液体の形態（ステップ1.2）で、または未固化の食品（ステップ1.4）である場合は特に、転倒からそれらを防ぐことができますコンテナでそれらを収容するようにしてください。供給されているか、放射性標識された基質を供給してきたハエが、放射性標識CO 2の少量を吐き出すために開始されます。これらのハエは、ヒュームフードにアクリルボックスに保管し、KOH CAの小皿する必要がありますnはCO 2スクラバーとして使用するためのボックスで設定すること。 </li><li>ピペットで空のフライ食品のバイアルの底に放射性標識された基板と青色色素ミックスのすべて（高さ9.4センチ、幅2.2センチ）。 </li><li> （ - 食品10 mlを含む1つのバイアルのための高電力レベルで20秒15）食品が単に液化するまで加熱標準は、電子レンジで食品を飛びます。 </li><li>青色の均一性を監視することは、完全な混合を確実にするために、旋回迅速に放射性標識された基板/青色色素ミックスに975μlの溶融食品を追加します。 </li><li> 30分 - 食品を冷却し、20室温で完全に固化することができます。 </li></ol>大人のショウジョウバエに放射性標識代謝基質を餌2 <ol><li>大人が多孔性ポリエチレンアクリルベースに融合し、圧力調整器とCO 2タンクに接続からなるCO 2麻酔装置を使用して飛ぶ麻酔。 5L /分で麻酔装置に流入CO 2。 <ol><li>転送麻酔（ - 1バイアルあたり30ハエのn = 15）dは、放射性標識、青染め食品を含むバイアルに飛びます。キャップフォームストッパー付きバイアル、およびハエが目を覚ますまで水平に置きます。蓋付きのアクリル容器に移すバイアル（180センチメートルのx 180センチメートル×240センチの高さ）。 </li></ol></li><li> 2のための放射性標識された食品にハエを転送する前に24時間- -短期給餌のために、18のためのハエを飢えさせる。3時間の供給工程T彼飢餓ステップが重要です給餌ハエは確実に彼らに提示食品の新しいソースを食べていますので、 。 5にわたって長期的な給餌のために - 7日、ハエが飢餓状態にする必要はないが、実験者はハエが内に収納されているバイアル中の放射性標識された食品の水分含有量を監視し、バイアルに水を追加するために、針と注射器を使用する必要があります乾燥食品と。 </li><li>転送は、新しいバイアルにそれらを「タップ」することによって標識されていない食品に飛びます。 2の最初の追跡期間 - 4時間はハエが彼らのキューティクルから放射性標識された食物粒子をきれいにすることを可能にし、放射性標識の消化を可能にします腸内に残っ編食品。青色の腹部を探すためにハエの目視検査により、腸を通る食物の進行状況を監視します。 </li><li> 18 Cまたは遺伝30℃で96時間 - または周囲温度 - （呼吸に摂食状態対絶食状態の効果を測定するための標準的な食品または1％寒天上で24時間12）（12続いて、転送が異なる食品の種類に飛びます操作のために、例えば 、温度感受性GAL80（GAL80 TS）を使用して）。 注：このチェイス期間の長さは、実行される実験に応じて変化します。 例えばのために、30℃で96時間の追跡が順にGAL80 TSを用いた実験で必要になる場合があり、完全にGAL4依存導入遺伝子の発現を活性化します。 </li></ol> CO 2 -コレクション装置の調製<ol><li> 14 C-グルコースまたは14 C-パルミチン酸および股関節で標識されたハエが含まれています&quot;飛ぶポッド」、メッシュキャップチューブを構築するために材料を組み立てますトンは大気に開いたままになります。 25ミリメートル長、丸底チューブを残し、12ミリメートル×75ミリメートルのポリプロピレンチューブのトップ50ミリメートルをカット。 130μmのナイロンメッシュ35ミリメートル×35ミリメートルの正方形を準備します。また、テープディスペンサーに透明テープを得ます。 </li><li> CO 2 -collection装置のための材料を組み立てます。各ポッドを飛ぶために、20mlガラスシンチレーションバイアル、オフセンターホールを有するゴムトップストッパー、よくトップ栓に穴を通って挿入される中心、グレードGF / Bガラスマイクロファイバー濾紙（2.1センチメートル直径を組み立てます円、1μmの孔）。 