ミニブタの滑液および骨髄由来の間葉系幹細胞の単離および細胞表現型

本手順の全体的な目的は、再生および免疫調節研究に使用する間葉系幹細胞を回収するために、ミニピッグから滑液および骨髄を非侵襲的に採取することです。この手法は、滑液由来MSC（間葉系幹細胞）をどのように確立するか、また、骨髄由来MSCと比較してそれらをどのように特性評価するかなど、耳科におけるMSC治療分野の重要な疑問に答えるのに役立ちます。本技術の主な利点は、ミニピッグからの滑液および骨髄由来MSCの重要な特性を効果的に確立できることであり、これは患者への応用に有用です。

この技術の意義は、さまざまな関節疾患の治療へと広がります。なぜなら、スポーツ選手の関節腔内では、滑膜液由来MSCの集団が著しく増加しているためです。この手法は再生医療への知見を提供し得るだけでなく、自己免疫疾患の研究などの他の研究にも応用可能です。ミニブタMSCは自家ものであるため、ヒトにおける免疫抑制への応用も期待されます。

他の科学者に加え、私のレベル3の学生であるHyeon-Jeong LeeとWon-Jae Leeが手順の実演を行います。まず、麻酔をかけたミニピッグを、腸骨稜にアクセスできる向きに配置します。次に、カミソリまたはバリカンを使用して、腸骨稜上の15平方センチメートルの領域を脱毛させます。

次に、露出した皮膚をポビドンヨードと70% ethanolで交互に3回洗浄します。完全に乾燥した後、滅菌ドレープを掛けます。ここで、10 mLシリンジを3〜4 mLのリンスを用いてヘパリンでプレコートします。

これにより、骨髄の抽出中の凝固を防ぎます。次に、腸骨稜の正確な位置で、骨髄抽出器をヘパリン処理済みのシリンジにしっかりと取り付け、少なくとも5 mLの骨髄を抽出します。抽出した骨髄から細胞を分離するため、まず室温で15 mLコニカルチューブを用い、等量のDPBSで希釈します。

次に、2本目の15 mLコニカルチューブに密度勾配遠心分離用培地を3 mL分入れた。続いて、希釈した骨髄4 mLを密度勾配遠心分離用培地の上に慎重に重層させ、2層の状態にする。その後、チューブを室温で400 Gs、40分間遠心分離する。

目的のMNCは中央の白色層に回収されます。この層のみを吸引してください。MNC層を15 mLコニカルチューブに分注し、7〜8 mLのDPBSで希釈します。

次に、細胞を室温で500 Gs、10分間遠心分離します。上清を捨て、ペレット化した細胞を10 mLのDPBSで2回洗浄し、前述の遠心分離サイクルを繰り返します。2回の洗浄後、MNCsを2 mLのADMEMに懸濁します。

次に、細胞を35 mm組織培養ディッシュに播種し、加湿した5% carbon dioxideインキュベーター内で38.5 °Cで培養します。48時間後、未接着のMNCsと共に培地を吸引除去します。その後、2 mLの新鮮なADMEMを添加し、3日ごとに培地を交換しながら培養を継続します。

細胞が70〜80%コンフルエントに達したら、新鮮なDPBSで培養液を洗浄します。次に、0.25% Trypsin-EDTAを1 mL加え、37 °Cで3〜5分間インキュベートして細胞を剥離させます。細胞を10 mLのADMEMで回収し、15 mLコニカルチューブに移します。

次に、室温で300 Gsで5分間遠心分離し、上清を除去します。回収したMNCsを1 mLの新鮮なADMEMに懸濁し、細胞密度を測定します。最後に、1/2から3/4百万個の細胞を、4 mLのADMEMと共にT25フラスコに播種して完了です。

プレートと同様にフラスコをインキュベートし、3日ごとに培地を交換します。骨髄採取の準備時と同様に、大腿関節上の15x10 cmの皮膚領域を準備します。次に、皮膚の下から膝蓋骨と脛骨稜を触診して滑膜関節を特定し、23Gの針を装着した3 mLシリンジを関節に正確に挿入します。

緩やかな吸引を用いて、1/2から1 mLの液体を抽出し、直ちに針を抜きます。滑液の量が少なすぎる場合は、関節腔にDPBSを注入して洗浄し、DPBSと共に滑液を回収してください。使用するDPBSの量は、関節腔の大きさに応じて異なります。

健康な関節における滑液の最適量は限定的です。その量は関節の大きさや病理学的状態によって異なります。滑液から細胞を単離するには、室温にて15 mLコニカルチューブを用い、同容量のDPBSで滑液を希釈します。

次に、希釈液を40μmのナイロンセルストレーナーでろ過し、デブリを除去します。その後、DPBSをさらに10 mL加え、室温で400 G、10分間、懸濁液を遠心分離します。続いて、上清を捨て、DPBSを用いて細胞を2回洗浄します。

洗浄した細胞ペレットを2 mLのADMEMに懸濁します。その後、MSCで示された方法で細胞の培養を行います。ミニピッグの骨髄および関節滑膜関節からMSCの分離に成功し、in vitroで拡大培養しました。

滑液由来MSCの形態は骨髄由来MSCと同様であり、どちらも線維芽細胞様の紡錘形を呈し、均一に接着します。3回目の継代完了後、MSCはアルカリフォスファターゼ染色において陽性反応を示しました。次に、両方の培養細胞において表面マーカーの解析を行いました。

予想通り、両方のタイプのMSCはいずれもCD29、CD44、およびVimentinを強く発現していました。対照的に、CD34およびCD45の発現は陰性または低発現でした。これらの結果は、滑液から単離された細胞を含む、異なるMSCで得られた結果と一致していました。

このビデオを視聴することで、ミニピッグからMSCを単離するために、滑液と骨髄を非侵襲的に吸引する方法、およびこれらのMSCの比較と表現型解析を行う方法について十分に理解することができます。この手順を実施する際は、慎重な触診によって、腸骨稜および関節腔上の目的点を特定することが重要です。この手順に続き、変形性関節症や関節リウマチのモデルなどの他の手法を用いることで、骨髄由来MSCだけでなく滑液由来MSCにおいても、軟骨や骨への分化能および免疫抑制能が同様に備わっているかといった、さらなる疑問を検討することが可能です。

この技術の開発後、関節炎患者の罹患または炎症を起こした関節から採取されたMSCの特性解析が可能となり、関節疾患の自己療法が促進されました。