Name: C2C12筋芽細胞における筋強直性ジストロフィー1のモデル化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶC2C12筋芽細胞を用いた筋強直性ジストロフィー1のモデル化手法。遺伝子導入と分化誘導により病態メカニズムを解明し、筋疾患治療研究への応用が期待されます。

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試薬について、ベイラー医科大学のトム・クーパー博士、ウィスコンシン大学マディソン校のマニ・S・マハデヴァン博士、ジュネーブ大学のディディエ・トロノ博士に感謝します。この研究は、ヒューストン大学のスタートアップファンド(YL)、米国心臓協会の助成金(YL、11SDG5260033)、および中国国立自然科学基金会(XP、81460047)によってサポートされています。

1. C2C12細胞培養<ol><li> 20％ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを補充した増殖培地（ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM））中で100mMのプレートでC2C12マウス筋芽細胞を維持します。 60％コンフルエント - C2C12継代細胞が約50になることを許可します。 </li><li>増殖培地を廃棄3 mLの室温のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）でC2C12細胞を洗浄します。 PBSを削除し、細胞を剥離するために、500μlの0.25％トリプシン-EDTAを追加します。 5分- 37°C、3、5％CO 2インキュベーターでプレートを置きます。 </li><li> 3mlの増殖培地を添加することによりトリプシンを中和します。細胞を懸濁するために8回 - 6ピペット。新規の100mmプレートに懸濁させ、細胞1 mlを加え、37℃、5％CO 2でインキュベートします。 </li></ol> 2. C2C12細胞トランスフェクション/形質導入および選択<ol><li> C2C12のプラスミドトランスフェクション<ol><li>トランスフェクション前、pまで24時間各トランスフェクションのための6ウェルプレートの1ウェルに遅れて7.0×10 5 C2C12細胞。 注：これは50につながる - トランスフェクションの時点で60％コンフルエンス。 </li><li>トランスフェクション試薬は使用前に室温に戻します。 </li><li>簡単に予熱した無血清培地と渦を200μlにプラスミドDNA（GFP-CUG5またはGFP-CUG200）2μgのを追加します。培地に6μlのトランスフェクション試薬を加え、ボルテックスを用いて30秒間、すぐに混ぜます。室温で30分間混合物をインキュベートします。 </li><li> 2.5ミリリットルの無血清増殖培地にC2C12細胞のメディアを変更します。インキュベーション後、細胞にトランスフェクション混合物を追加します。 5％CO 2、37℃のインキュベーターにプレートを返します。 </li><li> 4時間または一晩までのトランスフェクション混合物/無血清増殖培地中で細胞を保管してください。翌日バック増殖培地へのメディアを変更するか、または細胞傷害性は明らかであるとき。 注：細胞毒性は、CEの顕微鏡検査によって評価されますLLS。細胞の形態と細胞の剥離の変化を観察します。限り、明白な細胞毒性がないように、無血清増殖培地中で一晩インキュベートし、トランスフェクションを増強します。 </li><li> （プラスミドなしでトランスフェクト）コントロール培養物は、生細胞を持っていないまで、10日〜のために1.6mg / mlのG418 - 1.2を追加することによって、細胞をトランスフェクション後48時間を選択します。 G418を補充した成長培地で2日毎に培地を変更します。 </li><li>その後の実験のために、37℃で増殖培地および5％CO 2でG418耐性細胞を維持します。 </li></ol></li><li>レトロウイルスの調製およびC2C12レトロウイルス形質導入<ol><li> 10％ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを含むDMEM高グルコースを補充することによりHEK 293培地を準備します。 <ol><li>約24時間のトランスフェクションの前に、100ミリメートルプレート（トランスフェクション80％コンフルエンス）に4.0×10 6エコトロピックHEK 293ベースのパッケージング細胞をプレートContaining細胞培養培地。 </li></ol></li><li>トランスフェクション試薬は使用前に室温に戻します。 </li><li> 1ミリリットルの無血清増殖培地中で15μgのプラスミドDNA（のpMSCV-PuroのかのpMSCV-Celf1Flag-プーロ）を混ぜます。簡単にボルテックス。 DNA /無血清増殖培地チューブにステップ2.2.2から30μlのトランスフェクション試薬を追加し、ボルテックスを用いてよく混ぜます。室温で30分間混合物をインキュベートします。 </li><li>エコトロピックHEK 293ベースのパッケージング細胞にトランスフェクション混合物の滴下を追加します。静かにプレートを旋回し、5％CO 2、37℃のインキュベーターに戻し、それらを返します。 24時間後、10ミリリットル予め温めた新鮮な増殖培地にメディアを変更します。 </li><li>上清（含むレトロウイルス）ピペットを用いてトランスフェクションの48時間後に収穫し、50mlの遠心チューブに上清を移します。プレートに新しい暖かいメディアの10ミリリットルを加え、インキュベーターに戻します。 4℃で上清を保管してください。 注：メディアはトンに静かに追加されます彼は井戸の側細胞単層を破壊しないように。 </li><li>トランスフェクション後の上清60時間の第二のバッチを収穫し、2.2.5からの上清と、それをプールします。細胞破片を除去するために7分間500×gで、4℃で遠心分離します。 </li><li>新しい50ミリリットルの遠心管に上清を移します。 2.2.9またはアリコートに進み、将来の使用のために-20℃で上清を保存するために進むことによって、この時点でC2C12細胞を形質導入するためにレトロウイルスを使用してください。 </li><li>凍結ストックがここで使用されている場合、室温で2.2.7からレトロウイルスを解凍します。 注：複数の凍結融解の繰り返しは避けてください。 </li><li>合流の40％ - 30を目指し伝達の同じ日にC2C12細胞をプレート。 <ol><li>増殖培地を捨て、3ミリリットルの室温PBSでC2C12細胞を洗います。 PBSを削除し、500μlの0.25％トリプシン-EDTAを追加し、37°C、3、5％CO 2インキュベーター内でプレートをインキュベートする- 5分。 </li><li> 3ミリリットルの成長MEDを追加することにより、トリプシンを中和イウム。細胞を懸濁するために8回 - 6ピペット。血球計数器を用いて細胞を数え、60ミリメートルプレートに8.0×10 5 C2C12細胞を追加します。 </li></ol></li><li> 3ミリリットル成長培地中の細胞の1 60ミリメートルプレートを感染させるために0.5ミリリットルレトロウイルスを追加します。インキュベーターにプレートを返します。 </li><li> （ - 3 / mlのピ​​ューロマイシン1）感染後48時間で3ミリリットル選択抗生物質を補った新鮮な培地と交換してください。形質導入されていないC2C12制御文化が出て死ぬまで〜5日間、毎日抗生物質を含む培地3ミリリットルを交換してください。 </li></ol></li><li>レンチウイルスの調製およびC2C12のレンチウイルス形質導入 注：バイオセーフティレベル2キャビネット内のすべてのレンチウイルス関連の手順を実行し、生物学的安全性のガイドラインに従ってください。ウイルスを含有する液体廃棄物は、廃棄前に消毒する必要があります。 <ol><li> 10％の胎児を補充したHEK 293細胞培地（DMEM高グルコース100ミリメートルプレート（〜トランスフェクションの日に80％コンフルエント）でプレート4.0×10 6個の293T細胞を、ウシ血清、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および2mM L-グルタミン）トランスフェクション前に24時間。 </li><li>室温へのトランスフェクション試薬を温めます。 8μgのレンチウイルス導入ベクターと一緒にレンチウイルスパッケージングベクター（4μgのpMD2.Gと6μgのpsPAX2）ミックス（Celf1のshRNAをまたは対照shRNAをスクランブル）1ミリリットルの無血清細胞培養培地中。簡単にボルテックス。 </li><li> DNA / DMEMチューブに36μlの予熱したトランスフェクション試薬を加え、ボルテックスでよく混ぜます。室温で30分間混合物をインキュベートします。 </li><li>インキュベーターから293T細胞を除去し、プレートにトランスフェクション混合物を追加します。静かにプレートを旋回し、戻って5％CO 2、37℃インキュベーターにそれを返します。 24時間後、10ミリリットルの新鮮な培地でトランスフェクション混合物を交換してください。 </li><li>トランスフェクション後にレンチウイルスの48時間を含む上清を収集し、50ミリリットルの遠心分離管にそれを転送します。プレートに10ミリリットル新しい暖かいメディアを追加し、それを返しますインキュベーターへ。 4℃で上清を保管してください。 </li><li>トランスフェクション後の上清60時間の第二のバッチを収集し、2.3.5からの上清とそれを組み合わせます。 7分間500×gで、4℃で遠心分離簡単。 </li><li>新しい50ml遠心管に上清を移します。新鮮なウイルスを使用している場合は、2.3.9に進みます。将来の使用のために、店舗の10ミリリットルの分注して-20℃で上清をウイルス含有。 </li><li>凍結ストックが使用される場合、使用前に室温2.3.7からウイルスを解凍。 注：複数の凍結融解の繰り返しは避けてください。 </li><li> （2.1節）で得られたプレートC2C12-CUG200細胞の形質導入の同じ日に2.2.9で説明したように。 注：30を目指して - コンフルエンスの40％。 </li><li> C2C12-CUG200の60ミリメートルプレートに感染し、インキュベーターにプレートを返すために、0.5ミリリットルのウイルスを追加します。 </li><li>形質導入後72時間 - 選択抗生物質（3 / mlのピ​​ューロマイシン1）を補った新鮮な培地と培養液を交換してください。すべての形質導入されていないC2C12-CUG200制御文化が出て死ぬまで〜5日間の選択抗生物質で培養培地を毎日更新します。 </li><li> GFP-CUG200トランスフェクションした細胞でCelf1ノックダウンを確認するために、ウエスタンブロットを使用してください。 </li></ol></li></ol> 3. C2C12細胞の分化<ol><li>プレート分化の開始前に、2.5ミリリットルの増殖培地24時間で6ウェルプレートの1ウェル中の2×10 6個の細胞。 注：完全なコンフルエンスが24時間で達成されるように、プレーティング密度を調整することができます。 <ol><li> PBSでコンフルエント細胞をリンスし、低血清分化培地2.5 mLを加え（2％ウマ血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、および1μMインスリン） 。 2日毎に培地を交換してください。 注：凍結ストックのインスリンを保持し、各培地交換時にメディアに追加します。 </li></ol></li><li> C2C12分化の間に、泉のためのサンプルを収集titative以下の時点でのRT-PCR（セクション4を参照してください）​​：Day0、1、2、4、6日目に免疫染色のための培養6.プロセス - 8（第5節参照）。 </li></ol> 4. RNAの単離および定量的RT-PCR <ol><li> RNA単離のために、製造業者のプロトコルを使用してください。単離後、30μlのRNaseフリー水でRNAペレットを再懸濁し、上下に数回をピペットと。 注：サンプルは、定量的RT-PCRに進むか、または-80℃で保存することができます。 </li><li>定量的RT-PCR 10のためのRT定量PCRキットを使用し、製造元の指示に従ってください。 表1に従って反応ミックスを調製します。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 成分 </td><td> 容量（μL） </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> 2×反応緩衝液</td><td> 10 </td><td> 1倍</tD&gt; </tr><tr><td>フォワードプライマー</td><td> 0.5 </td><td> 200 nMの</td></tr><tr><td>リバースプライマー</td><td> 0.5 </td><td> 200 nMの</td></tr><tr><td>プローブ</td><td> 0.5 </td><td> 200 nMの</td></tr><tr><td>転写酵素＆RNアーゼ阻害剤を逆に</td><td> 0.1 </td><td> 0.25 U / mlの</td></tr><tr><td>テンプレート</td><td> 1 </td><td> 100 ngの全RNA </td></tr><tr><td> RNaseを含まない水</td><td> 7.4 </td><td> NA </td></tr><tr><td>合計ミックス</td><td> 20 </td><td></td></tr></tbody></table> 表1定量的RT-PCRマスターミックス調製 <ol start="3"><li>熱プロファイルの表2を用いて、20μlのRT-qPCRの反応を実行します。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>逆転写ステップ</td><td> 30分間、48°C </td></tr><tr><td> DNAポリマーアーゼ活性化/逆転写酵素の不活化</td><td> 10分間、95°C </td></tr><tr><td rowspan="2"> 40サイクル</td><td> 15秒、95°C </td></tr><tr><td> 1分、60°C </td></tr></tbody></table> 表2の定量的RT-PCR温度プロファイル 5.免疫染色<ol><li>たて10分間室温で4％パラホルムアルデヒド/ PBSを用意し2.5ミリリットルで単層培養を修正しました。 </li><li>室温で30分間、2.5 mlの0.1％トリトンX-100 / PBSで試料を透過。 </li><li>加湿チャンバーにサンプルを転送します。 37℃で30分間、緩衝液（0.1％の非イオン性界面活性剤/ PBS、10％正常ヤギ血清）でブロッキング2.5 ml中にサンプルを遮断します。 </li><li>ブロッキングバッファーを捨て、バッファ（1：100）をブロックで希釈したミオシン重鎖に対して800μlの一次抗体を適用します。室温で一晩加湿チャンバー内でインキュベートします。 </li><li>プレート3ティムを洗います2日目に2.5ミリリットルの洗浄緩衝液（0.1％ポリソルベート20 / PBS）とエス（各10分）。 </li><li>洗浄バッファーを削除し、800μlの二次抗体（ヤギ抗マウスIgG、1：PBSで希釈した500）を適用します。 1時間室温で加湿チャンバー内でインキュベートします。 </li><li> 2.5ミリリットル洗浄緩衝液で2回（各10分）を洗浄します。 </li><li> 5分間（1μgの/ mlの蒸留脱イオンH 2 Oで希釈）800μlのDAPIと共にインキュベートします。 </li><li> 10分間再び2.5ミリリットルの洗浄緩衝液で洗浄します。 </li><li> 2.5ミリリットルのPBSに洗浄緩衝液を変更し、イメージをキャプチャするために、蛍光顕微鏡を使用しています。 </li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

