2016年7月2日
ミニブタの滑液と骨髄から分離され、注射器吸引を使用して非侵襲的に採取された間葉系幹細胞(MSC)を確立するプロトコルが提示されます。細胞表現型は、細胞単離後のフローサイトメトリーを使用し、MSCに由来する骨髄および滑液のin vitro培養を用いて行いました。
この手順の全体的な目標は、ミニブタから滑液と骨髄を非侵襲的に収集して、再生および免疫調節研究に使用する間葉系幹細胞を収集することです。この方法は、MSCで滑液を確立する方法や、骨髄MSCと比較してそれらを特徴付ける方法など、耳科医のMSC療法分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ミニブタの滑液および骨髄由来MSCの主要な特性を効果的に確立することであり、これは患者への適用に役立ちます。
この技術の意味は、滑液由来の MSC の集団が滑液腔内の運動患者で大幅に増加するため、さまざまな関節疾患の治療にまで及びます。この方法は再生医療への洞察を提供しますが、自己免疫疾患の研究などの他の研究にも適用できます。ミニブタMSCは自家であるため、免疫抑制はヒトに興味を持つかもしれません。
他の科学者に加えて、手順を実演するのは、私のレベル3のHyeon-Jeong LeeとWon-Jae Leeです。まず、麻酔をかけたミニブタを腸骨稜にアクセスできるように向けます。次に、かみそりまたはバリカンを使用して、腸骨稜の15平方センチメートルの領域を脱毛します。
次に、露出した皮膚をポビドンヨードと70%エタノールで交互に3回こすります。完全に乾いたら、滅菌ドレープを塗ります。次に、10ミリリットルの注射器にヘパリンをプレコートし、3〜4ミリリットルのリンスを使用します。
これにより、骨髄が抽出される間、骨髄が凝固するのを防ぐことができます。次に、腸骨骨稜で正確に、骨髄抽出器をヘパリン被覆シリンジにしっかりと取り付け、少なくとも5ミリリットルの骨髄を抽出します。抽出した骨髄から細胞を単離するには、まず、室温で15ミリリットルの円錐形チューブに同量のDPBSで細胞を希釈します。
次に、3ミリリットルの密度遠心分離媒体を2番目の15ミリリットルの円錐管にロードします。次に、希釈した骨髄4ミリリットルを密度遠心分離培地に慎重に移し、2溶液層を作成します。次に、チューブを400Gで室温で40分間遠心分離します。
目的の多国籍企業が中央の白い層に集められます。このレイヤーだけを吸引します。MNC層を15ミリリットルの円錐管に噴射し、7〜8ミリリットルのDPBSで希釈します。
次に、細胞を500Gで室温で10分間遠心分離します。上清を捨て、パレットに載せた細胞を10ミリリットルのDPBSで2回洗浄し、前の遠心分離サイクルを繰り返します。2回の洗浄後、MNCを2ミリリットルのADMEMに懸濁します。
次に、細胞を35mmの組織培養皿にロードし、加湿した5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏38.5度でインキュベートします。48時間後、付着していない多国籍企業と一緒に培地を吸引します。次に、2ミリリットルの新鮮なADMEMを戻し、3日ごとに培地を交換しながらインキュベーションを続けます。
細胞が70〜80%の密度に達したら、新鮮なDPBSで培養物を洗浄します。次に、1ミリリットルの0.25%トリプシン-EDTAを摂氏37度で3〜5分間使用して、細胞を解離します。細胞を10ミリリットルのADMEMに集め、15ミリリットルの円錐管に移します。
その後、細胞を室温で300Gで5分間スピンダウンし、上清を捨てます。次に、収穫した多国籍企業を1ミリリットルの新鮮なADMEMに懸濁し、その密度を測定します。1/2から25百万のセルを4ミリリットルのADMEMでT25フラスコにめっきして仕上げます。
プレートと同じようにフラスコをインキュベートし、3日ごとに培地を交換します。骨髄採取の準備時に行ったように、大腿骨関節の上に皮膚の15x10センチメートルの部分を準備します。次に、滑膜関節を特定するために、皮膚の下の膝蓋骨と脛骨の稜を触診し、23ゲージの針が付いた3ミリリットルの注射器を関節に正確に挿入します。
穏やかな吸引を使用して、1/2から1ミリリットルの液体を抽出し、すぐに針を引き抜きます。滑液の量が小さすぎる場合は、DPBSでキャビティを洗い流し、DPBSで滑液を収集します。使用するDPBSの量は、滑膜腔のサイズによって異なります。
滑液の最適量は、健康な関節では制限されます。体積は、その関節のサイズと病理学的状態によって異なります。滑液から細胞を単離するには、室温で15ミリリットルの円錐形チューブ内の等量のDPBSで液体を希釈します。
次に、40ミクロンのナイロン製セルストレーナーで希釈液をろ過して、破片を移動させます。次に、さらに10ミリリットルのDPBSを加え、懸濁液を室温で10分間400Gで遠心分離します。次に、上清を捨て、DPBSを使用して細胞を2回洗浄します。
洗浄したセルパレットを2ミリリットルのADMEMに吊り下げます。その後、MSCで実証されたように細胞の培養を進め、MSCはミニブタの骨髄および関節滑膜関節から成功裏に単離され、in vitroで拡大されました。
滑液由来MSCの形態は骨髄由来MSCと類似しており、どちらも線維芽細胞性紡錘体形状をしており、均一に付着しています。MSCは、3回目の継代培養が完了した後、アルカリホスファターゼ染色に対して陽性の発現を示しました。次に、両方の培養物で表面マーカーを分析しました。
予想通り、両タイプのMSCはCD29、CD44、およびビメンチンを有意に発現しました。対照的に、CD34とCD45の発現は陰性で低かった。これらの結果は、滑液から単離された細胞を含む特徴的なMSCを通じて得られた結果と同一でした。
このビデオを見た後、あなたは非侵襲的に滑液と骨髄を吸引する方法をよく理解しているはずです 彼らのMSCをミニブタから分離するために、そしてこのMSCの比較と表現型をどのように実行するか。この手順を試みるときは、慎重な触診によって決定された腸骨稜と滑膜の客観的な点を特定することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、変形性関節症や関節リウマチのモデルのような他の方法を実行して、骨髄MSCだけでなく滑液MSCからだけでなく、滑液MSCも軟骨または骨の開始と免疫抑制のための同じ種類の能力を持っているかどうかなどの追加の質問に答えることができます。
その開発後、この技術は、関節炎患者の発作または炎症を起こした関節に由来するMSCを特徴付けるのを助けることにより、関節疾患の自家療法を進歩させました。
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この記事では、ミニブタの滑膜液と骨髄から間葉系幹細胞(MSC)を非侵襲的に収集するためのプロトコルを提示します。この研究は、再生医療と免疫調節への応用のためのこれらの細胞の特性を特徴付けることの重要性を強調しています。
Non-invasive isolation and phenotyping of mesenchymal stem cells (MSCs) from minipig synovial fluid and bone marrow enables robust comparative analysis of cell sources for regenerative and immunomodulatory research. This workflow supports early-stage target validation and de-risks translational studies by providing standardized, reproducible MSC populations for downstream applications. The approach enhances predictive confidence in preclinical model selection and portfolio advancement for cell-based therapies targeting joint and autoimmune diseases.
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying standardized MSCs for target validation, assay development, and translational research in joint and autoimmune disease models.