GF / Bフィルター紙は、その高い湿潤強度、高負荷容量が使用されています。 </li><li>使用日に5％のKOHの新鮮を準備します。ただ、ステップ3.4前に、中央に円形のGF / Bフィルター紙を折ると置くだけでなく、それはゴム製のトップ栓の穴に通され、5％KOHの100μlで、それを飽和します。 図1を参照してください。 </li><li>標識されていない培地上でのインキュベーション（複数可）以下、Anesthetizeは、CO 2を飛びます。ブラシは、カットオフポリプロピレンチューブに飛ぶナイロンメッシュ付きキャップ、およびチューブにメッシュを接着する透明テープを使用しています。ハエが目を覚ますと、メッシュがしっかりチューブに貼付されている前にエスケープ回避するために、迅速に作業。ハエの等しい数は、特定の実験のためのポッドフライそれぞれに使用すべきです。 10 -フライポッドあたり20ハエはシンチレーション計数（下記ステップ4.1）による測定のために十分な放射性標識し-CO 2を生成します 。 </li><li> 20mlのガラスシンチレーションバイアルにフライポッドを転送します。キャップよくKOH飽和GF / B濾紙を含む中心保持ラバートップストッパー付きガラスバイアル。ガラスシンチレーションバイアルの唇の上にゴム製の上部ストッパーの広い上部を折ります。 図1を参照してください。 </li><li>セットガラス蓋付き、アクリル容器にハエを含有するバイアル、および時間（2〜12時間がうまく動作します）の様々な期間インキュベートします。 </li></ol>結果の4.分析<ol><li>に4 mlのシンチレーションカクテルを含む6 mLのプラスチックシンチレーションバイアルにインキュベーション、キャップを取るガラスバイアル、および転送KOH飽和GF / B濾紙の終わり。 </li><li>必要な場合は、凍結保存された基板の後の決意のために-80℃のドライアイスや店舗のフライポッドで飛びます。これらのサンプルは放射性であり、従って、記憶されなければならないことに注意してください。 </li><li>追加のシンチレーションバイアルを準備します。背景と0.1を含む2人に1として機能するように、未使用のGF / B濾紙を含む1 - CPM /μCiのを決定するために、0.5μCiの放射性標識された基質を。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってシンチレーションカウンターを用いて各サンプルのCPMを測定します。 </li><li>時間当たりフライ当たりピコモル14 CO 2 / CPMとピコモル14 CO 2を計算します。各サンプルのCPM値からバックグラウンドのcpmを引きます。きちんとした放射性標識された基板のデータから、バックグラウンド補正されたcpm /サンプルのμCiのがカウント計算します。 <ol><li>使用メーカー提供の比活性および放射性標識された基質の放射化学濃度（例えば、50μCiの/マイクロモルおよび0.1μCiの/μlで、それぞれ）ピコモル/ CPMを計算します。ピコモル14 CO 2 /サンプルに14 CO 2 /サンプルのcpmからバックグラウンド補正されたフライポッドデータを変換するために、この係数を使用します。その後、ハエの数とフライポッド内の時間の数で割ます。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+flies+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Fruit flies in biomedical research.</a> Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).</li>
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</ol>

著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。

