糖尿病性角膜症のためのアデノウイルス遺伝子治療：ヒト臓器培養角膜と​​輪部上皮細胞における創傷治癒に及ぼす影響と細胞マーカーの発現を幹

ヒトの糖尿病臓器培養角膜におけるアデノウイルス遺伝子治療の例が、これらの角膜における創傷治癒の遅延と上皮幹細胞マーカー発現の顕著な減少の正常化に向けて提示されています。また、幹細胞が豊富な辺縁系上皮培養におけるこのプロセスの最適化についても説明します。

この実験プロトコルの全体的な目標は、ヒト糖尿病性角膜の分子変化を説明し、臓器培養角膜におけるアデノウイルス遺伝子治療によってそれらがどのように軽減されるかを実証することです。この方法は、糖尿病性上皮創傷治癒の遅延を強調する分子変化や、上皮性SEM SEM分子の異常な発現など、糖尿病性角膜領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、角膜上皮創傷治癒と臓器培養角膜の幹細胞機能のさまざまなメディエーターを標的とした遺伝子治療アプローチの試験を可能にすることです。

この技術の意味は、超糖尿病性角膜幹細胞を正常化する方法の有効性を実証したため、幹細胞機能障害に関連する他の角膜疾患の治療にも及びます。角膜の上皮側を下にして滅菌60ミリメートルの皿に入れ、0.5ミリリットルの寒天コラーゲン混合物で凹みを満たします。混合物は2分以内に角膜上で固化します。

固まったら、角膜寒天を下にして、空気と液体の界面培養のためのリンバスのレベルに達するのに十分な完全補充培地を含む滅菌60ミリメートルの皿に置きます。次に、角膜を含む皿を、摂氏35度のウォーターパンで加湿した5%二酸化炭素インキュベーターに入れます。角膜中央部の上皮創面切除を行うには、まず5mmの濾紙ディスクをN-ヘプタノールに浸し、角膜中央部前面に75秒間置きます。

フィルターを取り外し、角膜をフルミディアムで洗います。創面切除後、上皮細胞は通常死滅して剥がれ落ち、左側に見られる顕微鏡的に無傷の基底膜が残ります。角膜を湿らせるために、上皮に毎日100マイクロリットルの培地を追加します。

角膜の治癒を顕微鏡で観察します。上皮の欠損が完全に治癒するまで、毎日4倍と10倍で写真を撮ります。治癒過程では、上部の焦点面に黒いクモのような細胞が観察されます。

これらの細胞は、上皮除去後に死滅したアポトーシス間質角化細胞です。これらの死んだ細胞が治癒上皮によって生い茂り、見えなくなったときに治癒が完了します。クエン酸シルデナフィル1ミリリットルあたり75マイクログラムをフル培地に添加することにより、形質導入培地を調製します。

c-met遺伝子を発現するアデノウイルス(ベクター)を、角膜あたり8番目のプラットホーム単位に10倍0.8〜1.25倍で添加します。角膜を24ウェルプレートに移します。適切な量のウイルス含有培地を追加し、角膜が培地表面の下にあることを確認します。

摂氏37度で48時間インキュベートします。辺縁細胞のみを形質導入するには、角膜をウイルスとウイルスの気液界面で、辺縁部のレベルで培地とインキュベートします。シルデナフィルは水溶液中での半減期が短いため、4時間後に、クエン酸シルデナフィルを培地に追加して補充します。

インキュベーション後、丸い端の滅菌ヘラを使用して、アデノウイルスを含まない培地を含む新しい皿に角膜を移し、培地をリンバスレベルに保ちながら培養します。GFP含有形質導入細胞は、蛍光灯の下で辺縁部に見られます。培養中は、角膜の上に100マイクロリットルの培地を追加して、角膜を定期的に湿らせます。

さらに4〜8日間のインキュベーション後、アデノウイルスで処理した角膜をさまざまな分析のために処理します。または、上皮創傷治癒をテストします。角膜全体または球体を使用する場合は、まず四肢領域を分離します。

これを行うには、角膜を上皮側を上にして滅菌プラスチック皿に置き、9ミリメートルのトレフィンを使用して中央領域を取り外して廃棄します。次に、13ミリメートルのトレフィンまたは外科用ハサミを使用して辺縁部を切除し、外側の結膜部分を廃棄します。角膜シュレラルリムあたり2ミリリットルのジスペース1リットルあたり2.4単位を含む1.5ミリリットルのケラチノサイトセラムフリー培地を準備します。

