後根神経節ニューロンのアライメントや髄鞘形成を強化するためのアプローチ

このプロトコルの全体的な目標は、静的で事前に伸ばされた細胞培養システムを使用して、後根神経節ニューロンの軸索の整列と髄鞘形成を強化することです。この方法は、軸索の整列や厚さの成長など、神経組織工学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、このプレストレッチ法が軸索の整列を強化するだけでなく、髄鞘形成も促進することです。

この手順を開始するには、塩基と硬化剤の混合物を組織培養皿に注ぎます。ゲル混合物を真空下で20分間保持し、気泡を取り除きます。次に、ゲル混合物を摂氏60度のオーブンに入れて一晩硬化させます。

PDMSメンブレンが硬化した後、プラズマ洗浄およびエッチングシステムで表面を酸素プラズマで3分間処理します。次に、皿から長方形の膜を切り取ります。酸素処理面を上にしてストレッチフレームに固定します。

次に、フレームをストレッチステージに置き、ステージのノブを回して、長い軸の伸びが10%に達するまで均等にストレッチします。次に、フレームのネジを締めてストレッチを固定します。その後、フレームをステージから取り外します。

メンブレンの表面が乾燥していてほこりがないことを確認してから、シリコンチャンバーをメンブレンに配置します。チャンバーの粘着性のある面がメンブレンにしっかりと付着するのを待ちます。次に、表面をUVで10分間滅菌します。

その後、プラズマ処理後6時間以内にチャンバー内のPDMS表面に1ミリリットルのPLLを追加します。次に、DRGニューロンを播種する前に、摂氏37度で2時間インキュベートして細胞接着を促進します。このステップでは、DRGニューロン用の標準増殖培地を準備します。

単離の前に、単離装置とフィルター試薬をオートクレーブします。5ミリリットルのアイソレーションバッファーを6ウェルプレートの1ウェルに加え、プレートを氷の上に置きます。次に、0.05%トリプシン-EDTAの9ミリリットルに1ミリリットルのコラゲナーゼAを添加して、10ミリリットルの解離培地を調製します。

0.22マイクロメートルのフィルターで溶液をろ過し、氷の上に置きます。その後、生後5〜7日齢のSDラットを10〜12匹生け贄に捧げ、それぞれの背中から脊髄を覆う皮膚を切り取ります。脊椎の周りの余分な組織をすべて取り除きます。

外科用拡大鏡の下で、首から最初の切開を行い、次にハサミで両側の脊椎に沿って1つ切り込みを入れます。子犬の体から背骨を切り離し、余分な筋肉を取り除きます。次に、脊椎の長軸に沿って切断し、ピンセットを使用して脊椎を完全に開き、脊髄を取り出します。

次に、骨ポケットから神経節を取り出します。神経根をトリミングし、神経節を氷冷分離バッファーに移します。両側から約10〜16個のDRGを収集します。

残りの子犬についても解剖手順を繰り返します。次に、分離バッファーを含むDRGを滅菌済みの15ミリリットルチューブに移します。組織をチューブの底に沈殿させ、上部の分離バッファーを静かに取り除きます。

次に、10ミリリットルの解離媒体をチューブに加えます。解剖した組織を解離培地で37°Cの水浴中で1時間インキュベートし、チューブを5〜10分ごとに振とうします。化学的解離後、神経節を摂氏4度で5分間遠心分離します。

5分後、上清を取り除き、ペレットを10ミリリットルの標準成長培地に再懸濁し、ボルテックスします。続いて、解離した細胞をもう一度遠心分離します。次に、上清を取り除き、ペレットを12ミリリットルの標準成長培地に再懸濁し、ボルテックスします。

細胞を播種する前に、PLL溶液をチャンバーから取り出します。PDMS表面を滅菌水ですすぎ、風乾します。細胞を再懸濁した後、懸濁液を1〜2分間放置して、破片がチューブの底に沈殿するのを待ちます。

次に、1.5ミリリットルの細胞懸濁液を各ストレッチチャンバーに加え、摂氏37度で5%CO2でインキュベートします。in vitroで1日でグリア細胞を除去するには、各ウェルに10マイクロリットルまたは15マイクロリットルのFDU-U混合ストック溶液を追加します。7時間後、この培地を新鮮な標準増殖培地と交換し、事前に伸ばした培養装置を5%CO2の摂氏37度のインキュベーターに置きます。

細胞培養期間中は、使用済みの培地の半分を新鮮な培地と交換することにより、2日ごとに培地を交換してください。この手順では、シュワン細胞から培地を取り出し、フラスコに0.05%トリプシン-EDTAの5ミリリットルを加えます。細胞を摂氏37度で5%CO2中で2〜3分間インキュベー

10倍対物レンズを使用して光学顕微鏡で細胞をチェックし、フラスコから浮き上がるかどうかを確認します。次に、フラスコ内の細胞に5ミリリットルの培地を加えて混合します。続いて、細胞懸濁液を15ミリリットルの遠心チューブに加え、摂氏20度で5分間遠心分離します。

次に、上清を取り除き、ペレットを7ミリリットルの標準的なDRG成長培地に再懸濁します。これに続いて、細胞懸濁液の10マイクロリットルを0.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。10マイクロリットルのトリパンブルーと混合し、10倍対物レンズを使用して血球計算盤で細胞数をカウントします。

DRG増殖培地を添加して、細胞懸濁液をミリリットルあたり5, 000細胞に希釈します。次に、延伸チャンバー内のDRG培養物から0.5ミリリットルの培地を取り出し、0.5ミリリットルのシュワン細胞懸濁液をDRG培養物に加えます。細胞を摂氏37度で5%CO2中で1週間培養します。

使用済みの培地の半分を新鮮な標準成長培地に交換することにより、2日ごとに培地を交換します。伸ばした表面と伸ばさなかった表面で2週間培養した後、精製したシュワン細胞をチャンバーに加え、さらに1週間培養しました。ここに示されているのは、伸張表面の軸索のβ-IIIチューブリン染色です。

そして、これは伸張した表面にβ-IIIチューブリンとP0染色が重なったことを示しており、シュワン細胞が軸索に付着し、髄鞘を形成している可能性が高いことを示唆しています。この画像は、伸張されていない表面の軸索のβ-IIIチューブリン染色を示しています。また、伸張されていない表面にβ-IIIチューブリンとP0染色が重なったことから、シュワン細胞が軸索に付着していないことが示唆されます。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば3〜4時間で完了します。この手順を試行する際は、PDMSメンブレムを平らで均一な厚さに保つことを忘れないでください。この手順に続いて、軸索レンズやシュワン細胞の遊走などの追加の質問に答えるために、事前に引き伸ばされたマイクロチャネルのようなアトマイザーを実行できます。

この技術の開発後、この技術は、組織工学の分野の研究者が脊髄および坐骨神経の神経再生に対する表面異方性の役割を探求する道を開くでしょう。このビデオを見た後、事前に伸ばしたデバイスを使用して軸索の整列と髄鞘形成を誘導する方法を十分に理解しているはずです。