C2C12細胞株は、筋形成11-14を研究するためのモデルとして使用されてきました。これらの細胞は、線維芽細胞様の外観を保持し、20％ウシ胎児血清を含む培地中で急速に増殖し、容易に2％ウマ血清15を含む培地中で分化します。速い増殖および分化は、筋形成細胞モデルにおいて有利な特性です。ここでは、C2C12細胞にcDNAを、3&#39;-UTR、およびshRNAをを導入するプラスミド、レトロウイルス、およびレンチウイルスベクターの使用を実証します。トランスフェクション/形質導入および分化の一貫性の維持のための重要なポイントは以下の強調表示されます。 毎日の細胞の維持における細胞密度が非常に重要です。 70％コンフルエンス - これらの細胞は、50の下で培養される必要があります。一晩放置したときにより短い集団倍加時間に、高合流（&gt; 70％）C2C12文化が自然に分化します。自然発生的に分化した細胞の割合は小さいかもしれないが、存在分化した細胞のその後の分化実験の不一致に貢献していきます。さらに、低継代数を有する新たに解凍したC2C12細...

筋強直性ジストロフィー（DM）は、複数のシステム、最も特に心臓および骨格筋1に影響を与える常染色体優性疾患です。この病気、DM1とDM2の2つのサブタイプがあります。 DM1は、より一般的であり、DM2 2よりも深刻な症状を持っています。 DM1の根底にある遺伝的変異は、DMプロテインキナーゼ遺伝子（DMPK）3の3 &#39;非翻訳領域（UTR）に位置するCUGトリプレットリピートの拡大です。影響を受けていない個体でのCUG繰り返し数は対照的に、5から37まで変化し、それが50以上に、そして時にはDM1患者4で数千にまで増加します。その結果、のようなRNA結合タンパク質、マッスルのような1（MBNL1）、CUGBP、及びELAV様ファミリー1（Celf1）、誤調節されています。拡大CUGリピート上の隔離に、MBNL1は、選択的スプライシング5を調節する能力を失います。 Celf1が、一方、6,7アップレギュレートされています。 Celf1の過剰発現は、筋肉の損失に関連付けられていますMBNL1機能の喪失に起因しておらず、衰弱、。 DMPK 3&#39;-UTR CUG拡張、MBNL1の損失、およびCelf1の過剰発現を含むDM1​​関連の変化をシミュレートする動物モデルは、確立されています。しかし、筋芽細胞にDM1をモデル化することは、特にDM1に関連する細胞および分子事象を解剖するために、効率的な代替手段を提供しています。 C2C12筋芽細胞株は、最初に負傷したC3Hマウスの筋肉から単離され、広く筋原性分化8,9を研究するために使用しました。 C2C12細胞は急速にウシ胎児血清（FBS）培地を含有して増殖し、容易にFBSが枯渇したとき分化を受けます。しかし、この筋芽細胞分化モデルを使用して2つの課題を提示する：C2C12細胞は、多くの場合、遺伝子導入/形質導入、ウイルスに対して耐性です。および細胞取り扱いおよび分化手順のわずかな変動は、筋管形成の著しい変化につながることができます。 私たちの研究室では、日常的に交流としてC2C12筋芽細胞を使用していますエル・モデルと効果的C2C12細胞株10へのプラスミドのトランスフェクション、レトロウイルス形質導入、およびレンチウイルス形質導入によって遺伝子を送達プロトコルを開発しました。ビデオでは、我々は/トランスフェクトC2C12細胞に形質導入​​し、DM1の筋芽細胞モデルの確立に分化一貫性を維持するための最適化された手順を示しています。

