関節リウマチ患者の関節から分離された線維芽細胞様滑膜細胞を用いて誘導多能性幹細胞の生成

この実験の全体的な目標は、関節リウマチの炎症を起こした関節の滑膜組織から単離された線維芽細胞様滑膜細胞から誘導多能性幹細胞(IPC)を生成することです。現在、iPS細胞は様々なヒト初代細胞から作製することができます。私たちは、リウマチ性関節の重要な病理細胞であるヒト線維芽細胞様滑膜細胞からiPS細胞を作製することに成功しました。

これは、関節リウマチの病理を調査するのに役立つ可能性があります。この定期刊行物は、RA-FLSを使用したIPSCの変性に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。滑膜組織を100ミリメートルの皿に入れ、抗生物質を添加した5ミリリットルのPBSで組織を洗浄することから始めます。

黄色がかった脂肪組織と骨の残留物を取り除きます。次に、トリミングした組織を、FBSを添加した5ミリリットルのDMEMを含む6ウェルプレートの1ウェルに移し、はさみを使用して、ピースが使い捨てピペットチップを貫通するほど小さくなるまで組織をミンチにします。培地を50ミリリットルのコニカルチューブに移し、次に5ミリリットルの新鮮なDMEMとFBSをウェルに加えて、残っている組織を回収し、ウェルの内容物全体をチューブに移します。

次に、氷融解したコラゲナーゼを最終濃度0.01%までチューブに加え、チューブをパラフィルムで密封し、摂氏37度の水浴で振とうしながらインキュベートします。4時間後、チューブに新鮮なDMEMとFBSを最終容量50ミリリットルまで充填し、遠心分離により組織片を回収します。ペレットを乱さずに上清を取り除き、別の遠心分離のために細胞を40ミリリットルの新鮮な培地に再懸濁します。

2番目のペレットを25ミリリットルの新鮮なDMEMとFBSに再懸濁し、組織の大きな塊が沈殿するのを待ちます。次に、上清を新しい100ミリメートル皿に移し、滑膜細胞を摂氏37度、CO25%で14日間インキュベートします。滑膜細胞培養を拡大するには、使用済みの培地を廃棄し、細胞を5ミリリットルのPBSで洗浄します。

PBSを取り外し、細胞培養インキュベーター内で細胞を1ミリリットルのEDTAで2分間解離します。インキュベーションの終了時に、ディッシュを軽くたたいて残りの付着細胞を剥離し、得られた細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移して遠心分離します。ペレットを30ミリリットルのDMEMおよびFBSに再懸濁し、細胞を新たに3つの100ミリメートル皿に分割します。

滑膜細胞に3日ごとに新鮮な培地を給餌し、先ほど示したように、細胞を80%のコンフルエント度で3つの新しい培養物に分割します。形質導入の0日目に、新鮮な成長培地の6ウェルプレートにウェルあたり3 x 10から4番目のFLSまでを1ウェルあたり3 x 10で観察し、5%CO2中で摂氏37度で一晩インキュベーションします。翌日、山中因子4種を含むレンチウイルス1バイアルを摂氏4度で解凍し、FLS培地を臭化ヘキサジメトリンとアスコルビン酸を添加したFLS増殖培地に置換します。

バイアルの内容物が解凍されたら、30マイクロリットルのレンチウイルスを細胞に加え、穏やかに混合してウイルスを均一に分配します。感染を改善するには、プレートを遠心分離し、細胞をインキュベーターに戻し、毎日培地を酪酸ナトリウムとアスコルビン酸を含む新鮮なFLS増殖培地に交換します3日間。4日目に、培地をFLS増殖剤と酪酸ナトリウムとアスコルビン酸を含むiPS細胞培地の混合物と交換します。

5日目に、カルシウムとマグネシウムを含まないPBSの6ミリリットルに60マイクロリットルのビトロネクチンを加え、6ウェルプレートの3ウェルにそれぞれ2ミリリットルの溶液を室温で少なくとも1時間コーティングします。ビトロネクチンが硬化している間に、形質導入細胞をPBSで洗浄し、示されているようにEDTAで剥離します。遠心分離によって解離した細胞を回収した後、ペレットを900マイクロリットルの新鮮な培地に再懸濁します。

ウェルから余分なビトロネクチンを取り除き、300、150、100マイクロリットルの細胞を個々のウェルに加えます。その後、細胞をインキュベーターに戻し、コロニーが現れるまで毎日培地を新鮮なiPS細胞培地と交換します。コロニーを選択するには、まず、ビトロネクチンでコーティングされた48ウェルプレートの各ウェルにROCK阻害剤を添加した500マイクロリットルのiPCS培地を追加します。

次に、FLS培養物を清潔なベンチの解剖顕微鏡下に置き、10マイクロリットルのピペットチップを使用して目的のコロニーを切断します。200マイクロリットルのピペットチップを使用して、選択したコロニーを48ウェルプレートの1ウェルに移します。すべてのコロニーをピッキングしたら、コロニーが移すのに十分な大きさになるまで、プレートを細胞培養インキュベーターに置きます。

コロニーが顕微鏡の可視視野から外れているときに、100倍の倍率で観察して細胞を分裂させます。この画像では、最初の14日間の培養後の単離されたFLSの形態を観察できます。この細胞は、一般的に線維芽細胞の特徴を示し、線維性マーカーのビメンチンとフィブロネクチンの発現が類似しているほか、マクロファージ様滑膜細胞マーカーCD-68.8の発現が低い 山中因子レンチウイルス形質導入の11日後、5〜10継代で選択して増幅できる小さなコロニーが現れ始めます。

これらの関節リウマチiPS細胞は、未分化のままであることを示すアルカリホスファターゼを発現しています。また、この細胞は、RT-PCRおよび免疫蛍光分析によって確認された多能性マーカーを発現します。関節リウマチ iPCS は、核型分析によって決定される 44+XY の正常な染色体パターンを示します。

さらに、SCIDマウスへの注射から12週間後、関節リウマチiPSCは奇形腫を形成し、多様な組織表現型を示します。それらの胚葉の分化は免疫蛍光染色によって確認されました。習得すると、滑膜を使用してFLSからiPS細胞を生成できます。

ビデオを見た後、滑膜組織から分離する方法と、それらを使用して再プログラミングを誘導する方法について理解を深めるはずです。これらのRAF-FLS由来のiPS細胞は、リウマチ学における再生や薬物スクリーニングの研究に役立ちます。これらのiPS細胞が確立されると、さまざまな種類の標的細胞や臓器を作製することができます。

これは、病気の研究や、遺伝子編集などの他の将来のアプリケーションに役立つ可能性があります。