このプロトコルは、大人のキイロショウジョウバエにおける特定の放射性標識された基質の酸化を測定する方法を説明します。この手法は、簡単な定量的、再現可能かつ高感度であり、そしてATP産生のために酸化される栄養素（単数または複数）を同定するために使用することができるので、総CO 2産生およびO 2消費量を測定する既存の方法を補完します。 ここに記載された方法を用いて特定の放射性標識基質の酸化から遊離したCO 2の測定は、総CO 2産生を測定する技術に相補的です。総CO 2生成（VのCO2）は代謝率の推定を可能にし、合計O 2消費（V O2）が既知である場合、代謝率を算出することができ、酸化のための燃料源は、呼吸交換比（Vに基づいて推定することができますCO2 / V O2 = RER）。いつ炭水化物は排他的な基板、RER = 1であるが、脂肪酸は、グルコースと脂質酸化の反応の化学量論により、排他的なソース、RER = 0.7であるとき。 ショウジョウバエ 14内の酸素消費量を測定するための装置の不存在下で、酸化性燃料源を特定することができません。しかし、標識により1放射性基質または他の微量で飛ぶと、放射性標識CO 2生産の速度を測定、1は、刺激の間に異なる時点で与えられた基板を酸化するハエの能力について、またはAの効果について結論を出すことができます燃料酸化に変異を与えられました。 このプロトコルにおける重要なステップの数があります。流出および研究領域の汚染を避けるために、放射性物質を使用する場合、最初に注意を払うべきです。ステップ2.1と3.4の間にハエを麻酔ときに、第2、実験者は長期のCO 2の影響を避けるために迅速に取り組むべきです代謝や行動に暴露。 20ハエのグループは、麻酔をかけ、新しいバイアルに、または20秒以下でフライポッドに移すことができます。食品バイアルに麻酔装置から転送された場合、バイアルは、食品の表面に立ち往生から麻酔をかけたハエを防ぐために、その側に載置されるべきです。ハエは、ステップ2.2のように、数日間にわたって放射性標識された食品を供給している場合、実験者はハエが脱水に敏感であるとして、食品が乾燥しないようにしてください。 摂食または絶食状態標識前に、標識の選択、ラベリング時間の長さ、フライポッド内の時間の長さ、および麻酔の方法は、この技術を使用している場合、トラブルシューティングおよび修正を施すことができるパラメータです。まず、短い標識期間にさらさハエ（2から3時間）は、事前に絶食期間に供されない限り、放射性標識食品のかなりの量を消費する可能性は低いです。ラベルcの第二に、選択一つは、代謝表現型について描画することが可能である結論に影響を与えます。 D-からの放射性標識CO 2生産[6- 14 C] -グルコースが酸化を反映しているのに対し、例えばD-から、放射性標識されたCO 2の生産[1- 14 C] -グルコースは、クエン酸サイクルまたはペントースリン酸シャントを介して酸化を反映することができますクエン酸サイクルを通じてのみ12,15,16。必須アミノ酸17,18のための放射性標識トレーサーとハエを供給してタンパク質に由来するアミノ酸の酸化を評価するための良い戦略でしょう。最後に、放射性標識されたグルコースとの長い標識期間はまた、トリグリセリド19と、このような容易にピルビン酸と相互変換するアラニンなどのアミノ酸などの分子の他のクラスにこの前駆体の取り込みの可能性を提起します。これは、分子6のこれらの異なるクラスに組み込まれた放射能を測定することによって評価することができます。確かに、ハエの独立したコホートは、ラジアンを供給することができます。同様にして基板をiolabeledし、次いで、例えば、条件6を保存し、摂食中のグリコーゲン及びトリグリセリドのままであり、絶食されたフライポッド実験または放射性標識の測定に使用しました。別の戦略は、放射性標識された食事の栄養素自体ではなく、これらの栄養素の貯蔵形態の酸化を明らかにする可能性がある短い標識期間を使用することです。第三に、ハエの二つのグループが最初に一定時間以上14 CO 2生産の同一速度が、非常に異なる速度を有し得ることも可能です。したがって、フライポッドに費やす飛行時間の量を変化させることは、表現型の変化を評価する際に変更するための重要なパラメータです。最後に、このプロトコルは、フライポッド装置にハエを入れ、CO 2麻酔の短期間の使用を呼び出します。 CO 2麻酔フライポッド実験の過程で代謝機能に影響を与える可能性があります。代替Approachは代謝率20に影響を与えない窒素麻酔を使用することです。 燃料の酸化および代謝率のような複雑なシステムを測定する任意の技術と同様に、ここで説明した方法には限界があります。まず、基板の異なる出発量の分析のCO 2回収段階に入るであろう、従って、放射性標識、食品の様々な量を消費することができ、異なるグループに飛んでいる可能性があります。