Name: ジェル支援補水を使用した巨大なサイズのポリマーソームを形成します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 学ぶ ジェル支援補水法による巨大ポリマーソームの形成技術。PEO-PBDブロック共重合体を用いて、サイズ制御可能な膜構造を迅速に作製し、バイオミメティクス研究や膜物性解析に応用する方法です。

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この作業における彼らの技術的な専門知識、助言、および支援に対して、Dr. Ian M. Henderson、Andrew Gomez、Dr. Walter F. Paxtonに感謝したいと思います。この研究は、米国エネルギー省、基礎エネルギー科学局、材料科学および工学部門(BES-MSE)の支援を受けました。ACG、DYS、およびGDBはBES-MSEによってサポートされました。この研究の一部は、米国エネルギー省(DOE)科学局(ユーザープロジェクト番号RA2015A0004、PI:ACG)が運営する科学局ユーザー施設であるCenter for Integrated Nanotechnologiesで行われました。

1.ポリマーおよびアガロースの準備注意：手袋と白衣は、このプロトコルを通じて常に着用します。安全ゴーグルは、同様に、任意の有機溶媒または可能飛散を持つ任意の段階での作業時に必要とされています。 <ol><li>クロロホルム中のポリマーの5 mg / mlで溶液を調製します。 B-ポリ（ブタジエン）（PEO-PBD、EO 22 -BD 37）が完全に溶解するガラスバイアルと旋回中のジブロック共重合体-固体のポリ（エチレンオキシド）の5 mgのクロロホルム1ミリリットルを追加します。化学ドラフト内でクロロホルムを使用して、すべての手順を実行します。 </li><li> 99.5モル％、非標識ポリマー中に0.5モル％の最終濃度で蛍光標識された脂質（購入済みクロロホルムに溶解）で混ぜます。 <ol><li>例えば、ピペット〜0の最終濃度は997.58μlのPEO-PBD、EO（2950ダルトンの分子量を有する）のクロロホルム22 -BD 37ポリマー中へのクロロホルム中1mg / mlの蛍光標識脂質の12μlの。標識された脂質を混合し5モル％、99.5モル％の重合体。 </li><li> -20℃でクロロホルム耐性蓋付きの気密バイアルに保管ソリューション。ここで、蓋のネジバイアルへのバイアルエッジで配管工のテープを巻き、バイアルに蓋を固定します。蓋の外側に配管工のテープの別の部分をラップし、最終的には最小限の蒸発を確実にするために、テープの外側にパラフィルムをラップします。 </li></ol></li><li> 250ミリリットルの三角フラスコに50mlの水（または50ミリリットルの100mMスクロース）に0.5 mgの標準アガロースを混合することにより、1％w / vのアガロース溶液を作ります。 〜1分間の標準的な電子レンジでアガロース溶液を沸騰させる（または溶液のクリアで述べたように完全に溶解するまで）。 注：アガロース溶液を冷却し、数分後に使用されるか、または固化させ、記憶されていると同様の手順を使用して再溶解することができます。 </li></ol> 2.アガロースフィルムの調製<ol><li>目詰まりを防ぐために千μlのピペットチップのオフの端をカットします。切断されたチップを用いて、ピペット3メーカーから直接25ミリメートル角のガラスカバースリップ上に溶融アガロース溶液の00μlの。 </li><li>アガロースが堆積前にへ〜65-75℃に冷却させます。アガロースはあまりにもクールであれば、それは拡散プロセスの間に表面に凝集を開始します。アガロースは熱すぎる場合は逆に、それはより多くの表面にアガロースを接着するために拡散が必要になります。 </li><li>手袋をした指でカバースリップのちょうど端を持ち、カバーガラスの表面に均等にアガロースを広めるために、別の千μlのピペットチップの長辺を使用しています。アガロースが完全に付着し、カバースリップを覆うまで前後にカバースリップ全体のピペットチップを移動します。 </li><li>アガロースを上に向けてパラフィルム片の上にアガロースでコーティングされたカバースリップを置きます。カバースリップの所望の数がコーティングされた後、少なくとも1時間、表面にアガロースを脱水し、37℃のインキュベーターにカバースリップでパラフィルムを配置します。 注：脱水アガロースの可視層の消失によって決定されます。カバーガラスは平坦で明確になります。フィルムは完全に脱水した後、店はアガロース表面は使い捨てプラスチックペトリ皿に上に向けてカバースリップ。 </li></ol> 3.ポリマーフィルムの形成<ol><li>ピペット30μlをアガロースフィルム上にポリマー溶液を調製しました。 </li><li>手袋をした指でカバースリップのちょうど端を持ち、円形の拡散運動を用いてアガロースフィルム全体のソリューションを広めるために18 G針の長辺を使用しています。溶液が蒸発するまで広がり続けます。 注意：針の尖端に注意してください。 </li><li>上向きにプラスチックシャーレポリマー側のポリマーフィルムを配置し、アルミホイルで覆われた標準的な家の真空デシケーターにシャーレを入れ、完全に任意の残留溶媒を除去するために少なくとも1時間（ラベルされた脂質の光退色を防ぐため）。 </li></ol>ポルの4の形成ymersomes <ol><li> coverwellを接着、いずれかの自家製ポリジメチルシロキサン（PDMS）もポリマーフィルムでコーティングしたカバーガラスによく（〜ミドルの〜1cmの直径を有する硬化PDMS 0.5cmの厚さのブロックを打ち抜い）または市販の。タイトなシールがcoverwellとカバーガラスとの間に形成されるまで上向きにポリマーを有するポリマーでコーティングされたカバースリップ上にそっとcoverwellを押します。あまりにもハードキーを押しますと、カバーガラスを壊さないように注意してください。 </li><li>室への200から500μlの再水和溶液（水は大丈夫ですが、バッファやマスコミの配列も動作します）を追加します（再水和量を付着coverwellのサイズに依存）。 </li><li>再水和溶液の蒸発を減少させるために湿度室を作成します。ガラスシャーレの縁に沿って巻かれ、湿ったキムワイプを置きます。湿度チャンバー内に付着しcoverwellを有するポリマーフィルムを置き、蓋をカバーしています。光退色を最小限に抑えるためにアルミホイルでペトリ皿をカバーしています。場所ホットプレート上にペトリ皿は、少なくとも30分間、40℃に設定してください。 </li><li> （ 図5）が形成された小胞のサイズ24から70°Cから調整するために再水和の間にホットプレートの温度を調整します。この温度を超えて進むときに注意を使用する必要がありますので、70°Cは、アガロースのT mの近くにあります。 </li></ol>光退色後蛍光回復によりポリマーソームの5キャラクタリゼーション（FRAP） <ol><li>イメージングのための倒立顕微鏡に直接接着coverwellでカバースリップを移動します。 </li><li>ポリマー溶液中に含まれる蛍光脂質に基づいて適切なフィルタセットを選択します。ローダミン標識脂質はポリマー溶液にドープするために、25分の560 nmの励起フィルターと36分の607 nmの発光フィルター、または同等のフィルターセットを使用しています。 </li><li>ポリマーソームが付着されるカバーガラスの上面に集中する100Xの油浸対物レンズを使用してください。ポリマーソームは特にしている場合大きな（&gt;20μM）または高分子フィルムが厚すぎると、低電力の目的（ 例えば、40倍）は、より良いポリマーソームを可視化するために使用されるべきです。 </li><li>蛍光顕微鏡を用いて、ポリマーソームを識別します。 &gt; 5μmの直径を有する特徴的な中空の球状ベシクルによってポリマーソームを識別します。 </li><li>調節可能なコンデンサーを含む蛍光顕微鏡で（FRAP）を光退色後蛍光回復を使用して、膜流動性を特徴づけます。付着自然と基板上のポリマーソームのタイトな梱包に、ポリマーソームの自然な動きは、FRAPイメージング品質を高めること、制限されています。 <ol><li>興味のあるポリマーソームに顕微鏡の焦点を合わせます。小さな領域にコンデンサーを閉じ、ポリマーソームのエッジが関心の撮像領域内にあることを確認してください。 </li><li>カメラの露出を増やして、すべてのNDフィルターを効果的に関心領域を光退色するために除去されていることを確認します。膜FLを許可します<html> 30〜60秒、または蛍光強度が有意に減少するまで、光退色するuorescence強度。 </li><li>ランプの電源を切り、完全にコンデンサーを開きます。バック開始の設定への曝露を減少させ、すぐに画像を3分間、30秒ごとのキャプチャを開始。 </li><li>標準的な方法12を使用して膜の拡散係数を計算します。漂白領域は3-5分以内に蛍光強度を回復する場合、これは、膜が液体であることを示しています。 </li></ol></li></ol>ポリマーソームサイズの6キャラクタリゼーション<img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig6.jpg" /> イメージングソフトウェアを使用して、ポリマーソームのサイズ分析のために、図6のプロセス。ステップバイステップの形成された小胞の直径を測定する方法について説明します。ユーザーが使用する顕微鏡のピクセル/μm単位のキャリブレーションユニットを知っている必要があります。ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <ol><li>画像解析ソフト13にポリマーソームの取得された画像を開きます。 </li><li>ボックスとクリック」セットのスケールを「ドロップダウン分析をクリックすることで、画像のスケールを設定します。 <ol><li>標準的な方法を用いて顕微鏡（ すなわち、マイクロメートル）のスケールを調整します。 </li><li>キャリブレーション単位で入力し、「OK」をクリックします。 </li></ol></li><li>ラインツールボックスをクリックして、小胞の直径にまたがる線を引きます。 </li><li>ボックスとクリック」対策を」ドロップダウン分析をクリックすることで、長さの測定を収集します。 </li><li>上記の手順と測定データウィンドウに追加されるそれぞれの新しい測定以下の個別の小胞を測定し続けます。 </li><li>各ラインを引き、上に引かれた線をインプリントするために長さを測定した後を押して &quot;Ctrlキー+ D&quot;画像は、簡単に分析された小胞を追跡すること。 </li></ol>

