インフィールドアプリケーションの設計およびアプタマー金ナノ粒子基づく比色アッセイの開発

全体的な目標は、ターゲット分子の検出のためのアプタマー金ナノ粒子ベースの比色測定法の開発に向けた一般的なアプローチを提供し、長期的な保存の改善と偽陽性応答率の低減に向けたアプローチを提供することです。この手法は、長期保存のための現場での再現性や偽陽性反応率の低減など、金ナノ粒子アプタマー比色測定の分野で重要な疑問に答えます。これらのアッセイは保存期間の問題や偽陽性反応の問題を抱えやすいです。

この作業では、これら両方の問題について改善します。500ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコと大型攪拌棒を、5ミリリットルの濃硝酸と15ミリリットルの濃塩酸を化学安全フードで洗浄します。フラスコの表面全体を酸洗いで濡らします。

その後、ニュークレアーゼフリーの水でフラスコをすすいで、フラスコを乾かします。1ミリモラ金3塩化物を100ミリリットル加えます。酸で洗浄したエルレンマイヤーフラスコの上部をアルミホイルで覆い、熱い板で連続的にかき混ぜて沸騰するまで加熱します。

次に、38.8ミリラのシトウム酸ナトリウム10ミリリットルを加えます。色は透明や灰色から濃い青や黒へ、そして最終的に暗い色から赤へと数分かけて変化します。火を止めたまま10分間かき混ぜ続けます。

金ナノ粒子懸濁液を室温まで冷却し、連続攪拌しながら110マイクロリットルのDEPCを加えます。フラスコ全体をアルミホイルで覆い、DEPC処理液を一晩孵化させます。翌日、金ナノ粒子懸濁液をオートクレーブ処理します。

その後室温まで冷やし、0.22ミクロンの孔径セルロースアセテート膜を通してろ過します。ろ過・オートクレーブされた金ナノ粒子のストック溶液を、4度の暗闇で保存します。テキストプロトコルに記載された金ナノ粒子濃度を計算します。

ここでは、動的光散乱によって10ナノモル、15ナノメートルの大きさと計算されました。標準的なホスホラミダイト化学を用いてコカイン結合アプタマー配列を購入または合成します。標準的な脱塩でアプタマーを精製した後、ヌクレアーゼフリー水でオリゴヌクレオチドを100マイクロモルまたは1ミリモラーのストック溶液で再構成します。

精製されたアプタマーは20度の温度で数ヶ月間保存可能です。DNAを10ナモルストックの金ナノ粒子溶液と組み合わせ、金ナノ粒子の体積を必要に応じて変化させ、検査を行うのに十分なサンプルを提供します。混合物は室温で3〜4時間孵育し、光から守ります。

HEPES20ミリモラー、塩化マグネシウム2ミリモラ、pH7.4バッファーを同量に加え、サンプルを4度の温度で夜間に置きます。塩滴定によるアッセイ色応答を誘導するために必要な初期塩濃度は、アッセイブランクで決定されます。96ウェルプレートのアプタマー-金塩化物アッセイの180マイクロリットルアリコートに20マイクロリットルのメタノールを加えます。

これらのアッセイの性能において重要なステップは、ターゲットを加えた後に金ナノ粒子を不安定化させるために塩化ナトリウム濃度を決定することです。試料を増やす量を増やし、塩化ナトリウム溶液を定めて当量点を決定します。ここで、わずかな色の変化を引き起こすために必要な塩化ナトリウムの体積を目視観察で決定します。

アッセイ応答を最適化するために、メタノールで希釈した分析物分子20マイクロリットルを、室温96ウェルプレートのアプタマー金ナノ粒子アッセイ180マイクロリットルに加えます。直ちに前段階で決定した塩化ナトリウム濃度を加え、アッセイの色応答を開始します。塩化ナトリウム濃度を増減させ、ターゲット応答とブランク応答を比較することで、可能な限り最大の色変化を得ることができます。

最も反応差が大きい塩化ナトリウム濃度を使いましょう。塩化ナトリウム添加後150秒後にアッセイ反応を観察または測定してください。分光光度計を用いて、650ナノメートルおよび530ナノメートルの吸収を分析します。

結果を分析物濃度に対する650ナノメートルおよび530ナノメートルでの吸収比としてプロットします。アッセイ応答をブランク信号に対して正規化します。動画の前述のアプタマー金ナノ粒子アッセイ成分を準備します。

トレハロース1ミリリットルあたり1グラム、ショ糖1ミリリットルあたり1グラムをヌクレアーゼフリー水に別々の溶液で作り、クライオジェン溶液を作ります。したがって、これらのアッセイを凍結する上で重要なステップは、サンプルにどれだけのトレハロースとショ糖溶液を加えるべきかを決定し、完全かつ均一に凍結させることです。1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管で、1ミリリットルのマイクロ遠心分離管で、1ミリリットル1ミリットル1ミリットルのトレハロース1ミリリットルとショ糖4.8ミリグラムを含む溶液を、最終体積200マイクロリットルの金ナノ粒子アッセイで作ります。

最終的なクライオジェン溶液の濃度はDNAの被覆率によって異なります。サンプルは146度の冷凍庫または液体窒素で急凍します。サンプルは使用まで冷凍保存してください。

この作業では、サンプルを146度の冷凍庫に一晩置き、その後20度の冷凍庫に移して長期保存します。ここに示すのは、未処理およびDNAアプタマー処理済みの金ナノ粒子における塩化ナトリウム滴定曲線の代表的な結果です。アッセイで使用された初期の塩化ナトリウム濃度は滴定によって決定されました。

コカインおよび対照分子に対するアプタマー-金ナノ粒子比色測定法の代表的な結果をここに示します。グラフは、DNA被覆密度の増加がコカインアッセイの偽陽性反応率に与える影響を示しています。ここに示すのは、コカイン比色測定法の光画像解析から得られた校正曲線プロットです。

スマートフォンで撮影した写真。アプタマー金ナノ粒子の色度測定によるコカインおよび対照分子に対するアッセイ応答の代表的な結果をここに示します。データは、新たに準備されたサンプルと最大4週間冷凍保存されたサンプルを比較しています。

この手順を試みる際は、金ナノ粒子を不安定化させ、標的添加時の典型的な色変化を促進するために適切な塩化ナトリウム濃度を決定することが非常に重要です。この動画を見れば、ターゲットの検出のための金ナノ粒子アプタマー比色アッセイの開発方法をよく理解できるはずです。ここで述べたアプローチを用いて偽陽性反応率を減らし、アッセイを1か月以上有効に保つことができます。