中に組み込み血管新生による組織工学インビボティッシュ・エンジニアリング商工会議所
2016年5月30日
これは、組織工学チャンバー内の顕微動動静脈ループまたはフロースルー椎弓根構成を使用して、in vivo血管新生組織を構築するためのガイドラインです。生成された血管新生組織は、臓器の再生や組織欠損の置換、薬物試験や疾患モデリングに利用できます。
この手順の全体的な目標は、組織が成長し、強力な血液供給の発達と同時に拡大できる空間を作り出すことであり、最終的には血管新生された大きな3次元組織ブロックの生成につながります。この方法は、再建目的だけでなく、臓器の置換と修復のための血管新生組織のエンジニアリングにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、新しく生成された組織が、生存のために環境からの拡散に頼ることなく、それ自体の血管ネットワークによって本質的に供給されることです。
手順を実演するのは、Sue McKayとLiliana Pepeです。体重250グラム以上のラットに麻酔をかけ、つま先をつまんで麻酔の深さを評価します。ラットが反応しない場合は、手順全体を通して2%イソフルランを使用して鎮静を維持します。.
次に、エプソミック軟膏を目に塗ります。次に、ラットの仰臥位で、電気カミソリを使用して鼠径部を剃り、湿らせたガーゼで毛を取り除きます。次に、70%エタノールを含むクロルヘキシジン溶液で手術部位を洗浄します。
最後に、動物を滅菌タオルで覆い、手術を進めます。15番のブレードを使用して、鼠径靭帯と平行に左鼠径部に4センチの長さの皮膚切開を行います。次に、露出した鼠径部脂肪パッドをハサミで円周方向に切り取り、上腹部血管に基づいて血管茎に付着したままにします。
次に、マイクロハサミを使用して、腹壁とその下にある大腿骨血管との間のフィルム状の結合組織の癒着を解放します。次に、リトラクターを腹壁に置き、内側に引っ張って鼠径靭帯と大腿骨血管の全長を露出させます。次に、マイクロ鉗子と湾曲ハサミを使用して、上腹部静脈を解剖し、周囲の脂肪から分離します。
この静脈はテザーとして機能します。大腿骨血管と神経を含む血管周囲シースを開いて進めます。鼠径靭帯から上腹部枝の遠位への分岐部まで、それを完全に開きます。
この時点で、そして全手順を通じて、大腿骨血管を優しく取り扱うことが重要です。それらの損傷は、血栓症や実験全体の失敗につながる可能性があります。次に、マイクロ鉗子を使用して、大腿静脈をその外気部で拾い上げ、周囲の組織や付随する動脈から穏やかに分離します。
このステップでは、静脈壁の全厚を把握しないでください。これは、内膜に外傷を引き起こし、静脈が血栓症になりやすくなります。また、このステップでは、側枝を10-0ナイロン縫合糸で結紮するか、バイポーラ凝固器で凝固させます。大腿静脈が完全に自由になった状態で、4-0シルク縫合糸で近位および遠位に結紮して、上腹部枝の約半センチメートルの長さを含む少なくとも10ミリメートルの長さの静脈グラフトを得る。
この枝は、チャンバー内でループを開いたままにするためのガイロープテザーとして機能します。次に、グラフトの端から外膜を切り取ります。必要に応じて、このステップは顕微手術の吻合前に延期することができます。
静脈グラフトをヘパリン化生理食塩水で洗い流し、ヘパリン化生理食塩水をロードして休ませることにより、静脈グラフトの準備を完了します。次に、連続ランニング4-0シルク縫合糸と2つまたは3つの追加の単純な中断ステッチを使用して傷を閉じます。まず、前に示したように、鼠径靭帯と反対側の四肢の大腿骨血管の全長を露出させます。
次に、マイクロ鉗子を使用して、上腹部動脈と静脈の両方を解剖し、周囲の脂肪パッドから分離します。組織を血管から引き離すときは優しくしてください。大腿動脈をその外膜によって拾い上げ、周囲の組織から解放することによって続けて
。このプロセスでは、動脈側枝を結紮または凝固させます。次に、大腿動脈と静脈の両方に近位にクランプを配置します。次に、4-0シルク縫合糸を使用して、大腿動脈と上腹部血管の出現から遠位の静脈を結紮します。
