ストライプアッセイは、解離海馬ニューロンを用いたタンパク質基質の魅力や反発作用を検討します

ストライプアッセイの全体的な目的は、ガイダンス分子などの特定のタンパク質が、ニューロンを誘引または反発させる能力を評価することです。この手法は、ニューロンが外部の細胞環境に反応してどのように遊走し、あるいは軸索を伸展させるかといった、軸索ガイダンス分野における重要な疑問を解明するのに役立ちます。この技術の主な利点は、一度の実験で多数のニューロンを可視化でき、多くの成長円錐を同時に解析できることです。

準備として、4〜8個のシリコンマトリックスを水で5分間煮沸します。その後、ストライプ側を上にして、ラミナーフローフード内で完全に自然乾燥させます。これには約1時間かかります。

引き続きフード内で作業を行います。圧縮空気または粘着テープを使用して、マトリックスのストライプ側にあるほこりを除去します。その後、各マトリックスをストライプ側を下にして、個別の6 cmプラスチック製ディッシュに慎重に配置します。

指一本で、各マトリックスをしっかりと押し付けます。マトリックスとディッシュの間に気泡が入らないようにしてください。マトリックスが接着しない場合は、この手順を繰り返します。

接着後、培養皿の底面にストライプの位置をマークします。PBSを用いて蛍光ラベル化リコンビナントタンパク質を調製します。ストライプを引いた皿1枚につき25 µLずつ調製してください。

混合物を室温で30分間インキュベートします。次に、各ディッシュについて、22ゲージのシリンジに25 µLの希釈タンパク質を充填し、マトリックス側面の小さな穴から注入します。気泡がマトリックス内に注入されると、タンパク質とディッシュの結合が妨げられるため、気泡が入らないように注意してください。

次に、ディッシュを細胞培養インキュベーター内で37 °Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、各マトリックスの上部スリットに300 µLのPBSを注入します。その後、各マトリックスの側面にある小さな穴からPBSを吸引し、未吸着の組み換えタンパク質をすべて除去します。

タンパク質が乾燥するため、PBSを完全に吸引しないでください。このPBSによる洗浄を計3回行います。次に、各ディッシュからマトリックスを慎重に除去します。

その後、ストライプ状に塗布した領域全体にコントロールタンパク質を約100 µL直ちに添加し、各ディッシュに交互のコーティングを作成します。次に、ディッシュを37 °Cで30分間インキュベートします。その間、氷上でラミニンとPBSを20 µg/mLに調整して解凍します。

30分後、ディッシュをPBSで3回洗浄します。次に、各ディッシュに冷えたラミニンを約100 microlitersずつコーティングし、さらに1時間インキュベーターに戻します。1時間後、再びPBSを用いてディッシュを3回洗浄します。

3回目の洗浄後、各ディッシュに約150 µLの培地を加えます。その後、次に使用するまで、ディッシュを37 °C、5% CO2インキュベーター内でインキュベートします。ドナーとなるE15.5マウスを安楽死させた後、外科用ハサミを用いて頭部正中線で皮膚と頭蓋骨を矢状方向に切開し、マイクロスパチュラを用いて脳を回収します。

脳を、3 mLのHBSSを入れた60 mLのペトリ皿に慎重に移動させます。皿の中で、メスを用いて皮質、海馬、および線条体を含む脳半球を切り出します。その後、髄膜を慎重に取り除き、海馬領域を解剖します。

摘出した海馬組織を、氷上の2 mLのHBSS溶液が入った15 mL遠心チューブに移します。8枚のディッシュでニューロンを培養する場合、3個の胚から得られる6個の海馬で十分です。すべての海馬組織を回収した後、HBSSを吸引して除去し、2 mLのtrypsin-EDTAに交換します。

その後、チューブを37 °Cの恒温水槽で15分間インキュベートします。次に、500 µLの胎児牛血清を添加してトリプシンの活性を中和します。その後、混合液を100 ×gで5分間遠心分離します。

上清を除去し、2 mLの培地でペレットを洗浄します。その後、混合物を再度遠心分離し、培地を新しいものに交換します。次に、先端を切断した1 mLピペットチップを用いて、緩やかなトリチュレーションにより組織を分散させます。

組織をパイプヘッドチップで10回ほど上下にピペッティングします。次に、カットしていない1 mLチップを使用してトリチュレーションを繰り返し、単一細胞懸濁液を得ます。その後、懸濁液を80～100 µmのメッシュセルストレーナーに通して、単一細胞を分離します。

次に、ろ過した懸濁液を150 Gで5分間遠心分離し、上清を吸引除去して、ペレットを2 mLの培地で再懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測し、150 µLの培地に懸濁した10,000個のニューロンを、準備した各ストライププレートに播種します。ストライプ領域全体を覆うように、懸濁液を注意深く滴下してください。

E15.5マウス由来の解離海馬ニューロンを、蛍光標識したコントロールタンパク質FCのストライプ上、またはFLRT2 FCと非標識コントロールFCが交互に配置されたストライプ上に播種し、24時間培養した。どちらの場合においても、ニューロンは凝集し、軸索を束状に伸展させた。FCコントロールでは、ニューロンは均一に分布し、軸索をランダムな方向に伸展させた。対照的に、FLRT2 FCストライプで培養した場合、軸索はFLRT2 FC領域への伸展を回避した。

このように、伸展する軸索は主にFCストライプ上で成長しました。高倍率で観察すると、軸索はFLRT2 FCストライプの境界に沿って成長していますが、FLRT2領域内には伸展していないことがわかります。このビデオを視聴することで、推奨されるタンパク質のストライプパターンを作成する方法と、解離 hippocampal neurons を用いて誘引または反発活性を評価する方法について、十分に理解できたはずです。

この手法を習得し、適切に実施すれば、5時間で完了させることができます。