2016年6月22日
このプロトコルは、蛍光レポーター、in vivo標識、および生体内イメージング技術を採用して、生きた動物における好中球プライミングの動的プロセスのモニタリングを可能にします。
この手順の全体的な目標は、生きている動物の好中球プライミングのプロセスを監視するための技術を提示することです。この方法は、最も希少な疾患や疾患の動物モデルにおける好中球のプライミングの挙動や機能の可視化など、免疫学分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、ウイルス標識における蛍光レポーターや生体内イメージングなど、3つの確立された方法論を組み合わせていることです。
ヘテロ接合型pIL1-DsRedマウスと野生型C57Black sixマウスを交配します。3〜4週間で、子犬の表現型を記入します。子犬ごとに、20マイクロリットルのヘパリンが入った1.5ミリリットルのチューブを準備します。
採血するには、子犬の首筋を持ち、5ミリメートルのランセットを使用して頬嚢の顎下静脈を突き刺します。小さな穴あけだけが必要です。チューブごとに3〜5滴の血液を集めます。
採集後は、必ず止血し、30分間観察してから動物施設に戻してください。各サンプルチューブに、500マイクロリットルの赤血球溶解バッファーを追加します。次に、チューブをボルテックスし、氷上で5〜10分間インキュベートします。
インキュベーション後、各チューブの細胞懸濁液の下に400〜500マイクロリットルのウシ胎児血清をゆっくりと加えます。レイヤー間には明確なインターフェースが形成される必要があります。次に、サンプルを1, 500Gで5分間遠心分離して、細胞ペレットを収集します。
上清を捨て、細胞を200マイクロリットルの完全RPMI-1640培地に再懸濁します。次に、各懸濁液をフローサイトメトリーチューブに移し、20マイクロリットルの新しく作成したLPSワーキングソリューションを各チューブに加えます。サンプルを4時間インキュベートしてから、フローサイトメトリーを実施します。
まず、麻酔カクテルの口蓋内注射でマウスに麻酔をかけ、つま先のピンチテストで適切な鎮静を確認します。次に、両耳の背側に脱毛クリームを塗り、1分以内に拭き取り、水洗いで肌を洗います。マイクロメーターを使用して、アプリケーションが作成された耳の厚さを測定します。
その後、麻酔から回復した後、マウスを自身のケージに戻し、マウスを少なくとも3日間休ませてから、さらにテストします。3日後、マウスを再麻酔し、再度耳の厚さを測定して、マウスが刺激を受けていないことを確認します。次に、12.5マイクロリットルの1.25%オキサゾロンを右耳の両側に塗布し、12.5マイクロリットルのアセトンオリーブオイルビヒクル溶液を左耳の両側に塗布します。
いつものように、マウスが麻酔から回復するのを観察します。24時間後、麻酔下で再び耳の厚さを測定し、オキサゾロンによる皮膚の炎症が発生したことを確認します。まず、100マイクロリットルの抗溶解XGモノコロン抗体を28ゲージ針付きのU100インスリン注射器に移します。
次に、前述のように治療したマウスに麻酔をかけます。マウスの腹部を下にして、眼球を部分的に突き出すために、皮膚の背側と腹側に穏やかな下向きの圧力をかけます。次に、針を内側眼瞼に対して約30度斜めに慎重に置き、針を後眼窩洞に慎重に挿入します。
針が副鼻腔に入ると、浸透圧力が緩和されます。次に、内容物を排出し、針をすばやく取り外します。少量の出血は、注射が成功したことを示唆しています。
次に、以前と同様に、1.25%オキサゾロンとビヒクル溶液をマウスの左右の耳に直ちに塗布します。8時間後、同じ抗体の2回目の投与を各マウスに投与します。また、血管を可視化するために、レトロ眼窩に100マイクロリットルのfitcデキストランを投与します。
この手順では、まず前と同じようにマウスに麻酔をかけます。次に、画像撮影中の乾燥を防ぐために、獣医用軟膏を目に塗ります。次に、イメージングステージの中央にガラス製のカバースリップを置き、カバースリップの端をテープで固定します。
また、カバーガラスにPVSを一滴加えます。次に、マウスの耳をカバースリップの上に置き、背側を下にして置きます。次に、マウスの耳の腹面をPVSを一滴垂らして湿らせます。
次に、グラススライドを上にして耳の先端を取り付け、スライドをテープで固定します。次に、マルチレーザー蛍光共焦点顕微鏡と関連機器の電源を入れます。周囲の光への露出を最小限に抑えるために、部屋の照明をオフにしてください。
次に、共焦点顕微鏡を使用して3次元画像を記録します。タイムラプスイメージング実験では、2〜4分ごとに最大8時間、3次元画像を記録します。その間、マウスが麻酔から回復し始めていることを示すひげのけいれんに注意してください。
このような状況では、蝶の針を介して麻酔薬カクテルの半分の用量の5〜10マイクロリットルを投与し、pIL-1-DsRedマウスは、フローサイトメトリーを介して末梢血白血球で産生される表現型DsRed蛍光についてスクリーニングされました。野生型マウスの循環骨髄細胞はDsRedを最小限に発現しますが、pIL1-DsRedマウスの同じ細胞は識別可能なDsRedシグナルを発現します。
IL-1βプロモーターの活性化は、好中球プライミングのマーカーであり、生きたpIL-1DsRedマウスで最もよく可視化できます。次に、皮膚感作性剤であるオキサゾロンを右耳に局所的に塗布しました。その後、好中球は、レトロオービタル注射によるオキサゾロン増感剤の2回目の適用の前後に標識されました。
同様に、fitc dextranは血管を見つけるために注射されました。血管外腔には、プライミングされた好中球を表す多くの二重標識細胞が見つかりました。少数の細胞は、lyse XG抗体によってのみ標識されましたが、これはおそらく休止中の好中球でした。
さらに、DsRed陽性細胞の小さな集団が観察され、これは炎症性単球および活性化マクロファージを含み得る。細胞の遊走経路を追跡して、2つの好中球集団を比較しました。両方の好中球集団は、細胞外空間に入るとランダムな移動を示しました。
興味深いことに、推定上プライミングされた好中球は、推定上静止している好中球と比較して有意に高い速度を示しました。その開発後、この技術は免疫学の分野の研究者に道を開きました。2つは、異なるt細胞が関与するさまざまな炎症状態における多くの免疫細胞の挙動と機能を調査します。
このビデオを見れば、生きた動物の好中球プライミングの動的プロセスをモニターする方法を十分に理解できるはずです。
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このプロトコルは、蛍光レポーター、生体内ラベリング、生体内イメージング技術を用いて、生体内の好中球プライミングをモニタリングするための技術を提示します。この方法は、希少疾患の動物モデルにおける好中球の挙動と機能を可視化することを目的としています。
Real-time intravital imaging of neutrophil priming using IL-1β promoter-driven DsRed reporter mice enables direct visualization of immune cell activation in living systems. This capability addresses a critical gap in understanding dynamic immune responses and supports mechanistic de-risking at the discovery stage. The approach enhances predictive confidence for target validation and informs early portfolio decisions in inflammation and immunology pipelines.
This imaging platform integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, pathway interrogation, and quantitative immune cell analysis in living animals.