Threespineトゲウオにおける遺伝子導入およびゲノム編集のためのマイクロインジェクション

このマイクロインジェクション技術の全体的な目標は、遺伝子およびエンハンサー機能をテストするためのトランスジェニックおよびゲノム編集されたトゲウオを作成することです。この方法は、遺伝子やエンハンサーがどのように機能して体型パターンを生成するかなど、発生遺伝学と進化遺伝学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、機能的な遺伝子解析のためのトランスジェニック魚を効率的に作製できることです。

テキストプロトコルに従って2つのプラスミドとmRNAを調製した後、ホウケイ酸ガラスから少なくとも4本のマイクロピペット針を引き出します。鋭利な端が下を向いている毛細管貯蔵ジャーに垂直に保管します。最大100個のトゲウオの卵を受精させるには、50マイクロリットルの精子溶液を追加し、ピペットチップを使用して穏やかに攪拌し、すべての卵子が受精するようにします。

氷上で作業しながら、0.5マイクロリットルの注入液を針の鈍い端にピペッティングして、少なくとも3本の針を埋め戻し、それを排出させます。その間に、解剖顕微鏡のトランスイルミネーションライトをオンにし、顕微鏡のライトベースに13平方センチメートルのガラスプレートを置き、ガラスプレートの上に15センチメートルの石膏鋸刃を置きます。くぼみをニードルホルダーに向けて、のこぎりを注入装置に対して垂直に向け、コントロールボックスをオンにして、圧力が約175キロパスカルに設定されていることを確認します。

インジェクション時間を 180 ミリ秒に設定します。次に、ニードルホルダーを緩め、ゴムホルダーの抵抗が感じられるまで充填された針をホルダーに挿入し、指が締まるまでニードルホルダーを締めます。次に、針の角度を約45度に調整します。

マイクロマニピュレーターコントロールを使用して、端が視野の中央に来るように針を調整します。約40倍の倍率にズームインし、針の先端に焦点を合わせます(針が下のガラスに触れないようにする必要があります)。時計職人の鉗子で針の先端を端から2〜3鉗子の幅でつかみ、先端を60度の角度でゆっくりと折ります。

次に、インジェクションフットペダルを数回押して、針が折れているかどうかをテストします。数回タップすると、小さな赤い水滴が端から出始めます。使い捨てのトランスファーピペットを使用して、ガラスプレートにトゲウオの水を数滴垂らします。

針を水にそっと下げてから、針からピンク色の液体がかすかに浮かび上がるまで背圧を上げます。胚の準備中に針が損傷しないように、針をできるだけ引っ込めます。受精の約25分後、2つの10マイクロリットルピペットチップを使用して、クラッチから5〜10個の胚を取り出し、ガラスプレートに移します。

ピペットの先端を使用して、胚を穿刺するのではなく注意して、胚を鋸刃の個々のくぼみにそっと分離します。次に、トランスファーピペットを使用して、胚を覆うのに十分なトゲウオの水を追加します。次に、3〜5秒後に、各胚を覆う少量だけを残して、ほとんどの水を取り除きます。

最も遠い胚から始めて、ガラス板をスライドさせ、胚を拡大して、視野の約 25% を占めるようにします。針を視野に下げてから、10マイクロリットルのピペットチップを使用して胚をゆっくりと回転させ、卵黄の上部にある粒子の粗い、わずかに黄色の隆起した細胞質の隆起である割球を特定します。割球が針の端に直接垂直になるように胚を回転させます。

圧力をかけて針を下げ、ゆっくりと均等にコリオンを突き刺し、下にある卵黄に針を通さずに細胞質に挿入します。フットペダルを3〜4回押して注入し、わずかに拡散したエッジを持つ赤いボーラスが細胞質の直径の約1/8を満たすようにします。コリオンに垂直な鋭い針を持つことは、このステップを容易にするでしょう。

加える水の量を制限すると、コリオンを柔らかく保つのに役立ちます。そして最後に、細胞質を標的とすることで、トランスジェニック動物が得られる可能性が高まります。マイクロマニピュレーターのコントロールを使用して針を引っ込め、10マイクロリットルのピペットチップで、胚が針にくっついている場合は胚を押さえます。

針を引っ込めた後、ガラスプレートをスライドさせて次の胚を針に合わせ、注入を繰り返します。すべての胚が注入されたら、端を切り取ったトランスファーピペットを使用して、プレートに水を追加します。次に、トランスファーピペットを使用して胚を採取し、トゲウオの水で満たされた150ミリメートルのシャーレに入れます。

胚を摂氏18度でインキュベートします。注射の1日後、トゲウオの水をやさしく注ぎ、真水と交換します。死んだ胚や奇形の胚がないか確認し、汚染を防ぐために取り出します。

ここに示すように、エンハンサー活性を有する導入遺伝子の場合、注入が成功すると、導入遺伝子の特異的な細胞発現が得られます。たとえば、胸鰭と正中鰭、および脊索です。その後、注入された魚を交配して、受精後4日目に胚の心臓でGFP発現を促進するこの背部安定系統のような安定した系統を生成することができます。

活性エンハンサーの場合、胚の40〜50%が、例えば正中鰭および胸鰭において、組織特異的な導入遺伝子発現を示します。2つのプラスミド導入遺伝子を発現するGFP陽性のF0魚の最大100%がトランスジェニック仔を産生します。しかし、導入遺伝子を持つ子孫の割合は、1%未満から72%まで大きく異なります。

GFP陽性注入胚のみを保存すると、一般的に伝達効率が向上します。F0バックインジェクションされたトゲウオ胚の最大10%のみが、予想される組織で蛍光を示します。さらに、バックの透過率はプラスミドコンストラクトのそれよりも低いです。

スクリーニングされたトゲウオの最大14%だけが背中を伝達しています。バックトランスジェネシスの効率の低さとは対照的に、爪を注入された魚の70〜100%にモザイク病変があります。ここで、注入された各胚の未カットPCRアンプリコンは、各胚の一部の細胞が標的遺伝子座に病変を有することを示している。

一度習得すると、この技術は、適切に実行すれば、100個の胚のクラッチに対して1時間強で行うことができます。この手順を試みる際には、技術と胚の生存を向上させるために練習と忍耐が必要であることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、共焦点顕微鏡などの他の方法を使用して、エンハンサー発現の詳細なパターンに関するさらなる質問に答えることができます。

また、ゲノム編集された魚を交配して育てることで、誘発された突然変異に起因する表現型を研究することができます。開発後、この技術は、進化遺伝学および発生遺伝学の分野の研究者がトゲウオの遺伝子調節と機能を研究する道を開きました。このビデオを見れば、トランスジェネシスやゲノム編集のためのトゲウオ胚の注入方法についてよく理解できるはずです。