Name: 関節リウマチ患者の関節から分離された線維芽細胞様滑膜細胞を用いて誘導多能性幹細胞の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学ぶ、関節リウマチ患者の線維芽細胞様滑膜細胞から誘導多能性幹細胞をレンチウイルス系で効率的に生成する方法。フィーダー細胞不要の培養系により、疾患モデリングや創薬研究への応用が可能です。

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この研究は、韓国疾病管理予防センター（HI13D2188)が資金提供する研究プログラムによって支援されました。

倫理に関する声明：本研究プロトコルは、カトリック大学校（KC12TISI0861）の施設内倫理委員会によって承認されました。 1.滑膜細胞の単離と拡大<ol><li>滑膜細胞の単離<ol><li>手術用はさみの2組と鉗子の1ペアを滅菌します。 </li><li> 100mmディッシュに滑膜組織を移し、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）5mlで洗浄します。 </li><li>黄色がかった脂肪組織および骨残基を切断。 6ウェルプレートのウェルにトリミングされた組織を移し、20％ウシ胎児血清（FBS）を有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）を5ml加えます。 </li><li>作品は使い捨てピペットを貫通するのに十分に小さくなるまでハサミで組織をみじん切りに。 </li><li> 50ミリリットルコニカルチューブに組織含有培地を転送します。 6ウェルプレートに20％FBSを含むDMEMの5ミリリットルを追加することで、残りの材料を収穫した後、チューブに移します。&lt;/李&gt; <li>氷上で解凍コラゲナーゼ。 0.01％の最終濃度にコラゲナーゼを追加し、パラフィルムでチューブを密封します。 4時間振とうしながら37℃の水浴中でインキュベートします。 </li><li>全量を10分間300×gで、室温で50 mlの遠心分離になるまでインキュベートした後、20％FBSを含むDMEMでチューブを満たします。 </li><li>ペレットを乱すことなく上清を除去し、ペレットを再懸濁するためにメディアの40ミリリットルを追加します。 </li><li>繰り返しは1.1.10-1.1.11を繰り返します。 </li><li> 20％のFBSを含むDMEM 25mlにペレットを再懸濁し、底に沈むする組織の大きな塊を待ちます。 </li><li> 100ミリメートル皿に上清を移し、14日に5％CO 2中で37℃でインキュベートします。 </li></ol></li><li>滑膜細胞維持・拡大<ol><li>プレートから使用されているメディアを捨て、PBS 5mlで細胞を洗浄。 </li><li> 1mlのPBS / 1mMのEDTAを添加し、2分間、5％CO 2中、37℃でインキュベートします。 </li><li>静かに皿とtransfeをタップしますR 15 mLコニカルチューブに細胞。 2分間、250×gでRTを、細胞を遠心します。 </li><li>ペレットを乱すことなく上清を除去し、20％FBSを含むDMEM 30mlにペレットを再懸濁。 </li><li>目に見える残りの材料を残すことなく、3×100mm皿に細胞を移します。 </li><li>新鮮な培地3日毎に培地を交換してください。 1mlのPBS / 1mMのEDTAを用いて80％の密集度で細胞を分割します。使用前に継代3まで維持します。すべての分割で3皿に細胞の各皿を割ります。 注：通路3に達した後、すぐに使用するつもりはありません細胞を凍結することができます。 </li></ol></li></ol>レンチウイルスをコードする山中因子を使用して2再プログラミングFLSS <ol><li>トランスダクション（D0） <ol><li>増殖培地中の種子6ウェルプレートのウェルあたり3×10 4細胞（DMEM 500mlを、10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充しました）。 5％CO中37℃で細胞O / Nインキュベート2。 </li><li> 4℃で冷凍庫と解凍からのOct4、Klf4の、Sox2の、およびc-Mycの次の日、4山中因子を含むレンチウイルスの1つのバイアルを取り外します。注：レンチウイルスは、我々の以前の研究11に記載した手順で製造しました。 </li><li>ウイルスを解凍しながら、10 / mlのヘキサジメトリン臭化および50μg/ mlのアスコルビン酸を含有するFLSの増殖培地（DMEM、20％FBSを加えた抗生物質）にメディアを変更します。 </li><li>メディアを変更した後、細胞にレンチウイルスの30μlを添加し、穏やかに混合します。感染症を改善するために、30分間680×gで、35℃でプレートを遠心します。 </li><li>遠心分離後、5％CO 2中37℃で細胞をインキュベートします。 </li></ol></li><li>メンテナンス再プログラミングが表示されるまで<ol><li> 3日のために、0.1 mMの酪酸ナトリウムおよび50μg/ mlのアスコルビン酸を含有するFLSの増殖培地で毎日メディアを交換。 </li><li>翌日、FLSの増殖培地の混合物を用いてメディアを交換し、IPSC培地：0.1mMの酪酸ナトリウムおよび50μg/ mlのアスコルビン酸を含有する（1：1の比）。 注：IPSC媒体の成分は、材料/機器リストに記載されています。 </li></ol></li><li>コロニー形成のために細胞を分割<ol><li>ビトロネクチンでコーティングした6ウェルプレートを準備します。 <ol><li> Ca 2+およびMg 2+なし6ミリリットルのPBSに60μlのビトロネクチンを追加します。各ウェルに混合物の2ミリリットルを入れ、少なくとも1時間RTでインキュベートします。注：ビトロネクチンの作業濃度は5μg/ mlのです。 </li></ol></li><li> D5で、PBSで細胞を洗浄。 </li><li>細胞を剥離し、2分間、37℃、5％CO 2でインキュベートし1mlのPBS / 1mMのEDTAを追加します。 </li><li> 2分間、250×gでRTを細胞や遠心分離機を収穫。 </li><li>別の集密度を達成するために、3つの異なる比（9：3、1：6、および1 1）で細胞を分割します。細胞ペレットを再懸濁へのメディアの900μlのを追加します。 、300を追加し150、及び6-ウェル当たりの細胞混合液100μlそれぞれ、9：3,1：6、および1ウェルプレート1の比を達成します。 </li><li>コロニーが出現するまでIPSCメディアで毎日メディアを交換してください。コロニーは約D18の後に表示されます。注：この段階では、IPSCのコロニーは、非再プログラムFLSSと共存。 </li></ol></li><li>コロニーピッキング<ol><li>ウェルに500μlのビトロネクチンを追加することにより、48ウェルのビトロネクチンでコーティングされたプレートを用意し、少なくとも1時間室温でインキュベートします。 </li><li>クリーンベンチに顕微鏡を置き、インキュベーターから6ウェルプレートを取り外します。 </li><li> 48ウェルプレートからビトロネクチン溶液を除去し、10mMのRho関連、コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ（ROCK）阻害剤を補った500μlのIPSCのメディアを追加します。 </li><li> 10Pピペットチップを使用して、コロニーの周囲に切断します。 48ウェルプレートの1ウェルに選んだコロニーを転送します。 </li><li>いくつかのコロニーを採取した後、37°C​​、5％CO 2で細胞をインキュベートします。 </li><li>コロニーが大きいENOになるまで細胞を維持ぐふ転送のため。注：100X倍率で見た場合、コロニーは、顕微鏡の可視フィールドの外に取得するときに我々は通常、細胞をこぼしました。 </li></ol></li></ol> 3.免疫蛍光染色<ol><li>細胞調製<ol><li> 12ウェルプレートに、滅菌18ミリメートルのカバーガラスを置きます。 </li><li>カバーガラスを冷却し、すすぐために1mlのPBSを追加します。 </li><li> 10μg/ mlのビトロネクチン溶液1mlと交換してください。 </li><li>少なくとも室温で1時間プレートをインキュベートします。 </li><li>毎日メディアを変え、37℃、5％CO 2で7日間ビトロネクチンでコーティングした12ウェルプレートと文化の中でビトロネクチン液とプレートiPS細胞を捨てます。 </li></ol></li><li>細胞染色<ol><li>培養培地を捨て、PBSで一回細胞を洗浄します。 </li><li> RTで30分間、0.4％パラホルムアルデヒド（PFA）で細胞を固定してください。 </li><li> RTで5分間、0.1％トリトンX-100で細胞を透過性。 </li><li>透過性を削除しますPBSを室温で30分間、2％ウシ血清アルブミン（BSA）を含有する溶液とブロック。 </li><li> 表1に記載の2％BSAを含むPBS中の抗体を希釈する。室温で2時間一次抗体で細胞をインキュベートします。 </li><li>二次抗体（希釈1：200）を追加し、光を避け、室温で1時間、細胞をインキュベートします。 </li><li> 10分間の1μL/ mLのDAPIで細胞を処理します。 </li><li>退色防止試薬とスライドガラスの上にカバーガラスを配置し、光を避け、室温で24時間インキュベートします。 </li><li>蛍光顕微鏡で式を確認してください。 </li></ol></li></ol>前記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR） <ol><li>チオシアン酸グアニジニウム-フェノール-クロロホルム抽出法11を用いて、細胞ペレットからmRNAを抽出します。 </li><li>逆転写11を用いて、全mRNAの2μgのからcDNAを増幅します。 </li><li> cDNAテムの2μLを用いたPCRに必要な成分を混合プレート11。 </li><li> RT-PCRを行い、ゲル電気泳動11で結果を確認します。 </li></ol> 5.アルカリホスファターゼ（AP）染色<ol><li> 37℃で5-7日間培養性IPSC、染色前に、5％のCO 2。 </li><li>メディアを吸引し、1分間、4％PFAで細胞を固定します。 </li><li>固定液を捨て、1Xリンスバッファーで細胞を洗浄。 </li><li> AP染色のための試薬を準備します。ファストレッドバイオレット：ナフトールAS-BIリン酸塩溶液：水= 2：1：以下の比率での試薬を混ぜる1。 </li><li>光を避けて、15分間、室温で染色液で細胞をインキュベートします。 </li><li>染色液を捨て、リンスバッファーで細胞を洗浄。 </li><li>乾燥を防止し、明視野顕微鏡を使用して発現を確認するためにPBSで細胞を覆います。 </li></ol>