<ol><li>Streicher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+reconstituted+in+GUVs%3A+A+biomimetic+system+to+study+initial+steps+of+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1788 (10), 2291-2300 (2009).</li>
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サンディア国立研究所は、ロッキード・マーティン社の完全子会社であるサンディア社が、米国エネルギー省の国家核安全保障局のためにDE-AC04-94AL85000契約に基づき管理・運営するマルチプログラム研究所です。

ポリマーソームは、広く生体膜模倣として調査してきています。ポリマーの堅牢性と汎用性の特性は、膜機能化、長寿と調整された応答性を必要とする研究のためにそれらを広く魅力。巨大なサイズのポリマーソーム9,10（&gt; 4ミクロン）を形成する従来の方法は、労働集約的であり、高価で特殊な装置を必要とします。ここで、我々は、最初に標準の安価な実験用試薬や機器を使用して、巨大なサイズのポリマーソームを形成するための、迅速な汎用性と堅牢な方法を提示します。 ゲル支援再水和を用いて、単層ポリマーソームを迅速に形成することができる（&lt;30分）（細胞培養培地を含む）を再水和溶液の様々な異なるポリマーの様々な（データは示さず）。多重膜または非対称の小胞の形成は、この技術を用いて観察されませんでした。 B-ポリ（ -この作業を通じて、我々は、ポリ（エチレンオキシド）を使用しブタジエン）（PEO-PBD、EO 22 -BD 37）中性のジブロック共重合体。 （帯電したジブロック共重合体を含む）多くの異なるポリマー組成物は、この方法（図示せず）を使用してうまく機能します。しかし、いくつかの市販のトリブロック共重合体と高分子量のジブロック共重合体（〜&gt; 5,000ダルトン）の異なるポリマーソームを形成しません。この原稿での実験のすべてについて、標識された脂質の低濃度は、視覚化のみを目的としたポリマー溶液にドープしました。直接蛍光色素で官能化ポリマーを含む、視覚化するための他の方法を使用することもできます。蛍光顕微鏡は、より高い解像度を提供してもポリマーソームは、同様に、明視野顕微鏡で画像化することができます。 プロトコルへのほとんどのマイナーな修飾は、典型的には、結果を変更しません。例えば、カバーガラス上に広げ、ポリマー溶液の濃度の小さな差異は、ポリマーFの形成を変化させませんILMが形成されました。完全な濃度範囲が決定されなかったが、ポリマーソームの形成が正常にポリマーフィルム濃度（ 例えば 、1から10 mg / mlで）の大規模な範囲で発生します。しかし、負のポリマーソーム形成に影響を与えるか、いくつかのプロトコルの変更があります。最も注目すべきは、（代わりに、正方形の）丸いガラスカバースリップは、ポリマーソームの非常に貧しい形成をもたらすことがあります。私たちは、実際にポリマーソームの形成を妨げるガラス上にアガロースの非常に均一な被膜にこれを属性。 この技術の最も注目すべき課題の一つは、高い収率で、表面からポリマーソームを回復する能力です。元の表面からポリマーソームを削除すると有利であることが可能な特定の場合があります。脱水ポリマーフィルムからの高いバックグラウンド蛍光を、個々のポリマーソームを除去し、カバースリップをきれいにするためにそれらを付着すると、結像品質と特性評価を増加します（パルティ）FRAP分析中にcularly。 （回収された小胞の数が当初形成されたものよりも著しく低いが）これを行うには、最後がカットされたピペットチップで穏やかにピペッティングは、表面からポリマーソームを脱着します。ポリマーソームは、次にポリマーソームは、新しいカバーガラスと相互作用できるように、修正されたカバースリップの表面上に配置することができます。一般的に、中性のPEO-PBDのポリマーソームのために、15分間オゾン処理をカバースリップポリマーソームは、イメージングのために表面に落下することができます。異なる表面改質は、異なるポリマーソームの組成物（ 例えば、正または負にポリマーを荷電している）のために必要とされます。 このプロトコルで使用される大部分の材料は、うまく保存され、数日から数週間のために使用されます。固化したアガロースは、再沸騰アガロースも煮沸した後、凝集体を有する始める、または固化したアガロースを乾燥が開始されるまで再利用することができます。乾燥したアガロースフィルムとカバーガラスを保存し、使用することができます無期限（ 例 ​​えば 、数ヶ月）は、D。クロロホルムに溶解したポリマーは、数ヶ月間-20℃で保存することができます。ポリマーフィルムは、アガロース膜上で乾燥された後、しかし、フィルムは二週間（長期貯蔵を直接決定されなかった内ハウス真空下で保存し、使用する必要はなく、ポリマーフィルムより古い二つから形成されたポリマーソームにおける顕著な違いがあります週間）。 ここで提示ゲルアシスト再水和のプロトコルを使用して、均一状のポリマーソームの数百を標準装備し、安価な実験用試薬を使用して、労働者のわずか数時間で急速に形成されています。さらに、ポリマーソームは、生理学的緩衝液の様々な、異なるポリマー組成物（ 図示せず）から形成することができる。この方法にマイナーな変更を負と科学者にゲルアシスト再水和に汎用性とアクセス可能な技術をレンダリング、ポリマーソームの形成を変化させませんテクニカル電子を変えますxpertise。 簡単に、細胞の大きさの規模で巨大なポリマーソームを作成する機能は、人工細胞様システムを構築するために不可欠です。これらのポリマーソームを作るためにゲルアシスト再水和の使用と汎用性の容易さは、強固な細胞膜模倣を作成するためのバイオミメティック分野での巨大な進歩を提供しています。例えば、この技術を用いて、異なる細胞内成分、細胞膜タンパク質および膜輸送タンパク質の組み込みを有するポリマーの官能化のカプセル化のための戦略は、ほんの数に名前を付けるために、ポリマーソームベースの人工的な細胞を構築するように設計することができます。