<table><tbody><tr><td>DMEM、高グルコース</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td>培養培地</td></tr><tr><td>用 Fetal Bovine Serum - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>for culture medium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>for 培養培地</td></tr>イン<tr><td>スリン ウシ膵臓</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-100MG</td><td>分化培地</td></tr>馬<tr><td>血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12150</td><td>分化培地</td></tr><tr><td>用 FuGENE&nbsp;HDトランスフェクション試薬</td><td>Promega</td><td>E2311&nbsp;</td><td>トランスフェクション用</td></tr><tr><td>G418硫酸塩&nbsp;</td><td>ゴールドバイオテクノロジー&nbsp;</td><td>G-418-10</td><td>薬剤耐性選択用</td></tr><tr><td>ピュロマイシン二塩酸塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>sc-108071</td><td>薬剤耐性選択用</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well</td><td>Life Technologies</td><td>NP0323BOX</td><td>for western blot</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20x)Life</td> <td>Technologies</td><td>NP00061</td> for <td>western blot</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0002</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m</td><td>GE ヘルスケアライフサイエンス</td><td>10600015</td> ウェ<td>スタンブロット用</td></tr><tr><td>MF 20</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>MF 20</td><td>一次抗体 免疫染色用</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG (H+L) 二次抗体、Texas Red-X コンジュゲート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>T-862</td><td>二次抗体免疫染色</td></tr><tr><td>ワンステップ qRT-PCR MasterMix</td><td>AnaSpec</td><td>05-QPRT-032X</td><td>for qRT-PCR</td></tr><tr><td>TriPure Isolation Reagent</td><td>Roche</td><td>11667165001</td><td>for RNA isolation</td></tr><tr><td>CUG-BP1 抗体 (3B1)</td><td>santa cruz</td><td>sc-20003</td><td>primary Ab western blot</td></tr><tr><td>Actin Antibody</td><td>santa cruz</td><td>sc-1615</td><td>ヤギ ポリクローナル IgG ローディング制御用</td></tr><tr><td>293T Ecopack</td><td>レトロウイルス調製のための</td><td>Clontech</td><td>631507</td>細胞</tr><tr><td>pMSCV-puro</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td>レトロウイルス調製のための空のレトロウイルスベクターpMSCV-Celf1Flag-puro</td></tr><tr><td></td><td>家は</td><td></td>、<td>レトロウイルス調製に使用されたレトロウイルス調製に使用Celf1Flagをコードするレトロウイルスベクターをコード化していません</td></tr><tr><td></td><td>Didier Tronoからの贈り物</td>レンチ<td>ウイルス調製には</td><td>利用できません</td></tr><tr><td>ディディエ・トロノからの</td><td>pMD2.G</td>ギフトは<td>レンチウイルス製剤に</td><td>利用できません</td></tr><tr><td>MSマハデヴァンからの</td><td>GFP-CUG5</td>ギフトは<td>参照10&nbspで</td><td>詳細が利用できません</td>。</tr><tr><td>GFP-CUG200</td><td>M.S. Mahadevanからのギフト</td><td>は、</td><td>参考文献10&nbsp;</td></tr><tr><td>トリトン&nbsp;X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td>免疫染色用 <td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td> 免疫<td>染色用</td></tr><tr><td>TWEEN&nbsp;20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>免疫染色用</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td> 免疫<td>染色用</td></tr></tbody></table>