<ol><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).</li>
<li>Haase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human blood.</a> Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).</li>
<li>Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid arthritis.</a> Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).</li>
<li>Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-like+synoviocytes+in+inflammatory+arthritis+pathology%3A+the+emerging+role+of+cadherin-11%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11.</a> Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).</li>
<li>Bartok, B., Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-like+synoviocytes%3A+key+effector+cells+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis.</a> Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells+from+patients+with+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis.</a> Arthritis Res Ther. 16 (1), R41(2014).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

iPS細胞の発見前に、科学者たちは、主に分化を通じて幹細胞生物学および他の細胞系譜を研究するためのESCを使用していました。しかし、ESCは、初期段階の胚である胚盤胞の内部塊に由来します。 ESCを単離するために、胚盤胞の破壊を克服することは不可能である倫理的な問題を上げ、避けられません。 ESCは、幹細胞性特性および多分化能を有するがまた、それらは個体から得ることができず、時にはパーソナライズ分析および疾患のスクリーニングのための理想的なツールではありません。 2007年には、高橋ら 。ヒト線維芽細胞2からiPS細胞を生成しました。理論的には、ESCは異なり、性IPSCは、任意の成体の体細胞から生成することができます。この利点により、iPS細胞を自動細胞移植のための理想的なツールであると考えられています。また、エピジェネティックなメモリのコンセプトで、性IPSCは、病原性の条件、 すなわちのシミュレーションのための理想的な電池材料であると考えられています。病気のモデリング。このような血液細胞、尿細胞など多くの細胞の様々...