これは、大きなサンプルサイズとし、一括ハエを供給することにより、実験を行うことにより、ある程度のために制御することができます。短い標識期間については、同様の青色の根性が放射性標識を消費しているだろうし、実験のチェース部に繰り越すことができて飛びます。ハエのグループ内に残っている放射性標識の量はまた、実験の終了時および摂食初期追跡期間の終了後にハエの別々のコホートにおいて測定することができます。間の第2、活動レベルフライポッド内のハエのグループが異なる場合があります。これは、実験的に決定し、データを解釈するときに考慮されなければなりません。第三に、この技術は、特定の食物栄養またはその栄養素の貯蔵形態（複数可）からのみの生産を合計CO 2産生を測定しません。このプロトコルはに代わるものではありませんが、代わりに、それは別の、追加情報を提供するため、VCO 2の測定に相補的です。 方法ここに記載されている対策は、特定の代謝基質の微量の酸化物である放射性標識されたCO 2を吐き出さ。グルコース、脂肪酸、またはアミノ酸 - - 使用されるラベルを変えることによって一つは、飢餓などの異なる生理的条件下で、異なる遺伝的背景の代謝に異なる基質の寄与を評価するために、ますます洗練された実験を設計することができます。この技術の将来のアプリケーションは、metabolisの測定を含みます開発の幼虫と蛹の段階、それぞれの栄養貯蔵及び故障、極端なことを特徴とするショウジョウバエのライフサイクルの2段階でメートル。

モデル生物キイロショウジョウバエでの作業は、遺伝的原則、発生過程、成長、老化、行動、免疫およびヒト疾患1,2の理解に大きく貢献しています。 ショウジョウバエの遺伝的および細胞生物学的ア ​​プローチの無数のは、これらの分野での進歩を牽引してきました。しかし、ショウジョウバエにおける代謝の研究は、このような小動物で代謝パラメーターを測定することの困難に大部分起因し、よりゆっくりと開発しました。糖尿病などのヒト疾患を研究するための成長と様々な病理への代謝の貢献を理解するためのモデルとしてショウジョウバエを用いての関心は、この生物3,4のための代謝技術を開発し、適応するためのフィールドをプッシュしています。 信頼性の高い方法は、今ショウジョウバエにおける代謝パラメータの数を測定するために利用可能です。例えば、食物摂取量を評価することは簡単です<s&gt; 5まで、保存されたトリグリセリドおよびグリコーゲン、ならびにグルコースの循環血リンパレベルとグルコース4の2分子からなる二糖であるフライ、トレハロース、中の主要な循環砂糖のレベル。代謝トレーサーの使用は、このようなストレージ・フォームグリコーゲンやトリグリセリド6にグルコースなどの食事と吸収された栄養素の変換からの栄養吸収の研究を可能にしました。代謝率は、果実において評価することができる酸素消費7,8及び二酸化炭素（CO 2）産生の測定を飛びます。クエン酸サイクルは、食事および格納された炭水化物及び脂肪酸の代謝に由来するアセチル補酵素A（COA）としてサイクルに入ることができる2つの炭素単位を酸化します。サイクルの各ターンは、一分子GTP（またはATP）の各々と電子供与体FADH 2、NADHの3分子、及び廃棄物CO 2の二つの分子を生成します。 CO 2産生することができます基礎代謝率を推定するために使用することができます。総CO 2生成は、市販又は手製呼吸計9-10,11の使用により、ショウジョウバエで定量化することができます。 特にO 2消費の測定に結合された総CO 2産生の測定は、全身のエネルギー代謝に貴重な洞察を提供します。しかし、この尺度は、アデノシン三リン酸（ATP）の生産のために酸化される栄養素を特定するものではありません。炭水化物、脂肪酸、およびタンパク質：栄養素の三つの主要なクラスは、アセチルCoAへの変換以下のクエン酸サイクルに入ることができます。食事グルコースまたは保存されたグリコーゲン由来のグルコース-6-リン酸は、アセチルCoAを形成するピルビン酸デヒドロゲナーゼによって脱炭酸されてピルビン酸に変換することができます。その後、クエン酸サイクルに入るアセチルCoAのβ-酸化利回りによって食事から、または保存されたトリグリセリドから誘導される脂肪酸の​​内訳。最後に、アミノ酸の大部分は、例えばα-ケトグルタル酸などのCoAまたはクエン酸サイクル中間体アセチル、ピルビン酸への変換以下のクエン酸サイクルに入ることができます。 