c2c12筋芽細胞における筋強直性ジストロフィー1のモデル化

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

筋強直性ジストロフィー1（DM1）は、筋ジストロフィーの一般的な形式です。いくつかの動物モデルは、DM1のために確立されてきたが、彼らは細胞および分子事象を研究するための効率的な細胞の代替を提供するので、筋芽細胞モデルは依然として重要です。 C2C12筋芽細胞は広く遺伝子トランスフェクション、またはウイルス形質導入に筋形成、抵抗性を研究するために使用されているが、C2C12細胞の研究を妨げています。ここでは、C2C12筋芽細胞および筋細胞分化の誘導に遺伝子を導入するために日常のメンテナンス、トランスフェクションおよび形質導入手順が含まれて最適化されたプロトコルを記述します。まとめると、これらの手順は、最高のトランスフェクション/形質導入効率を可能にするだけでなく、一貫性の分化の結果。筋緊張性ジストロフィーの研究だけでなく、他の筋肉疾患に利益をもたらすDM1筋芽細胞モデルの確立に記載されているプロトコル。

C2C12細胞を、GFP-CUG5またはGFP-CUG200でトランスフェクトしました。薬剤耐性の選択の後、安定したプールは、GFP発現（ 図1A）によって可視化することができる、確立しました。分化した筋芽細胞における筋管形成は、10（ 図1B）を免疫染色重鎖ミオシンによって検出しました。筋管形成の定量化は、融合指数は2.6±1.1％に35.4±4.1％から減少し、筋管領域は、GFP-CUG200（ 図1C）に異常CUG拡大により2.7±0.8％に35.6±2.2％から減少したことを実証しました。融合インデックス及び筋管領域が核の総数は、それぞれ、筋管で覆われた総画像面積の割合で割った筋管（≥2核）における核の総数を介してカウントしました。リアルタイムRT-PCR 10は、異なる筋肉の数の発現を分析するために行きました。MyoD、MyoG、MEF2CとCelf1含むiation関連遺伝子。 CUG5培養物と比較して、CUG20...