合成セルサイズ、巨大な単層小胞（GUVs）の作成 ​​は、人工細胞様システム1,2を生成するための枠組みを構築するために、異なる細胞過程のin vitroでの復興への関心が高まっています。脂質膜で構成GUVsは自然、生体膜の優れた模倣であるが、それらは環境変動に対して不安定であり、かなり短い貯蔵寿命を有します。これらの制限のために、両親媒性ブロックコポリマーは、ポリマー小胞、またはポリマーソームを形成する脂質模倣物として使用されています。 8 -この文脈の中で、ポリマーソームは、その増大した安定性3、化学的汎用性4,5及び修正物理的特性6にバイオミメティックセルシステムの開発に有利で ​​す。 巨大なサイズのポリマーソームは、電鋳9とテンプレート再水和10、ワットの両方を含んで形成する現在の方法HICH、時間がかかり、労働集約型である特殊な装置を必要とし、無傷の巨大なポリマーソームの低収量を生産します。シンプルなゲルアシスト再水和法は、最近、脂質GUVs 11の産生のために開発されました。ここでは、制御されたサイズ、変化するポリマー組成物を有する巨大なポリマーソームを作成するために、ゲル支援再水和法の適応を説明し、様々なバッファー組成物です。 簡潔には、重量/体積標準のDNAゲル電気泳動アガロースフィルム1％のガラスカバースリップ上で脱水されています。クロロホルム中で調製したポリマー溶液を脱水アガロース膜を横切って拡散し、蒸発させました。完全に溶媒を除去した後、ポリマーフィルムは、適度な加熱（40〜70゜C）で選択した緩衝液中で再水和され、巨大な（&gt; 4μm）の大きさのポリマーソームは、30分以内に形成されています。この方法は、急速に標準的な実験機器やreagenを使用して、十分に形成されたポリマーソームを完全に無傷の数百を生成します最小限のコストでTS。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig1.jpg" /> ゲルアシスト再水和方法を示す図1の回路図。ジブロック共重合体からなる巨大なポリマーソームは、再水和の約30分後に形成されています。親水性ブロックはマゼンタで示され、疎水性ブロックは緑で示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>125 mlの三角のフラスコ</td><td>VWR</td><td>89000-360</td><td></td></tr><tr><td>18ゲージの針</td><td>VWR</td><td>BD-305196</td><td></td></tr><tr><td>25 mmの正方形のカバースリップVWR</td><td></td><td>48366-089</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>シグマ</td><td>A9539</td><td>DNAのゲル電気泳動のための標準的なアガロー</td></tr>ス <tr><td>クロロホルム</td><td>シグマ288306-2L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>商業カバーウェル</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>70336</td><td>プレスツーシールシリコーンアイソレータ</td></tr><tr><td>フィジー画像解析ソフトウェア</td><td>ImageJ</td><td></td><td>無料ダウンロード:http://fiji.sc/Fiji&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>テフロン蓋付きガラスバイアル</td><td>VWR</td><td>66009-556</td><td>容量 1.9 ml 、144</td></tr><tr><td>Liss-rhodamine B PE Lipid</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810150C</td><td>のケース 1 mg の脂質、クロロホルム</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td>10.2 cm x 38.1 m</td></tr><tr><td>ポリ (エチレンオキシド)-b-ポリ (ブタジエン) または PEO-PBD (分子量 2,940)</td> <td>ポリマーソース</td><td>P2904-BdEO</td><td><a href="http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf">http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf</a</td></tr><tr><td>>パスティックシャーレ</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr>テ<tr><td>フロンテープ</td><td>VWR</td><td>300001-057</td><td>1/2"幅</td></tr></tbody></table>

ジェル支援補水を使用した巨大なサイズのポリマーソームを形成します

Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration

ポリマーベシクルは、その安定性、堅牢性、バリア特性、化学的多様性、調整可能な物理的特性に基づいて、脂質ベシクルの合成類似体として広く探求されています。しかし、巨大サイズ(> 4 μm)の小胞を調製するために使用される一般的な方法は、時間と労力を要するため、無傷のポリマーソームの数が少なくて済みます。ここでは、巨大(>4μm)ポリマー小胞(ポリポリソーム)の迅速かつ高収率の形成のためのゲル支援再水和の使用を初めて紹介します。この方法を使用すると、いくつかの異なる生理学的に適合したバッファーや全細胞培養培地を含むさまざまな再水和液からポリマーソームを形成できるため、バイオミミクリー研究に容易に有用です。この技術は、従来の方法よりもはるかに優れた収率とはるかに少ない難しさで、さまざまなポリマー組成物からポリマーソームを確実に製造することもできます。ポリマーソームのサイズは、再水和中に温度を変えるか、ポリマーメンブレンにメンブレン流動化剤を追加することで、巨大なサイズのポリマーソーム(>100μm)を生成することで容易に調整できます。