基礎および刺激条件時のエネルギー代謝に栄養固有の貢献は、放射性トレーサーの使用を介して監視することができます。ここに提示プロトコルは、培養12,13で増殖させた細胞における酸化を評価するために使用されるプロトコルからショウジョウバエにおける使用のために適合されています。このアプローチでは、ショウジョウバエは、標識されていない食品に追わ（時間）または長い（日）短パルスのための食事中の14 C放射標識代謝基質（炭水化物、脂肪酸、またはアミノ酸）、供給され、その後にさらさチャンバ重炭酸塩としての呼気CO 2を捕捉するための水酸化カリウム（KOH） -飽和濾紙を含みます。放射性標識重炭酸塩は、シンチレーション計数によって定量することができます。実験の間、放射性標識-CO 2産生の違いハエのAl基は、例えば、遺伝子型との間の燃料代謝の長期高速または内因性の違いにわたってATP産生のための異なる燃料の使用を反映することができます。

<table><tbody><tr><td>パルミチン酸、[1-14C]-、50 &micro;CI</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC075H050UC</td><td></td></tr><tr><td>グルコース、D-[6-14C]-、50 &micro;CI</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC045X050UC</td><td></td></tr><tr><td>グルコース、D-[1-14C]-、50&micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC043X050UC</td><td></td></tr><tr><td>ショウジョウバエ バイアル、ナロー、ポリスチレン</td><td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>丸底ポリプロピレン チューブ、12 x 75 mm</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>14-959AA</td><td></td></tr><tr><td>メッシュ、ニテックス ナイロン、120 & マイクロ;m</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>57-102</td><td></td></tr><tr><td>20 ml ホウケイ酸ガラスシンチレーション・バイアル</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>03-337-15</td><td></td></tr><tr><td>オフセンター穴付きフラスコ・トップ・ストッパー</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>K882310-0000</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン・センター・ウェル</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>K882320-0000</td><td></td></tr><tr><td>ワットマン GF/B ガラス・マイクロファイバー・フィルターペーパー、円、直径</td> <td>2.1cmフィッシャーサイエンティフィック</td><td>09-874-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td></td></tr><tr><td>6 mlシンチレーションバイアル、プッシュオン/ツイストオフキャップ付き</td><td>National Diagnostics</td><td>SVC-06</td><td></td></tr></tbody></table>

放射性標識基質からの二酸化炭素生成での測定<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