多能性幹細胞は、様々な臨床的および生物学分野における次世代プラットフォームです。それらは、疾患モデル、薬物スクリーニング、および再生医療の治療に用いることができる有望なツールです。ヒト胚性幹細胞（hESC）は、主に研究し、多能性細胞を理解するために使用しました。しかしながら、ヒト胚盤胞の破壊により単離し、ヒトES細胞は、いくつかの倫理的な問題と関連しています。 2007年には、博士山中伸弥と彼のチームは、セルプログラミングプロセスを逆転し、ヒト成体の体細胞1,2から幹細胞を開発しました。したがって、ヒトES細胞とは異なり、誘導された多能性幹細胞（iPS細胞）は、倫理的なハードルを回避し、成熟した体細胞から生成することができます。 Oct4、Sox2の、Klf4及びc-Myc：通常、性IPSCは、4つの外因性遺伝子の送達によって生成されます。これらの山中因子は、もともとレンチウイルスおよびレトロウイルス系を使用して配信されます。最初のiPS細胞は、マウスの体細胞cから誘導されましたells 3。その後、技術は、ヒト皮膚線維芽細胞1,2に適用しました。その後の研究に成功し、尿4、血液5,6、ケラチノサイト7、およびいくつかの他の細胞型など、さまざまなソースからのiPS細胞を、生成されました。しかし、いくつかの体細胞再プログラミングに使用されていない細胞、および疾患状態の特定の組織からの種々の細胞型の再プログラミング能力のスクリーニングがあり、依然として必要とされています。 関節リウマチ（RA）は、すべての関節を打つと他の臓器における自己免疫疾患につながる可能性疾患です。 RAは、先進国で成人の約1％に影響を与えます。それはむしろ一般的な疾患であり、その発生率は毎年8増加します。しかし、RAは、初期の段階で特定するのは困難であると破壊onceboneダメージを回復することができない治療法がありませんが発生します。また、薬物の有効性は、患者に、患者は異なり、衛生兵を予測することは困難です必要とされるINE。したがって、薬物スクリーニング方法の開発が必要とされ、RAの状況を反映することができる細胞材料が必要とされます。 線維芽細胞様滑膜細胞（FLSS）は、RA 9,10の病因における積極的なセルラー参加しています。 FLSSはまた、滑膜と呼ばれる関節包とキャビティとの間滑膜内膜ライニング、中に存在します。関節の構造を支持し、周囲の軟骨に栄養を提供することにより、FLSSは通常、関節機能と維持に重要な役割を果たしています。しかし、RAのFLSSは、浸潤性の表現型を持っています。 RA FLSSは、最終的に無限増殖10によって周囲の骨を破壊し、癌様の表現型を持っています。このユニークな特性を有する、FLSSはRAの病理生物学を反映することができる有望な材料として用いることができます。しかし、これらの細胞はほとんど生産されず、細胞がin vitroでのいくつかの通路を通って行くように細胞表現型を変更します</eメートル&gt;条件。したがって、患者の状態を表すことができるツールとしてRA FLSSを使用するために複雑になることができます。 理論的には、RA患者由来のiPS細胞（RA-性IPSC）は、薬物スクリーニング、さらなる研究のための理想的なツールになることができます。生成されたiPS細胞は、自己再生能を有し、 インビトロで維持し、拡張することができます。多能性と、これらの細胞は、RAおよび他の骨関連疾患11の特定の研究のための細胞物質の寄与することができる成熟した軟骨細胞及び骨細胞系統へ分化させることができます。 本研究では、外科的に除去滑膜からFLSSを分離し、展開する方法を示し、そしてどのように山中因子を含むレンチウイルスを用いて、FLSSからRA-iPS細胞を生成します。

