リアルタイムPCRによる沿岸堆積物および定量16SのrRNA遺伝子と転写物からの同時DNA-RNA抽出

この手順の全体的な目標は、沿岸の海洋堆積物から高収量で高品質のDNAとRNAを抽出し、その後16SリボソームRNA遺伝子と転写産物を定量することです。海洋堆積物からのDNAおよびRNA抽出とそれに続く定量的PCRを記述するこの方法は、環境中の微生物の存在量と多様性の分子分析における重要なステップです。この技術の主な利点は、同じサンプルからDNAとRNAを共抽出し、定量的PCRなどのダウンストリーム分析に使用できることです。

この手順を実演するのは、NUIゴールウェイのエンリコ・タッティ博士と、エセックス大学の博士課程の学生であるダンカン・スウィーニーです。RNAフリー材料を調製し、テキストプロトコルに従って沿岸堆積物サンプルを収集した後、沿岸堆積物からDNAとRNAを共抽出するには、0.5グラムの堆積物を2ミリリットルのビーズ溶解チューブに移します。500マイクロリットルのCTABリン酸緩衝液と500マイクロリットルのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールをチューブに加え、5〜10倍反転してサンプルを均質化します。

2.5分間全速力で渦を巻いた後、16,000倍のgと摂氏4度で10分間回転します。次に、ヒュームフードで上部の水性層を抽出し、新しい滅菌1.5ミリリットル微量遠心チューブに移します。次に、サンプルを氷の上に置き、500マイクロリットルの氷冷クロロホルム:イソアミルアルコールを加えます。

次に、エマルジョンが見えるまでチューブを数回反転させ、前と同じように遠心分離します。ヒュームフードで、上部の水性層を抽出し、新しい滅菌1.5ミリリットルチューブに入れます。次に、核酸を沈殿させるために、30%PEG塩化ナトリウム溶液を2容量加え、よく混合します。

氷上で2時間インキュベートするか、サンプルを摂氏4度で一晩放置します。インキュベーション後、サンプルを摂氏4度で16, 000倍gで20分間遠心分離します。マイクロピペットを使用して、ペレットを乱さないように注意しながら、上清を静かに取り除きます。

約10マイクロリットルのPEG溶液をチューブに残し、1ミリリットルの氷冷した70%エタノールを追加します。サンプルを回転させた後、ペレットに触れないように注意しながら、マイクロピペットを使用してエタノールをゆっくりと取り出します。その後、5秒間遠心分離し、残留エタノールを取り除きます。

ペレットを5分間風乾させてから、50マイクロリットルのDEPC処理水を使用して再懸濁します。DNA用に15マイクロリットルのサンプル、RNA用に30マイクロリットルのサンプルを分注します。最も重要なステップは、上清を除去する際にDNA/RNAペレットが外れないようにし、ペレットを水に再懸濁する前に残留エタノールが残らないようにすることです。これは、下流の分子反応を阻害するためです。

RNAサンプル中のDNAを消化するには、30マイクロリットルの核酸アリコートに3マイクロリットルのDNase Iバッファーと1.5マイクロリットルのDNase Iを加えます。37°Cで30分間インキュベートします。DNase不活性化試薬を30秒間ボルテックスして混合します。

次に、4.8マイクロリットルの溶液をサンプルに加え、室温で5分間インキュベートし、時々チューブの底を軽くたたいて溶液を混合します。試料を回転させた後、RNAを含む上清を新しいチューブに移し、沈殿物を移さないように注意してください。RNAの品質を確認するには、18マイクロリットルの滅菌RNaseフリー脱イオン水を追加して、2マイクロリットルのRNAを10分の1に希釈します。

別々のPCR反応では、1マイクロリットルのニートRNAまたは10分の1希釈のRNAを滅菌済みの0.5ミリリットルPCRチューブに加えます。テキストプロトコールの表に従って、PCR反応成分を添加して16SリボソームRNA遺伝子を増幅します。ポジティブコントロール、PCR阻害剤コントロール、およびネガティブコントロールが含まれます。

次に、以下の増幅パラメータを使用してPCR反応を実行します。RNAから第一鎖cDNAを生成するには、テキストプロトコルに従って反応試薬を0.2ミリリットルのPCRチューブに加えます。サンプルを摂氏65度で5分間インキュベートします。

次に、サンプルを氷上に少なくとも1分間置いてから、摂氏25度で10分間インキュベートします。インキュベーション後、ここに記載されている表の試薬をテキストプロトコールから添加し、摂氏55度で50分間インキュベートします。その後、摂氏72度で反応を10分間不活性化します。