ショウジョウバエ遺伝学の力はますますホルモンシグナル伝達および代謝の質問およびこの生物においてヒト疾患のモデルの開発に適用されています。このような代謝率などのパラメータの測定のための感度の高い方法は、ショウジョウバエなどの小動物に生理学や病気の理解を駆動するために必要とされています。ここで説明する方法は、グルコースまたは脂肪酸のような14 C標識基質の微量を含有する食品を給餌成体ハエの少数の燃料酸化を評価します。給餌期間及び追加の実験操作後、ハエは、放射性標識CO 2が炭酸水素カリウムのような放射性標識基質の酸化から生成された場合、トラップは呼気KOH飽和濾紙を含むガラスバイアルに配置されたメッシュでキャップ短いチューブに転送されますKHCO 3。この放射性標識された重炭酸塩をシンチレーション計数によって測定されます。これは水溶液であり、燃料酸化の研究のため、uantitative再現性、および簡単な方法。放射性標識グルコース、脂肪酸、またはアミノ酸の使用は、摂食および絶食等の異なる遺伝的背景における異なる条件下でのエネルギー代謝にこれらの異なる燃料源の寄与の決意を可能にします。これは、 生体内エネルギー代謝に測定するために使用される他のアプローチを補完し、代謝調節をさらに理解すべきです。

放射性基質の代謝から生成される呼気および捕捉された放射性標識されたCO 2の量は、フライポッド内のハエの数だけでなく、動物はCO 2回収装置で過ごす時間の量と相関するはずです。これをテストするには、18時間絶食させたハエは2時間の放射性標識パルミチン酸（0.02μCiの/μlの食べ物）を与えた後、3または6時間のインキュベーションのために12または25匹の動物の群における放射性標識されたCO 2産生について試験しました。 25ハエによって生成したCO 2の量は12ハエによって生成ほぼ倍の量があって、各グループの量は、インキュベーション時間は、6時間（ 図2A）に3時間から増加したときに倍増しました。ピコモル14 CO 2 /フライ/ hrでは、各グループでほぼ同等でした。 断食がSS Oによって脂肪酸の分解を刺激しますxidation;したがって、脂肪酸の酸化からのCO 2の生産は、供給された動物と比較して絶食動物において上昇する必要があります。これが事実であったかどうかを判断するには、18-hrがハエは2時間、放射性標識パルミチン酸を供給した絶食しました。この短い給電パルス以下、ハエは2つのグループに分けた後、3時間の未標識のフライ食品または1％寒天に移し、次いで、2時間ポッドを飛ぶに移しました。二つの別々の実験では、ハエがß酸化は絶食動物で増加したことを示す、食品（図2B）に追わハエと比較して有意に多くの放射性標識産寒天CO 2に追わ。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig1.jpg" /> 図1. 呼気採取するための装置であって、放射性標識CO 2。 ある放射性標識された代謝基質を消費しているハエ「フライポッド」（FP）、メッシュ（M）でキャップされたカットオフ遠心管に入れました。フライポッドは、100μlの飽和GF / B濾紙を含有する中心ウェル（CW）に配置され、それを通して偏心孔を含むゴム上部ストッパ（S）で20mlガラスシンチレーションバイアルに入れ、蓋をされています5％KOH。吐き出されたCO 2は、KOHと反応し、重炭酸塩などの濾紙上に捕捉されます。追い込まれた、放射性標識されたCO 2は飽和濾紙のシンチレーション計数によって定量することができる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig2.jpg" /> 図2. 14 CO 2 生産時間と相関し、ハエの数連邦および絶食条件にフライポッドと応答します。 （A）ハエ2で製造供給された放射性標識したパルミチン酸は、試験したハエの数（N = 12（オープンバー）または25（クローズドバー））とフライポッド（3または6時間に費やされる時間と相関する14 COの量）。あたりオンザフライ基づき、ハエは0.99、1.13、1.10および1.01ピコモル14 CO 2 /時間（グラフデータとして右の順に同じ左に記載されているデータ）を生成しました。 （B）食品に追われたハエよりも、パルミチン酸より放射性標識された酸化寒天上で追跡したハエ。データは、2つの実験からであり、標準偏差として報告され、N = 16から17ハエ/グループ（実験1）。 N = 10ハエ/グループ（実験2）。 * P = 0.017、スチューデントのt検定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