このプロトコルでは、我々は、最適化されたC2C12細胞の維持、遺伝子トランスフェクション/形質導入、および筋細胞分化を含む、筋緊張性ジストロフィー1筋芽細胞モデルを確立する手順を提示します。

C2C12筋芽細胞における筋強直性ジストロフィー1のモデル化

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

これらの筋芽細胞の維持、トランスフェクション、およびトランスダクション手順の全体的な目的は、筋強直性ジストロフィーおよびその他の筋疾患の研究に向けた、筋強直性ジストロフィーの一細胞モデルを確立することです。この手法は、筋強直性ジストロフィーの病態生理の詳細なメカニズムを調査する際に有用なM1筋芽細胞モデルの確立に寄与します。C2C12筋芽細胞に対するこの多段階の遺伝子操作により、M1における連続的な遺伝学的病理イベントのモデリングが可能になります。トランスフェクションの24時間前に、C2C12細胞を1ウェルあたり7×10⁵個、6ウェルプレートに播種します。翌日、目的のプラスミドDNA 2 µgを、室温の無血清培地 200 µLに加え、溶液を短時間ボルテックスします。次に、室温のトランスフェクション試薬 6 µLを培地に加え、直ちに溶液を30秒間ボルテックスします。その後、培地を室温で30分間インキュベートします。インキュベーションの最後の5分間に、各ウェルの培地を2.5 mLの新鮮な無血清増殖培地に交換し、各ウェルに200 µLのトランスフェクション混合液を加えます。その後、プレートを細胞培養インキュベーターに戻し、4時間培養します。その後、顕微鏡下で細胞の形態変化と接着状態を確認する。細胞毒性が観察された場合は、無血清培地を増殖培地に変更する。トランスフェクションの48時間後から、新鮮な増殖培地を用いて、適切な選択抗生物質を2日ごとに10日間添加する。プラスミドを導入していないコントロールウェルには生存細胞が含まれていません。レトロウイルスを調製するには、まず 4 × 10⁶ 個のエコトロピックHEK293ベースのパッケージング細胞を、細胞培養液を含む100 mmプレートに播種します。翌日、目的のプラスミドDNA 15 µgを1 mLの無血清増殖培地に混合し、チューブを短時間ボルテックスします。次に、室温のトランスフェクション試薬を30 µL培地に加え、直ちに溶液を30秒間ボルテックスします。室温で30分間置いた後、トランスフェクション混合液をエコトロピック細胞に滴下し、プレートを緩やかに揺らして混ぜ合わせます。プレートを細胞培養インキュベーターに戻して24時間培養し、翌日に培地を37 °Cの新鮮な増殖培地10 mLに交換します。トランスフェクションの48時間後、ピペットを用いてレトロウイルスを含む上清を単一の50 milliliterコニカルチューブに移し、4 °Cで一晩保存します。その後、新しい加温済み培地10 millilitersをプレートの壁面に沿って加え、培養物をインキュベーターに戻します。トランスフェクションから60時間後に、2回目のレトロウイルスを回収します。これを48時間後に回収したレトロウイルスと混合します。上清を遠心分離して細胞残渣を除去し、レトロウイルスを新しい50 milliliterチューブに移します。次に、C2C12細胞培養の各ウェルを室温のPPS 3 millilitersで洗浄し、続いて0.25% trypsin EDTA 500 micro litersを加え、37 degrees Celsiusで5分間インキュベートします。細胞が剥離したら、各ウェルに3 mLの増殖培地を加えて反応を中和し、培養液を6〜8回ピペッティングして細胞を単一細胞懸濁液に分散させます。細胞数を算出した後、8 × 10⁵個の細胞を60 mmプレートに加え、3 mLの増殖培地を添加します。次に、0.5 mLのレトロウイルスを細胞に感染させ、プレートをインキュベーターに戻して48時間培養します。2日後、適切な選択用抗生物質を添加した新鮮な増殖培地3 mLを毎日5日間、細胞に加えてください。これは、非導入のC2C12コントロール培養液に生存細胞がなくなるまで行います。C2C12細胞のレンチウイルス導入のため、バイオセーフティーレベル2キャビネット内で、4×10⁶個の293T細胞をHEK293細胞培養培地を用いて100 mmプレートに播種します。