ポリマーソームは、（ 図1）と、図2に示す一般的な実験装置上に概説した手順を使用して形成された。ポリマーソームは、脱イオン水（ 図3）で再水和し、100Xオイル対物レンズを用いて落射蛍光における倒立顕微鏡で画像化しました。ポリマーソームが表示されていない場合、彼らは100Xの油浸対物レンズで取り込むには大きすぎるサイズで形成された可能性があることに注意してください。低電力の目的は、代わりに使用される必要があるかもしれません。ゲル支援再水和を使用する利点の1つは、再水和溶液の様々なポリマーソームの形成の多様性です。 図4に示すように、ポリマーソームは正常に、脱イオン水で完全な哺乳動物細胞培養培地、スクロース溶液二つ生理学的に関連の緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（PBS）またはTris緩衝化生理食塩水（TBS））を形成した。標準的な条件下で（再水和1時間40℃）での水で、〜より大きい70ポリマーソームは、典型的には、ビューの40×40μm2のフィールドごとに検出されました。ポリマーソームの表面の生産が均質ではありませんが、この代表的な収率で視野の数十があります。さらに、ポリマーソームは、少なくとも24時間、溶液中で安定でした。 ポリマーソームのサイズは容易に種々の温度でポリマーフィルムを再水和することによって調整しました。室温で脱イオン水に形成されたポリマーソームは2.9±0.7ミクロンの平均直径を有していました。再水和時の温度が上昇するにつれて、ポリマーソームの平均サイズは、（ 表1）を増加させます。高温（&gt; 60°C）、（ 図5）μmの100よりもさらに大きなサイズで形成されたポリマーソームで。 すべての画像処理は、オープンソースのイメージングソフトウェア（ 図6）を使用して完了しました。収集された画像は、ソフトウェアプログラムで開かれました。較正されたピクセルサイズを設定し、スケールボックスに入力されました。ラインツールを使用して、ラインが直径全体に描かれました。各個々の線が引かれた後、キャリブレーションの長さを測定し、結果ボックスに加えました。その後、データは選択肢（ 例えば 、エクセル、プリズム、原産地など ）の数学ソフトウェアにプロットすることができます<img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig2.jpg" /> ポリマーソームの形成に必要な一般的で安価なラボ材料の図2.画像に必要な項目は以下のとおりです。パラフィルム、18.5 G針、クロロホルムまたは他の適切な溶媒中のポリマー、千μlのピペットチップ、三角フラスコ、ピンセット、アガロース、25ミリメートルの正方形カバースリップ、PDMSイメージング井戸とガラスシャーレ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig2large.jpg" target="_blank">にはこちらをクリックしてください</a>この図の拡大版を表示します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig3.jpg" /> ゲルアシスト再水和法の図3.写真。アガロース溶存もフィルムコート全体をカバースリップするまで25ミリメートルの正方形のカバースリップ上に広がっています。カバーガラスは、その後、37℃のインキュベーターに入れて、フィルムが脱水されます。ポリマー溶液を脱水アガロースフィルム上に堆積され、円を描くように針を用いて拡散されます。カバーガラスは完全に任意の溶媒残留物を蒸発させるためにデシケーターのO / Nに置き、その後です。最後に、撮影室は、基板およびポリマーに接着されている選択肢の溶液で再水和し、ポリマーソームの形成を可能にするために40℃で少なくとも25分でペトリ皿に置かれている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig3large.jpg" target="_blank">このの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図。</a> </p<html> &gt; <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig4.jpg" /> 図4.ポリマーソームは、異なる緩衝液の様々な形成することができる。PEO-PBDポリマーフィルムは、1時間40℃で示されるバッファで再水和しました。スケールバー=10μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig5.jpg" /> 再水和の間に温度を上げる図5は、ポリマーソームのサイズが大きくなります。示された再水和温度で水に形成されたポリマーソームの代表的なエピ蛍光画像を。より大きなポリマーソーム内温度の上昇をもたらします。 =10μmのスケールバー。_blank &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>温度（℃） </td><td>平均サイズ（ミクロン） </td></tr><tr><td> 24 </td><td> 2.93±0.7 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 5.76±2.5 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 6.65±2.4 </td></tr><tr><td> 60 </td><td> 11.46±5.8 </td></tr><tr><td> 70 </td><td> 14.04±7.0 </td></tr></tbody></table> 表1は、計算された異なる温度条件ごとの水に100を超えるポリマーソームのために。平均直径を増加させたポリマーソームサイズの再水和の結果の間に温度を上げると、ここに描かれています。誤差は標準偏差です。

私たちは、巨大ポリマー小胞（pGV）を迅速に形成するためのプロトコルを提示します。簡単に言うと、ポリマー溶液は、カバースリップに接着された乾燥アガロースフィルム上で脱水されます。ポリマーフィルムの再水和により、pGVが急速に形成されます。この方法は、生体模倣研究に直接適用するための合成巨大小胞の調製を大幅に前進させます。

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier ...