この論文は、Drosophila melanogasterにおける燃料酸化の測定方法について説明しています。この方法では、微量の特定の放射性標識代謝基質がハエに供給されます。燃料の酸化から生成される呼気放射性標識CO2を収集して測定します。

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

このプロトコルの目的は、パルミチン酸やグルコースなどの放射標識基質を投与した、生きたショウジョウバエによって生成される二酸化炭素を測定することです。この手法は、特定の変異がエネルギー代謝に影響を与えるかなど、Drosophila研究における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、少数のショウジョウバエにおいても、燃料酸化の定量的で感度が高く、再現性のある測定が可能であることです。フライポッドの組み立て手順では、ハエが麻酔から回復する前に実験装置を正しく構築するため、小さな部品を迅速に操作する必要があり、本手法の視覚的な実演は極めて重要です。Carbon-14は低エネルギーのベータ線放出体であり、空気中での飛程は短いですが、放射性標識分子の漏出や実験者による誤飲を防ぐために十分な注意を払う必要があります。1〜2 microcurieの放射性標識基質を、15 µLのFD&C Number One blue食用色素および水と混合し、全量を25 µLにします。放射標識した基質と青色染料の混合物すべてを、空のショウジョウバエ用餌バイアルの底にピペットで移します。ショウジョウバエ用餌バイアルは転倒しやすいため、転倒を防止できる容器に入れて保持してください。標準的なショウジョウバエ用餌を電子レンジで加熱し、餌がちょうど液状になるまで温めます。通常、10 mLの食物を含む1本のバイアルに対し、高出力で15〜20秒間加熱すれば十分です。溶融した食物975 µLを、放射標識基質と青色色素の混合液に加え、青色の均一性を確認しながら迅速に撹拌し、完全に混合させます。粘性のある溶融食物を正確に分注するためには、ハサミでピペットチップの先端をカットして切り口を広げる必要がある場合があります。餌を室温で20～30分間放置し、完全に冷却・凝固させます。成虫のハエを麻酔させるために、アクリルベースに接合された多孔性ポリエチレンからなり、圧力調整器付きの二酸化炭素タンクに接続された二酸化炭素麻酔装置を使用します。二酸化炭素を毎分5リットルの流量で麻酔装置に導入します。麻酔したハエを、放射標識した青色染料入りの餌が入ったバイアルに移します。各バイアルをフォームストッパーで密閉し、ハエが目覚めるまで水平に置いておきます。その後、バイアルを蓋付きのアクリル容器に移します。短期給餌の場合、2〜3時間の給餌ステップ中に確実に摂食させるため、放射標識した餌に移す前にハエを18〜24時間 starvation（絶食）させます。5〜7日間にわたる長期給餌の場合、ハエを絶食させる必要はありませんが、実験者はバイアル内の放射標識餌の水分量を監視し、餌が乾燥しているバイアルには針と注射器を用いて水を補充してください。放射標識基質の給餌期間が終了したら、ハエを新しいバイアルにタッピングして移し、非標識餌に切り替えます。2〜4時間の初期チェイス期間を設けることで、ハエのクチクラから放射標識した餌粒子が除去され、腸内に残った標識餌の消化が進みます。ハエの腹部が青くなっているかを目視で確認し、腸管内を餌が通過する進行状況をモニターしてください。その後、ハエを異なる種類の餌または周囲温度条件下へ移します。このチェイス期間の長さは、実施する実験によって異なります。二酸化炭素回収装置を作成する前に、C-14グルコースまたはC-14パルミチン酸で標識したハエを収容し、大気に開放しておくためのメッシュ蓋付きチューブであるフライポッドを構築するための材料を準備します。止血鉗子でカミソリの刃を固定し、ブンセンバーナーの炎で赤くなるまで加熱します。加熱した刃を使用して、12 mm × 75 mmのポリプロピレンチューブの上部50 mmを切り落とし、長さ25 mmの丸底チューブを作成します。130 µmのナイロンメッシュを35 mm×35 mmの正方形に準備します。透明テープを1.5～2インチの長さに数本カットします。次に、二酸化炭素回収装置の材料をそろえます。各フライポッドについて、20 mLのガラス製シンチレーションバイアル、中心からずれた穴のあるゴム栓、センターウェル、およびGFBグレードのガラスマイクロファイバーフィルターペーパーを用意します。