PGR-ブループラスミドとゴールデンゲートアセンブリを使用してターミネータの迅速な検証

合成生物学プロトコルの全体的な目標は、ゴールデンゲートアセンブリを利用するin-vitroシステムにおいて、ターミネーターの機能を迅速に決定し、ターミネーター強度を定量化することです。このプロトコルは、バイオインフォマティクスを使用してシリコで見つけたターミネーターをテストし、生物学的環境でテストするために使用されます。これにより、バイオインフォマティクスで同定されたターミネーターをラボベンチで迅速かつ簡単に確認することができます。

このプロトコルの主な利点は、その速度です。バイオインフォマティクスの同定から生物学的確認まで、1週間未満で完了します。また、そうすることで、ターミネーターが実際にターミネーターであることを検証し、そのターミネータ強度を定量化することもできます。

一般的に、この手法には最初は苦労しますが、これは、同じチューブ内にリガーゼを含む制限酵素を加えるのは直感に反するように聞こえるからです。しかし、私たちは2S型制限エンドヌクレアーゼを使用しており、酵素の認識部位は実際の切断部位とは別物です。ターミネーターがpGRブループラスミドにライゲーションされると、これは永久的なライゲーションとなります。

しかし、リストリトン酵素とリガーゼを同じチューブに入れ、複数のサイクルを経ることで、高いクロージング効率を達成することができます。この手順を開始するには、個々のオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼフリー水に100マイクロモルの濃度で再懸濁し、10xアニーリングバッファーを調製します。次に、試験する各ターミネーターに1.5ミリターのマイクロ遠心チューブをラベル付けします。

各チューブに、16マイクロリットルの超純水、2マイクロリットルの10xアニーリングバッファー、および目的のターミネーターからの上部および下部の鎖オリゴヌクロチド各1マイクロリットルを追加します。ご注文いただいたオリゴヌクロチドの粘着末端が正しいことを確認することは非常に重要です。なぜなら、それらが一緒にアニールされたら、ターミネーターが正しい向きにあることを確認することが重要だからです。

ターミネータの向きが間違っていると、pGR blue はターミネータが機能しているかどうかを確認できません。次に、マイクロ遠心チューブをフロートに入れ、水浴で4分間煮沸します。4分後、ヒートプレートの電源を切りますが、チューブを水中に一晩置いてゆっくりと冷まします。

焼きなましされたターミネーターは摂氏20度で保管します。アニールされたターミネーターを40ナノモルで希釈するには、まず氷上で解凍し、次に新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで、アニールされたターミネーターの1マイクロリットルに124マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を追加します。サンプルを 10, 000x g で 30 秒間遠心分離します。

スピン後、サンプルを氷上に保存します。新しいサーモサイクラーに適したチューブに、6マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を追加します。次に、1マイクロリットルの市販のDNAリガーゼバッファーを追加します。

その後のすべての手順を氷上で実行します。次に、pGRブルーデスティネーションプラスミドのマイクロリットル当たり35〜50ナノグラムを含有する1マイクロリットル、40ナノモルアニールされたターミネーターの1マイクロリットル、0.5マイクロリットルの市販の高忠実度BSA1制限エンドヌクレアーゼ、および0.5マイクロリットルの市販のDNAリガーゼを添加する。反応混合物を 10, 000x g で 120 秒間遠心分離します。

次に、チューブを直接サーモサイクラーに入れ、次のプログラムを実行します。摂氏37度で1分間、摂氏16度で1分間、さらに摂氏37度で15分間を1サイクルします。実行後、サンプルを凍結して摂氏20度で保存するか、すぐに形質転換に進みます。

ライゲーション反応を、適切な形質転換プロトコルを用いて化学的にコンピテントな大腸菌細胞に形質転換します。ここでは、JM109細胞をジッピー変換を使用して形質転換します。

L字型のガラスホッケースティックを使用して、形質転換細胞の25マイクロリットルを、1ミリモルのアンピシリンと10ミリモルのアラビノースを含む予熱したLB寒天プレートに広げます。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。24時間以上インキュベートしないでください。