このゲル支援再水和法の全体的な目的は、小胞のサイズ分布を容易に制御できる、完全な単層巨大ポリマー小胞を堅牢に形成することです。この手法はポリマー小胞形成における堅牢な代替案を提供し、膜の物理的特性の調査や、それらの小胞をバイオエンジニアリングへの応用に統合することを可能にします。この技術の主な利点は、従来の技術よりもはるかに迅速かつ労力を抑えた方法で、数百個の完全な巨大ポリマー小胞を容易に製造できる点にあります。この手法の着想は、巨大脂質小胞を形成するためのゲル支援再水和法について知ったことに端を発しています。しかし、現在の巨大ポリマーソーム形成法は困難で収率が低いことが多いため、代替アプローチとしてこの手法を採用することにしました。まずポリマー溶液の調製として、5 mgのPEO-PBDジブロック共重合体を1 mLのクロロホルムとともにガラスバイアルに入れ、完全に溶解するまで撹拌します。ポリマーとクロロホルムの5 mg/mL溶液と、蛍光ラベル化脂質とクロロホルムの1 mg/mL溶液を、最終濃度がポリマー99.5 mole %、脂質0.5 %になるまで新しいバイアルに加えます。蒸発を最小限に抑えるため、ポリマー溶液をクロロホルム耐性蓋付きの密閉バイアルに移し、20 °Cで保存して後で使用します。アガロースフィルムの調製を開始するには、250 mLの三角フラスコに50 mLの水と0.5 gの標準アガロースを加えます。電子レンジを用いて1分間加熱します。次に進む前に、凝集や付着不良を防ぐため、アガロース溶液を65から75度まで冷却します。その後、1000 µLピペットチップの先端を切り取り、それを用いて300 µLのアガロース溶液を25 mm四方のガラスカバースリップ上に分注します。手袋を着用した状態でカバーガラスの端を持ち、別の1000 µL ピペットチップの長辺を使用して、アガロースを表面全体に均一に広げます。カバーガラスのアガロース側を上にしてパラフィルムの上に置き、37 °Cで1時間以上インキュベートします。続いて、あらかじめ調製したポリマー溶液 30 µL を、アガロースフィルムをコーティングしたカバーガラスの上にピペッティングします。手袋を着用した指でカバーガラスの端を持ち、18ゲージ針の長い方を使い、円を描くようにポリマー溶液をアガロースフィルム上に広げます。最後に、カバーガラスのポリマー側を上にして、真空デシケーター内にあるプラスチック製ペトリ皿に置きます。残留溶媒を除去するため、デシケーター内を少なくとも1時間真空にします。ポリマーソームを形成するために、まず、密閉されるまで軽く押して、コーティングされたカバーガラスのポリマー側にカバーウェルを密着させます。次に、チャンバーに200〜500 µLの再水和溶液を加えます。続いて、ガラス製ペトリ皿の内側に濡らして丸めたラボワイプを配置し、加湿チャンバーを作成します。カバーウェルが貼付されたカバーガラスをディッシュに入れ、蓋をします。光退色を最小限に抑えるため、ペトリ皿をアルミホイルで覆い、40 °Cに設定したホットプレート上で少なくとも30分間静置し、ポリマーソーム形成を完了させます。FRAPイメージングを開始するために、カバーウェルが貼付されたカバーガラスを、調整可能なコンデンサーを備えた倒立蛍光顕微鏡のステージ上に設置します。次に、使用した蛍光脂質に基づいたフィルターセットを選択し、100倍油浸対物レンズを用いてカバーガラス上面上のポリマーソームを撮影します。