センターウェルをトップストッパーの穴に挿入します。5%水酸化カリウムは、使用当日に調製してください。フライポッドへ移送するためにショウジョウバエを麻酔させる直前に、円形のGFBフィルターペーパーを折りたたみ、ゴム製トップストッパーの穴に通されたセンターウェルに配置し、100 µLの5% 水酸化カリウムで飽和させます。麻酔したハエをフライポッドに移送する工程は、本プロトコルの中で最も困難なステップです。確実に成功させるために、必要なすべての資材をすぐに手の届く範囲に用意し、ハエの二酸化炭素への曝露時間を短縮し、またメッシュをチューブにしっかりと固定する前にハエが覚醒して脱走するのを防ぐため、迅速に作業を行ってください。ラベルなし培地での培養後、二酸化炭素でハエを麻酔させます。麻酔したハエを切り出したポリプロピレンチューブに刷り込み、ナイロンメッシュで蓋をし、透明テープでメッシュをチューブに固定します。特定の実験において、各フライポッドに使用するハエの数は等しくする必要があります。フライポッドあたり10〜20匹のハエがいれば、シンチレーション計数で測定するのに十分な放射標識二酸化炭素が生成されます。フライポッドを20 milliliterのガラス製シンチレーションバイアルに移します。水酸化カリウムを飽和させたGFBフィルターペーパーを含むセンターウェル付きのゴム栓で、ガラスバイアルを密閉します。ゴム栓の幅広の上部をガラス製シンチレーションバイアルの縁に折り畳んで被せます。ハエを入れたガラスバイアルを蓋付きのアクリル容器に入れ、時間を変えてインキュベートします。インキュベーション終了後、ガラスバイアルの蓋を開け、水酸化カリウム飽和GFBフィルターペーパーを、4 mLのシンチレーションカクテルが入った6 mLプラスチック製シンチレーションバイアルに移します。追加のシンチレーションバイアルを用意します。1つはバックグラウンドとして使用するための未使用のGFBフィルターペーパーを入れたもの、もう1〜2個は1 µCiあたりのcpm（1分間あたりのカウント数）を決定するための0.1〜0.5 µCiの放射性標識基質を入れたものとします。シンチレーションカウンターを用い、メーカーのプロトコルに従って各サンプルのcpmを測定します。その後、プロトコル本文に記載されている通りに、二酸化炭素の総生成量を算出します。ハエを18時間絶食させた後、放射性標識パルミチン酸を2時間与え、その後、1群あたり12匹または25匹の個体を用いて、3時間または6時間のインキュベーションにおける放射性標識二酸化炭素の生成量を測定しました。このグラフに示すように、25匹のハエによって生成された二酸化炭素量は、12匹による生成量のほぼ2倍であり、またインキュベーション時間を3時間から6時間に延長すると、各群の生成量は2倍になりました。ハエ1匹1時間あたりのピコモル放射性標識二酸化炭素量は、各群でほぼ同等でした。絶食はβ酸化による脂肪酸の分解を促進するため、絶食した個体では給餌した個体に比べて脂肪酸酸化による二酸化炭素産生量が高くなるはずです。これを検証するため、18時間絶食させたショウジョウバエに放射性標識パルミチン酸を2時間与えた後、2つのグループに分け、非標識のショウジョウバエ餌または1%アガロースに転移させました。2回の独立した実験において、アガロースで追跡した個体は餌で追跡した個体よりも有意に多くの放射性標識二酸化炭素を産生しており、絶食した個体でβ酸化が増加していることが示されました。この手順に続き、全二酸化炭素産生量および全酸素消費量の測定、ならびに呼吸交換比の算出といった補完的な手法を行うことで、優先的に利用される燃料源は何かといった追加の疑問に答えることができます。このビデオを視聴することで、特定の燃料をエネルギー源として利用する能力に対して、特定の変異や実験的な操作がどのような影響を及ぼすかを決定するために、このプロトコルをどのように使用すべきかについて十分に理解できるはずです。放射性物質を取り扱う際は危険を伴う可能性があるため、この手順を実施する間は、常に手袋、白衣、ゴーグルの着用や、適切な遮蔽物の使用などの予防策を講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Biology

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