角膜シュレラルリムをこの溶液に浸し、摂氏37度で2時間インキュベートします。次に、解剖実体顕微鏡下で、鉗子を使用して、辺縁上皮細胞シートを縁からそっと緩めます。0.25%トリプシン、0.02%EDTA溶液の1ミリリットルで細胞を室温で30分間解離します。

解離後、細胞を10ミリリットルの培地で洗浄し、卓上遠心分離機で300gのペレットを室温で5分間ペレット化します。補充した培養液中の細胞を再懸濁し、KSFM培地中の細胞を1ミリリットルあたり10, 000細胞でコード化された60ミリメートル皿に座らせます。加湿した二酸化炭素インキュベーターで、細胞が完全にコンフルエントな単層を形成するまで、摂氏37度で細胞を培養します。

これには1〜2週間かかる場合があります。標準的な技術に従ってコンフルエントセルを継代し、細胞を24ウェルプレートに10倍から4ミリリットルあたり4番目の細胞でプレートします。EGF1ミリリットルあたり2ナノグラムを含む形質導入培地と、アデノウイルスが細胞表面に結合するのを促進するためのポリカチオンエンハンサーを調製します。

特定の遺伝子を発現するアデノウイルス、shRNA阻害剤、またはスクランブルshRNAをコントロールとして必要量を添加し、細胞あたり1〜300プラーク形成単位の多様な感染で細胞を形質導入します。ウイルス含有培地を細胞に加え、加湿インキュベーターで摂氏37度で24時間インキュベートします。24時間後、アデノウイルスを含む培地をアデノウイルスを含まない新しい培地と交換します。

4日間インキュベーターに戻ります。4日後、倒立蛍光顕微鏡を用いてGFPの発現レベルを評価します。次に、200マイクロリットルのピペットチップで直線的な直線運動で細胞を引っ掻くことにより、単層に引っかき傷を作ります。

傷つけた後、培地を交換して剥離した細胞を取り出します。倒立顕微鏡に取り付けられたデジタルカメラで毎日4倍の倍率で傷を撮影します。傷口の縁が傷全体に沿って接触し、治癒が完了した時間を記録します。

この一連の画像は、一対の糖尿病性角膜における8.5ミリメートルの上皮創傷の治癒を示しています。矢印は傷の縁を示し、アスタリスクは治癒していない部分を示しています。ベクター形質導入角膜の場合、治癒は8日で完了しますが、アデノウイルスc-met形質導入角膜の場合、治癒は5日で完了します。

ここで見られるように、c-met遺伝子導入は角膜上皮創傷治癒時間の有意な短縮につながります。また、c-met遺伝子を持つアデノウイルスとshRNAをMMP10およびカテプシン-F遺伝子に組み合わせて治療すると、上皮創傷治癒時間が完全に正常化されます。有意性は、対応するスチューデントのt検定とそれぞれのベクター治療と比較して確立されました。

バーは平均の標準誤差を表します。次の図は、辺縁系遺伝子治療後のさまざまなマーカーに対する糖尿病性角膜切片の免疫染色を示しています。C-METの発現と併用治療により、糖尿病マーカーのインテグリンα-3-β-1とニトゲン-1、および推定幹細胞マーカーのケラチン15とデルタ-Np-63-アルファの辺縁染色が著しく増加します。

形質導入された辺縁上皮細胞におけるGFP発現のレベルは、アデノウイルスGFPの感染の多様性に依存します。ここでは、細胞ごとに30のプラーク形成ユニットを細胞に3日間形質導入しました。これは、細胞あたり120 PFUの結果であり、最終的には形質導入の3日間で細胞あたり300 PFUの結果です。

辺縁細胞の遊走は、引っかき傷試験によって明らかになったように、アデノウイルスの濃度の増加によって悪影響を受けることは注目に値します。このため、ウイルスの毒性を避けるために、形質導入用量を最適化する必要があります。この画像は、形質導入されていない生きた細胞を示しています。

ここでは、細胞に20 PFU/細胞、80 PFU/細胞、最後に1細胞あたり120 PFUを形質導入します。この手順を試みる際には、角膜を無菌状態にしてウイルスのタイト性を最適化し、遺伝子形質導入後に少なくとも1日1回は角膜表面を湿らせ、治癒過程を毎日記録することを忘れないようにすることが重要です。このビデオを見れば、角膜臓器培養、角膜幹細胞培養、創傷の作り方、ウイルス遺伝子治療の適用方法など、疾患のある角膜組織の創傷治癒をinvitroで促進する方法を十分に理解できるはずです。