FRAPを用いて膜流動性を評価するには、まずポリマーソームに焦点を合わせ、次に顕微鏡のコンデンサーを絞って開口部を小さくし、ポリマーソームの縁が画像視野内に収まっていることを確認します。続いて、カメラの露光時間を延ばし、すべての中性密度フィルターを取り除いて、関心領域（ROI）を30〜60秒間光退色させます。最後に、ランプを消灯し、コンデンサーを全開にします。露光量を初期設定まで下げ、3分間、30秒ごとに画像をキャプチャします。顕微鏡のコンピューターで画像解析ソフトウェアを起動し、取得したポリマーソームの画像を読み込みます。「Analyze」ドロップダウンメニューを開き、「Set Scale」オプションを選択して、測定のスケールを設定します。ピクセルあたりの距離、既知の距離、および長さの単位に適切な校正値を入力し、「okay」を選択します。次に、直線ツールを使用して、選択したポリマーソームの直径にわたる線を引きます。「Analyze」ドロップダウンメニューを開き、「Measure」を選択してポリマーソームの直径を測定します。解析を容易にするため、Ctrl + D キーを押して画像上に測定線を表示させてから、次のポリマーソームに移動してください。以上の手順でポリマーソームの測定を続け、すべての測定が完了するまで、各測定値をデータウィンドウに追加します。最後に、「File」から「Save As」をクリックしてデータを保存します。開いたウィンドウで「Save」をクリックし、その後、結果ファイルをスプレッドシートとして開いてデータを解析します。さまざまな緩衝液で再水和させたPEO-PBDポリマーフィルムから形成されたポリマーソームを、蛍光顕微鏡を用いて観察しました。画像から、異なる再水和条件下においてポリマーソームのサイズは不均一であり、直径は通常10 micrometers以下であることが示されました。異なる温度の水中で形成されたポリマーソームの蛍光顕微鏡画像から、再水和温度が上昇するにつれて、より大きなポリマーソームが形成されることが示されています。異なる再水和温度の水中で形成された100個以上のポリマーソームについて、平均直径を算出しました。24 °Cでの平均直径は2.93 µmであり、70 °Cでは最大14.04 µmまで増加しました。この手法を習得すれば、正しく行った場合に約1時間で完了させることができます。この手順を実施する際は、ポリマーソームを常に溶液中に保持することが重要です。再水和溶液の漏出やポリマーソームの乾燥を防ぐため、カバーウェルがカバーガラスにしっかりと固定されていることを確認してください。この手順に従い、電子顕微鏡などの手法を用いて、ポリマーソームのさらなる構造的特性を解析することができます。この手法は、合成生物学およびバイオエンジニアリングにおける研究の道を切り拓き、脂質膜に代わる、化学的に調整可能で堅牢な選択肢として、研究、非生物・生物界面、薬物送達研究、およびプロトセルシステムにおけるポリマーソームの探索を可能にします。このビデオを視聴することで、ゲル補助再水和法を用いて巨大ポリマーソームを堅牢に形成する方法、小胞の全体的なサイズを調整する方法、および膜の完全性を評価する方法について、深く理解することができるはずです。クロロホルム、アガロース、および針の取り扱いは危険を伴う可能性があることに留意してください。これらの操作を行う際は、細心の注意を払ってください。ドラフトチャンバー内での作業など、適切な予防策を講じるとともに、常にゴーグルと手袋を着用してください。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