<table><tbody><tr><td>100 mm ディッシュ</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 ml コーニカルチューブ</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mlL コーニカルチューブ</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 ml ディスポーザブルピペット</td><td>ファルコン</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml ディスポーザブルピペット</td><td>ファルコン</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>12 ウェルプレート</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>FLS 隔離材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>外科用鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 16000-044</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>C6885-100MG</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>54956</td><td></td></tr><tr><td>PBS/1 mM EDTA</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 12604-039</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>iPSC ジェネレーション マテリアル</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Chemicon</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>レンチウイルス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>iPSC 培地成分 (500 ml)</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Life Technologies</td><td>25080-094</td><td>iPSC 培地成分 (Conc.: 543 &mu;g/ml)</td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム</td><td>Σ アルドリッチ</td><td>S5261</td><td>iPSC 培地成分&nbsp;(濃度:14 ng/mL)</td></tr><tr><td>ヒトトランスフェリン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3705</td><td>iPSC 培地成分 (濃度: 10.7 &mu;g/ml)</td></tr><tr><td>基本FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>iPSC培地成分&nbsp;(濃度:100 ng/ml)</td></tr><tr><td>Human Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>iPSC 培地成分 (Conc.: 20 &mu;g/ml)</td></tr><tr><td>ヒトTGF&β;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>iPSC培地成分(濃度:2 ng / ml)</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A8960</td><td>iPSC培地成分&nbsp;(濃度:64 &mu;g/ml)</td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>ケミコン</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>酪酸ナトリウム</td><td>Σ Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>ビトロネクチン</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor</td><td>Σ Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td><強>Guality Control 材料</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18mm カバーガラス</td><td>スーペリア</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4%パラホルムアルジヒド(PFA)</td><td>Tech &イノベーション</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>抗 SSEA4 抗体</td><td>ミリポア</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>抗 Oct4 抗体</td><td>サンタクルス</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>抗 TRA-1-60 抗体</td><td>ミリポア</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>抗 Sox2 抗体</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>抗 TRA-1-81 抗体</td><td>ミリポア</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>抗 Klf4 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG (H+L) 抗体</td><td>モレキュラープローブ</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 抗体</td><td>モレキュラープローブ</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>分子プローブ</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>プロロングゴールド退色防止試薬</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス、コーティングされた</td><td>ヒョンイルラボメイト</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr>トリ<tr><td>ゾール</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr>クロ<tr><td>ロホルム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>イソプリピルアルコール</td><td>ミリポア</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq DNA Polymerase</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10x TBE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>loading star</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1 kb (+) DNA ラダーマーカー</td><td>Enzynomics</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ</td><td>ミリポア</td><td>SCR004</td><td></td></tr></tbody></table>

関節リウマチ患者の関節から分離された線維芽細胞様滑膜細胞を用いて誘導多能性幹細胞の生成

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

成熟した体細胞を再プログラミング因子の定義されたセットを使用して、多能性幹細胞のような状態に反転させることができます。 Oct4、Sox2、Klf4及びc-Myc：多くの研究は、4つの山中転写因子を形質導入することにより、様々な体細胞型から誘導され、多能性幹細胞（性IPSC）を生成しています。性IPSCの研究は、生物学的および臨床研究の最先端に残ります。 iPS細胞は、任意の個々の組織から誘導することができるので、特に、患者特異的iPS細胞は、疾患の病理生物学の研究のための先駆的なツールとして使用することができます。関節リウマチ（RA）は、関節内の軟骨および骨の構造の破壊によって分類慢性炎症性疾患です。滑膜過形成は、RAにおけるこれらの結果につながる主な理由や症状の一つです。線維芽細胞様滑膜細胞（FLSS）は過形成滑膜における主成分細胞です。関節内のFLSSは限りなく、最終的に隣接cartilに侵入、増殖します年齢や骨。現在、過形成性滑膜は、外科的処置によって除去することができます。削除された滑膜は、関節の炎症状態を反映する材料として、RAの研究のために使用されます。 RAの病因における主要なプレーヤーとして、FLSSは、RA患者の性IPSCを生成し、調査するための材料として使用することができます。本研究では、iPS細胞を生成するために、RA患者のFLSSを使用しました。レンチウイルス系を用いて、我々は、FLSSがRA患者固有のIPSCを生成することができることを発見しました。 FLSSから生成されたiPS細胞は、さらに、将来のRAの病態生理学を研究するためのツールとして使用することができます。