アンピシリンは急速に分解します。翌日、コロニーの色を調べます。ライゲーションが成功するには、可視光線では白色または黄色で、青色または紫外線の下では緑色に蛍光を発します。

ライゲーションに失敗すると、可視光の下で青色のコロニーが生成されます。ターミネーターとコントロールのそれぞれについて、1ミリモルのアンピシリンと10ミリモルのアラビノースを含む5ミリリットルの滅菌LBブロスを含む試験管を準備します。このプロトコルを実行する場合、pGRでは、適切な制御が実施されていることを確認することが非常に重要です。

最初のコントロールはLBブロスだけにする必要があります。次のコントロールは、アンピシリンに対して耐性があるが、青色光の下で蛍光を発しない細胞であるべきです。これらはブランクとして機能します。

次のコントロールは、切断されていないためターミネーターが存在しないpGRプラスミドで、これがターミネーター強度のベースラインとして機能し、最後のチューブがサンプル用になります。可視光の下で、滅菌ループを使用して2〜3個の白または黄色のコロニーを選び、それらをLBブロスに移します。サンプルを摂氏37度、160rpmのシェーカーで16〜18時間インキュベートします。

翌日、分光光度計を使用して、600ナノメートルでの各サンプルの光学セル密度を決定します。一般に、この時間が経過すると、0.8 から 1.0 の OD 600 が予想されます。滅菌済みの96ウェルプレートをフードに入れます。

各サンプルまたはコントロールについて、アンピシリンとアラビノースを含む199マイクロリットルの滅菌LBブロスを含む3ウェルを調製します。次に、一晩のブロスから1マイクロリットルの細胞溶液を96ウェルプレートの個々のウェルにピペットで移します。プレートに通気性のあるカバーを詰めてから、摂氏37度、160rpmで18〜20時間振ってください。

翌日、プレートリーダーを使用してOD 600(約0.5)を決定します。また、395ナノメートルの励起波長と509ナノメートルの発光でP蛍光のGを測定します。575ナノメートルの励起波長と605ナノメートルの発光でRFP蛍光を測定します。

Excelを使用して、蛍光をOD600で割ることにより、成長の変動を正規化します。正規化後、GFP制御蛍光に対するGFPターミネーター蛍光を取得し、それをRFP制御蛍光に対するRFPターミネーター蛍光で割ることにより、相対的なターミネーター強度を決定します。微生物ファージベルナル13で生体情報学的に同定された固定推定ターミネーターT1〜6を、このビデオに記載されているように分析した。

これらの結果は相対的な蛍光を示しています。すべての結果は、未カット、未改変のPGRを含む細胞をコントロールとして使用して正規化しました。T3は強力なターミネーターであることがわかりました。

すべての結果は、三重に成長した個々のコロニーを表し、視覚的表現のために平均化されています。エラーバーは、平均化されたデータポイント間の偏差を表します。ターミネーター強度を定量するための最適なリファレンスコントロールを決定するために、ターミネーターを含まない元のpGRプラスミドを使用した生データと、ターミネーターではないことがわかっている配列でクローニングされたpGR blueを使用した生データを比較しました。

ここでわかるように、両方のコントロールは同様のレベルのGFPとRFPの発現を示し、さらに重要なことに、同様のGFPとRFPの比率を示しました。これらの結果はすべて、三重に成長した個々のコロニーを表し、視覚的表現のために平均化しました。このテクニックを習得すると、配送と注文の時間を含めてわずか72時間で完了します。

pGRブルーは大腸菌でのみ機能することに注意することが重要です。さらに、ターミネーターの小さな部分しか見ていないため、転写を制御する可能性のある他の調節要素については実際にはわかりません。このプロトコルで達成した結果をpGR blueで確認するために、定量PCRなどの追加方法を使用できます。

さらに、pGRインサートを切り取り、お好みのプラスミドにライゲーションすることができます。