当社は、分割インテイン媒介タンパク質ヒドロゲルの合成を提示する。このヒドロゲルのビルディングブロックは、それぞれが分割インテインの架橋剤及び半分となる三量体タンパク質のサブユニットを含む二つのタンパク質の共重合体である。二つのタンパク質の共重合体の混合は、ヒドロゲルに自己組織化ペプチドユニットを得インテイントランススプライシング反応をトリガします。このヒドロゲルは、有機溶媒に対応して、高度なpHおよび温度安定性であり、簡単に機能的な球状タンパク質が組み込まれています。...

インテイン媒介人工タンパク質ヒドロゲルの合成

電鋳し、ゲル支援腫れ - 巨人層小胞（GUVs）に貫通タンパク質、KvAPの再構成は、2脱水 - 再水和法について実証されている。両方の方法では、タンパク質を含む小さな単層小胞を蛍光顕微鏡法およびパッチクランプ電気生理学によって研究することができるGUVsを形成するために一緒に融合される。...

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ジャイアントベシクルは、マイクロメートルサイズの成分を高度に詰め込んだ有用な細胞モデルです。油中水型エマルジョン遠心分離法は、カプセル化された材料で巨大小胞を調製するためのシンプルで強力なツールです。...

油中水型エマルションの遠心分離により巨大ベシクルカプセル化微小球の調製

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ジェル支援補水を使用した巨大なサイズのポリマーソームを形成します

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