本研究では、レンチウイルスシステムを使用してFLSSからiPS細胞を生成するためのプロトコルを記述している。 図1Aは、FLS単離プロトコールの簡単なスキームを示します。滑膜の外科的除去に続いて、組織は、外科用はさみを使用して小片に切断しました。コラゲナーゼは、組織の塊から細胞を単離するために添加しました。細胞は、さらなる処理の前に14日間インキュベートした。 図 1Bは、単離され FLSSの形態を示します。細胞は、使用前に3継代維持しました。 FLSSは、一般的な線維芽細胞と同様の特性を共有しています。私たちの孤立FLSSは線維化マーカー、ビメンチンおよびフィブロネクチンを表明しました。孤立したRA FLSSはまた、マクロファージ様滑膜細胞マーカー、CD68（ 図1C）の低発現を示しました。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page...

ここでは、フィーダー細胞なしでレンチウイルス系を用いて、患者由来の線維芽細胞様滑膜細胞から誘導された多能性ヒト幹細胞を生成するためのプロトコルを説明します。

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

この実験の全体的な目的は、関節リウマチで炎症を起こした関節の滑膜組織から単離した線維芽細胞様滑膜細胞から、人工多能性幹細胞（iPSC）を樹立することです。現在、iPSCはさまざまなヒト一次細胞から樹立することが可能です。本研究では、関節リウマチ関節の主要な病理学的細胞であるヒト線維芽細胞様滑膜細胞からiPSCの樹立に成功しました。これは関節リウマチの病理研究に役立つ可能性があります。この定期的な手法は、RA-FLSを用いることで、iPSCの退行に関する重要な疑問への回答に寄与します。まず、滑膜組織を100 mmディッシュに入れ、抗生物質を添加した5 mLのPBSで組織を洗浄します。黄色い脂肪組織と骨の残渣を取り除きます。次に、トリミングした組織を、FBSを添加した5 millilitersのDMEMを含む6ウェルプレートの1ウェルに移し、使い捨てピペットチップを通り抜けることができる大きさになるまで、ハサミで組織を細かく刻みます。培地を50 milliliterのコニカルチューブに移し、さらに5 millilitersの新鮮なDMEM＋FBSをウェルに加えて残った組織を回収し、ウェルの中身すべてをチューブに移します。次に、氷上で融解させたコラゲナーゼを最終濃度 0.01%となるようにチューブに加え、パラフィルムで密封して、37 °C の恒温水槽中で振盪しながらインキュベートします。4時間後、新鮮な FBS 添加 DMEM をチューブに満たして最終容量を 50 milliliters とし、遠心分離によって組織片を回収します。ペレットを乱さないように上清を除去し、細胞を 40 milliliters の新鮮な培地で再懸濁して、再度遠心分離を行います。2番目のペレットを25 millilitersの新鮮なFBS添加DMEMに再懸濁し、組織の大きな凝塊を沈殿させます。次に、上清を新しい100 millimeterディッシュに移し、滑膜細胞を37 degrees Celsius、5%CO2で14日間インキュベートします。滑膜細胞の培養を拡大するには、使用済みの培地を除去し、5 millilitersのPBSで細胞を洗浄します。PBSを除去し、細胞培養インキュベーター内で1 milliliterのEDTAを用いて2分間細胞を解離させます。インキュベーション終了後、ディッシュを軽くタッピングして残っている接着細胞を剥離させ、得られた細胞懸濁液を遠心分離用に15 milliliterコニカルチューブに移します。ペレットを30 millilitersのDMEMおよびFBSで再懸濁し、細胞を3枚の新しい100 millimeterディッシュに分注します。滑膜細胞を3日ごとに新鮮な培地で継代し、先ほど実演したように、コンフルエンシーが80%に達した時点で3つの新しい培養容器に分割します。導入の0日目に、3 x 10⁴個のFLSを新鮮な増殖培地とともに6ウェルプレートに播種し、37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。