翌日、レンチウイルスパッケージングベクターを、1 mLの無血清細胞培養培地中で、8 µgの適切なレンチウイルス転移ベクターと混合します。混合液を短時間ボルテックスし、あらかじめ温めておいたトランスフェクション試薬を36 µL加えます。その後、培地をさらに30秒間ボルテックスし、混合液を室温で30分間インキュベートします。インキュベーションの終了後、トランスフェクション混合液を293T細胞に添加し、プレートを軽く回して混ぜ合わせ、細胞をインキュベーターに戻します。24時間後、トランスフェクション混合液を10 millilitersの新鮮な培地に交換します。48時間後、レンチウイルスを含む上清を50 milliliterコニカルチューブに移して4 °Cで保存し、プレートに10 millilitersの新鮮で温めた培地を添加します。60時間後、2回目の上清を48時間目に回収したレンチウイルスとまとめ、遠心分離して細胞残渣を除去します。次に、先ほど示したように60 mmプレートに播種し、コンフルエンシーが30〜40%であるC2C12 CUG200細胞の培養液に、レンチウイルスを0.5 mL添加します。トランスフェクションの72時間後、レンチウイルスを含む上清を、適切な選択用抗生物質を添加した新鮮な培地に交換します。非導入のC2C12 CUG200コントロール細胞がすべて死滅するまで、新鮮な選択用抗生物質を添加した培地を用いて、5日間毎日培地を交換します。薬剤耐性選択後、分化した筋芽細胞のGFP発現および筋管形成をマノフルオレッセンス解析により評価できます。この代表的な実験における筋管形成の定量化により、融合指数および筋管面積が、異常なCUG伸長およびGFP CUG 200導入細胞によって有意に低下することが示されています。Celf1のアップレギュレーションは、筋ジストロフィー1型におけるCUGリピート伸長とも関連しています。さらに、ウェスタンブロッティングにより、CUGリピート伸長に伴いCelf1タンパク質レベルが上昇し、分化過程においてMyoD、MyoG、およびMef2Cの発現が抑制されることが一貫して示されています。このことは、CUGリピート伸長が筋管の欠陥と筋芽細胞分化の障害を誘発することを示唆しています。ウェスタンブロット解析により、FLAGタグ付きCelf1がレトロウイルスベクター導入培養細胞のみに存在すること、およびこれらの培養細胞においてその発現が上昇していることが明らかになりました。実際、コントロール群の培養細胞と比較して、Celf1過剰発現細胞では筋管形成が稀にしか見られませんでした。このことは、Celf1の過剰発現が筋芽細胞の分化を著しく阻害することを示唆しています。さらに、Celf1短鎖ヘアピンRNAの存在下では、内因性Celf1タンパク質のレベルおよび二重抗生物質選択されたレンチウイルスベクター導入GFP CUG 200細胞が著しく減少します。これらの培養細胞では、筋管形成の回復に伴い、筋管融合指数および筋管面積が観察されました。一方、リアルタイムRT-PCRの結果から、Celf1短鎖ヘアピンRNA発現細胞においてMyoD、MyoG、およびMef2Cの発現が有意に増加していることが示唆され、Celf1ノックダウンがこれらの培養細胞における筋細胞分化不全を回復させた可能性を支持しています。本手順を行う際は、C2C12細胞の密度が70%コンフルエンス以下に保たれているかを確認することが重要です。細胞へのトランスフェクション後、細胞毒性をモニタリングしながら、血清不含培地で少なくとも4時間、最大12時間まで処理してください。プラスミドのトランスフェクション、レトロウイルスおよびレンチウイルスのトランスダクションを用いることで、筋強直性ジストロフィーの細胞モデルの構築に成功しました。これにより、本疾患およびその他の筋疾患の研究に寄与することが期待されます。

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学ぶC2C12筋芽細胞を用いた筋強直性ジストロフィー1のモデル化手法。遺伝子導入と分化誘導により病態メカニズムを解明し、筋疾患治療研究への応用が期待されます。

C2C12筋芽細胞における筋強直性ジストロフィー1のモデル化

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