ジェル支援補水を使用した巨大なサイズのポリマーソームを形成します

このゲル支援再水和法の全体的な目標は、小胞のサイズ分布を簡単に制御できる無傷の単層巨大ポリマー小胞を堅牢に形成することです。この方法は、ポリマー小胞の形成に堅牢な代替手段を提供し、これを使用して膜の物理的特性を調査し、それらの小胞をバイオエンジニアリングアプリケーションに統合することができます。この技術の主な利点は、従来の技術よりもはるかに迅速かつ労働集約的でない方法で、何百もの無傷の巨大ポリマー小胞を簡単に製造できることです。

そのため、このアイデアは、巨大な脂質小胞を形成するためのゲル支援再水和技術を知ったときに生まれました。しかし、現在の巨大ポリマーソーム形成法は困難であり、しばしば低収率であるため、この方法を代替アプローチとして使用することにしました。ポリマー溶液の調製を開始するには、ガラスバイアル内で1ミリリットルのクロロホルムに5ミリグラムのPEO-PBDジブロック共重合体を渦巻き、完全に溶解するまで渦

ポリマーとクロロホルムの5ミリグラム/ミリリットル溶液と蛍光標識脂質とクロロホルムの1ミリグラム/ミリリットル溶液を新しいバイアルに加え、最終濃度が99.5モルパーセントのポリマーと0.5パーセントの脂質が得られるまで。蒸発を最小限に抑えるために、ポリマー溶液をクロロホルム耐性の蓋が付いた気密バイアルに移し、後で使用するために摂氏20度で保管します。アガロースフィルムの調製を開始するには、50ミリリットルの水と0.5グラムの標準アガロースを250ミリリットルの三角フラスコに加えます。

電子レンジで1分間煮沸します。続行する前に、アガロース溶液を摂氏65〜75度に冷却して、密着不良や凝集を防ぎます。次に、1000マイクロリットルのピペットチップの端を切り取り、それを使用して300マイクロリットルのアガロース溶液を25ミリリットルの正方形のガラスカバースリップにピペットします。

手袋を着用したまま、カバースリップの端を持ち、別の1000マイクロリットルピペットチップの長い方の端を使用して、アガロースを全面に均等に広げます。カバースリップのアガロース面を上にしてパラフィルムに置き、摂氏37度で少なくとも1時間インキュベートします。次に、事前に調製したポリマー溶液30マイクロリットルをアガロースフィルムコーティングされたカバースリップにピペッティングします。

手袋をはめた指でカバーのスリップエッジを保持し、18ゲージの針の長いエッジを使用して円を描くようにポリマー溶液をアガロースフィルム上に広げます。真空デシケーター内のプラスチック製のペトリ皿にカバースリップポリマー面を上にして置き、仕上げます。デシケーターを少なくとも1時間排気して、残留溶剤を取り除きます。

ポリマーソームを形成するには、まず、しっかりとシールが形成されるまで穏やかに押して、コーティングされたカバースリップのポリマー側にカバーをしっかりと接着します。次に、200〜500マイクロリットルの再水和液をチャンバーに加えます。次に、ガラスのペトリ皿の内側の端に沿って湿ったロール状のラボワイプを置き、湿度チャンバーを形成します。

カバーを貼ったカバースリップを皿にしっかりと入れ、蓋をします。写真の漂白を最小限に抑えるためにペトリ皿をホイルで覆い、摂氏40度のホットプレートに少なくとも30分間セットしてポリマーソームの形成を完了させます。FRAPイメージングプロセスを開始するには、カバーをしっかりと接着したカバースリップを、調整可能なコンデンサーを取り付けた倒立蛍光顕微鏡のステージに置きます。

次に、使用した蛍光脂質に基づいてフィルターセットを選択し、100Xオイル対物レンズを使用してカバースリップの上面のポリマーソームをイメージングします。FRAPを使用してメンブレンの流動性を特性評価するには、まずポリマーソームに焦点を合わせ、次に顕微鏡コンデンサーを小さな開口部に閉じて、ポリマーソームの端が画像フィールド内にあることを確認します。その後、カメラの露出を増やし、すべての減光フィルターを取り外し、関心領域を写真漂白剤に30〜60秒間放置します。

最後に、ランプをオフにして、コンデンサーを完全に開きます。開始設定への露出を減らし、30 秒ごとに 3 分間画像をキャプチャします。顕微鏡のコンピュータで画像解析ソフトウェアを開き、取得したポリマーソームの画像を読み込みます。

測定のスケールを設定するには、[分析] ドロップダウン メニューを開き、[スケールの設定] オプションを選択します。距離(ピクセル単位)、既知の距離、長さの単位に適切なキャリブレーション単位を入力し、[OK]を選択します。次に、線ツールボックスを使用して、選択したポリマーソームの直径にまたがる線を引きます。

ポリマーソームの直径を測定するには、Analyzeドロップダウンメニューを開き、Measureを選択します。分析を容易にするために、control と D を使用して、次のポリマーソームに移動する前に画像上に測定線を印刷します。上記の手順でポリマーソームの測定を続行し、完了するまで各測定値をデータウィンドウに追加します。

最後に、[ファイル] と [名前を付けて保存] をクリックしてデータを保存します。開いたウィンドウで [保存] をクリックし、結果ファイルをスプレッドシートとして開いてデータを分析します。PEO-PBDポリマーフィルムを種々のバッファーで再水和して形成したポリマーソームを蛍光顕微鏡を用いてイメージングしました。画像は、ポリマーソームが、通常10マイクロメートル未満の直径で、さまざまな再水和条件下でサイズが不均一であることを示しています。

異なる温度で水中で形成されたポリマーソームの落射蛍光画像は、再水和温度が上昇すると、より大きなポリマーソームが形成されることを示しています。異なる再水和温度で水中で形成された100個を超えるポリマーソームの平均直径を計算しました。摂氏24度では、平均直径は2.93マイクロメートルで、摂氏70度では14.04マイクロメートルまで増加します。

このテクニックを習得すると、正しく実行すれば約1時間で完了します。この手順を試みるときは、ポリポリソームを常に溶液中に保つことが重要です。再水和液の漏れやポリマーソームの乾燥を防ぐために、カバーウェルがカバースリップにしっかりと取り付けられていることを確認してください。

この手順に続いて、電子顕微鏡などの方法を使用して、ポリマーソームの追加の構造特性を理解することができます。この技術は、合成生物学および生物工学の研究への道を開き、研究、非生物的-生物的界面、薬物送達研究、およびプロトセルシステムのための脂質膜に代わる堅牢で化学的に調整可能な代替品としてポリマーソームを探求します。このビデオを見れば、ゲルアシストリハイドレーションを使用して巨大ポリマーソームを堅牢に形成する方法、小胞の全体的なサイズを調整する方法、およびそれらの膜の完全性を特徴付ける方法について十分に理解できるはずです。

クロロホルムやアガロースと針の使用は危険な場合があることを忘れないでください。これらの手順を実行するときは、細心の注意を払ってください。ドラフトでの作業など注意を払い、常にゴーグルや手袋を着用してください。