翌日、4つの山中因子を含むLenti-virus 1バイアルを4 °Cで融解し、FLS培養液をヘキサジメトリンブロミドとアスコルビン酸を添加したFLS増殖培地へと交換します。バイアルの内容物が融解したら、レンチウイルスを30 µL細胞に添加し、ウイルスが均一に分散するように穏やかに混合します。感染効率を高めるため、プレートを遠心分離し、細胞をインキュベーターに戻します。その後3日間、酪酸ナトリウムとアスコルビン酸を含む新鮮なFLS増殖培地で毎日培地交換を行います。4日目に、培地を酪酸ナトリウムとアスコルビン酸を含むFLS増殖培地とiPSC培地の混合液に交換します。5日目に、カルシウムおよびマグネシウムを含まないPBS 6 mLにビトロネクチン60 µLを加え、6ウェルプレートの3ウェルにこの溶液を2 mLずつ分注し、室温で1時間以上コーティングします。ビトロネクチンの静置中に、形質導入した細胞をPBSで洗浄し、実演通りにEDTAで剥離させます。遠心分離により解離した細胞を回収した後、ペレットを新鮮な培地900 µLに再懸濁します。ウェルから過剰なビトロネクチンを除去し、個々のウェルに300、150、および100 microlitersの細胞を添加します。その後、細胞をインキュベーターに戻し、コロニーが出現するまで毎日新鮮なiPSC培地で培地交換を行います。コロニーをピックアップするために、まずビトロネクチンでコーティングした48ウェルプレートの各ウェルに、ROCK阻害剤を添加したiPCS培地を500 microliters加えます。次に、FLS培養物をクリーンベンチ上の解剖顕微鏡下に置き、10 µLのピペットチップを用いて目的のコロニーの周囲を切り出します。200 µLのピペットチップを用いて、採取したコロニーを48ウェルプレートの1ウェルに転写します。すべてのコロニーの採取が完了したら、コロニーが転写可能な大きさに成長するまで、プレートを細胞培養インキュベーターに入れておきます。顕微鏡の100倍視野からはみ出すまでコロニーが増殖した時点で、細胞を継代します。この画像では、最初の14日間の培養後の単離FLSの形態が観察できます。これらの細胞は概して線維芽細胞の特性を示しており、線維化マーカーであるvimentinおよびfibronectinと同様の発現が見られる一方で、マクロファージ様滑膜細胞マーカーであるCD-68の発現は低くなっています。山中因子のレンチウイルス導入から8〜11日後になると、小さなコロニーが出現し始め、これらをピックアップして5〜10継代まで増幅させることができます。これらの関節リウマチiPSCはアルカリホスファターゼを発現しており、未分化状態が維持されていることが示されています。また、RT-PCRおよび免疫蛍光分析によって、これらの細胞が多能性マーカーを発現していることが確認されました。核型分析の結果、関節リウマチiPSCは44+XYという正常な染色体パターンを示しています。さらに、SCIDマウスへの注入から12週間後、関節リウマチiPSCは、多様な組織表現型を示すテラトーマを形成しました。その胚葉分化は、免疫蛍光染色によって確認されました。これにより、滑膜由来のFLSからiPSCを生成することが可能となりました。ビデオを視聴することで、滑膜組織からの分離方法および、それらを用いたリプログラミング誘導の方法についてより深く理解できたはずです。これらのRAF-FLS由来iPSCは、リウマチ学における再生の研究や薬剤スクリーニングに有用です。これらのiPSCが樹立されれば、様々な種類の標的細胞や臓器を生成することが可能になります。これは、疾患の研究や、遺伝子編集などの将来的な他の応用に有用であると考えられます。

generation-induced-pluripotent-stem-cells-using-fibroblast-like

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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