テキストプロトコルに従ってqPCR用のDNAおよびRNA標準を生成した後、環境DNAおよびcDNAサンプル、標準、およびqPCR試薬を氷上で解凍します。核酸標準試料を希釈し、環境DNAおよびcDNAをニートから10、マイナス3まで10分の1希釈に調製します。反応の総数に10%を加えたマスターミックスを作り、よく混ぜます。

19マイクロリットルのマスターミックスと1マイクロリットルのテンプレートを96ウェル光学qPCRプレートの各ウェルに三重に添加します。qPCR光学カバーを使用してプレートを覆います。次に、プレートを短時間遠心分離し、qPCRマシンの加熱ブロックにロードします。

次に、qPCR Managerソフトウェアを開き、「Protocol」タブをクリックし、「Create New」をクリックして、以下の増幅条件を追加します。サンプル容量を 20 マイクロリットルに設定し、[OK] をクリックして、プロトコールを保存します。次に、[プレート]タブを選択します。

次に、[Edit Selected] で [Select Fluorophore] をクリックします。適切なプローブのレポーター色素を追加し、[OK]をクリックします。標準物質を含むウェルを強調表示し、Sample TypeメニューからStandardを選択します。[Replicate Series] を選択して [Replicate Size] を 3 に変更し、[Apply] をクリックします。

希釈シリーズを選択して、標準の濃度に計算された開始濃度を追加します。希釈係数を 10 に指定し、プレートに標準曲線を追加した順序に応じて「Deducing」または「Increaseing」を選択し、「Apply」をクリックします。不明なサンプルを含むウェルの位置を強調表示し、[Sample Type] ドロップダウンメニューから [Unknown] を選択します。

「Replicate Series」を選択し、「Replicate Size」を3に変更して、「Apply」をクリックします。[サンプル名] で、サンプル名を編集し、テンプレート制御ウェルがない場合の手順を繰り返します。次に、プレート エディター ボックスで [OK] をクリックし、ファイルを保存します。

次に、[実行の開始] をクリックします。実行が完了したら、[Quantification] タブを選択して、標準曲線、標準曲線記述子、および増幅プロットを表示します。最後に、Cp値と未知サンプルの遺伝子に対応する開始量について、定量データタブを選択します。

テキストプロトコルに従って、湿重量沈殿物のグラム当たりの遺伝子コピー数を決定します。このゲル画像に示すように、核酸抽出が成功すると、高分子量のゲノムDNAバンドの存在に加えて、シャープな23Sおよび16SリボソームRNAバンドが見える透明なDNAおよびRNAバンドが得られます。この図は、10倍の希釈範囲を正しく調製し、増幅してqPCR反応に使用する標準曲線を生成すると、各標準希釈間に3.3サイクルの差が見られることを示しています。

交差ポイント (Cp 値) をテンプレートなしコントロールまたは NTC (存在する場合) から報告することが重要です。これが発生すると、標準サンプルと未知サンプルのCpカットオフが3.3サイクルになるか、前述のようにNTCのCp値よりも高いログフォールドが課せられます。ここでは、環境試料をニートから、10からマイナス1、10からマイナス2、10からマイナス3の希釈を行った。

ニートサンプルは増幅されず、10からマイナス1から10からマイナス3の希釈のCp値は、それぞれ24.12、26.02、および28.40でした。このグラフに見られるように、R二乗値が0.99で、PCR効率が90〜110%の範囲にあることを含む、標準曲線記述子が望まれます。この実験では、NTC Cpは30.5であり、27.2の負のCpカットオフが課せられました。

遺伝子存在量を湿重量沈殿物1グラム当たりに換算すると、10がマイナス1の7倍が7分の1の2.5倍、10がマイナス1の7倍、10がマイナス2の希釈率となった。10からマイナス3の希釈Cpは、NTCカットオフよりも大きかった。この場合、10〜2の負の2つが最適なテンプレート希釈として選択されました。

この手順を試みる際には、RNAは急速に分解される可能性があるため、サンプルを氷の上に保管し、常にRNaseによる汚染を避けるために手袋を使用することが重要です。私たちはフェノール:クロロホルムとイサミルアルコールを使用しており、それは非常に危険である可能性があることを忘れないでください。また、この手順を実行するときは、白衣、手袋、保護メガネの着用、化学フードの下での作業などの予防措置を常に講じる必要があります。

このビデオを見れば、DNAとRNAを抽出し、海洋沿岸堆積物中の遺伝子と転写産物の存在量を定量する方法を十分に理解できるはずです。この手順は、DNAとRNAを抽出し、土壌を含むほとんどの環境サンプルからさまざまな遺伝子ターゲットを定量するために簡単に使用できることを忘れないでください。