次に、滅菌プラスチックのコントラスト背景を容器の下に置き、鋭利でまっすぐなマイクロハサミを使用して各血管を横方向に切断します。切断したら、内腔からすべての血液が除去されるまで、ヘパリン化生理食塩水をたっぷりと含んで血管を激しく洗い流します。次に、静脈グラフトを手術野に持ち込みます。
静脈グラフトの近位端がレシピエントの大腿静脈に吻合され、遠位端がレシピエントの大腿動脈に吻合される準備ができるように、静脈グラフトを配置します。これにより、血液は静脈グラフト内の弁からの抵抗なしに動脈側から静脈側に流れることができます。大腿骨血管と静脈移植片がねじれなく自然な位置に静止していることを確認してください。
10-0ナイロン縫合糸を使用して、両側で外科的吻合を行います。良好で非外傷性の顕微手術吻合が鍵となります。血管の内膜の損傷、血管の乾燥、または誤って配置された縫合により、吻合部は血栓形成されやすくなります。
次に、両方の吻合部位に漏れがないか確認します。吻合部から脈動していない血液が出ているように見える小さな漏れを、脂肪の小さな片またはスポンジを上に置き、5〜10分間穏やかに圧縮することで解決します。フィールド全体に急速に氾濫する大きな脈動性の漏れは、追加のステッチが必要になります。
次に、動静脈ループの開存性を確認します。大腿動脈を穏やかに閉塞すると、大腿動脈が収縮するはずです。逆に、大腿静脈の閉塞はループを充血させるはずです。
次に、組織工学チャンバーの基部を動静脈ループの下に置きます。ループがねじれやねじれのない自然な位置に静止していることを確認してください。次に、6-0ナイロン縫合糸で、チャンバーの基部を鼠径靭帯とその下の筋筋膜に固定します。
次に、チャンバーの底面に蓋をかぶせます。蓋の下の上腹部の枝をつまんで、ループを所定の位置に保持します。次に、連続ランニング4-0シルク縫合糸に加えて、2つまたは3つの単純な中断ステッチを使用して傷を閉じます。
最後に、動物が個々のケージで麻酔から回復するのを許し、鎮痛剤としてカルプロフェンを単回投与して皮下投与します。以前と同様に動物を手術のために準備します。1匹のラットに、各鼠径部に1つずつ、2つのチャンバーを埋め込むことができます。
次に、前述のように大腿骨血管を分離します。動脈と静脈の両方が周囲の組織から完全に解放され、それらの枝が結紮された状態で、チャンバーを手術野に持ち込みます。次に、無傷の大腿骨血管をそれぞれチャンバーベースの対応するスリットに配置します。
どちらもねじれたりねじれたりしていないことを確認してください。次に、蓋をベースに取り付けてチャンバーを閉じます。次に、傷口を閉じ、前述のように動物が回復するのを待ちます。
組織工学チャンバーの顕微手術的作成は、記載されているように行われました。in vivo血管新生チャンバーを使用して、新生児ラット心筋細胞を含む心臓組織、ラット骨格筋芽細胞を含む筋肉組織、脂肪組織細胞外マトリックスに由来するハイドロゲルを含む脂肪組織など、さまざまな組織タイプを成功裏に操作しました。このステレオロジーシステムにより、特定の組織体積を偏りなく定量化することができます。
例えば、レクチン染色された内皮細胞を横断面で使用して、血管容積を推定しました。蛍光色素で標識した細胞をin vivoに移植した後、その運命を追跡することができます。例えば、色素iで標識された新生児ラット心筋細胞は、移植後3日後に組織構築物中に検出されました。
あるいは、種特異的抗体を使用して、ゼノトランスプレーネーション研究で移植された細胞を同定することもできます。例えば、免疫不全ラットに移植されたヒト誘導多能性幹細胞は、チャンバーから採取した組織で同定できる可能性があります。マスターすると、フロースルーチャンバーと動静脈ループは、それぞれ約20分と90分で埋め込むことができます。
この手順を試行する間は、常に無菌性を維持し、汚染が発生した場合に必要な措置を講じることが重要です。血管の優しい取り扱いと非外傷性の顕微手術吻合が成功を確実にするための鍵であることを忘れないでください。この意味で、この手順を試みる前に、特に動静脈ループの構築について、基本的な顕微手術のトレーニングをお勧めします。
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概要
本ガイドラインでは、マイクロサージャリーによる動静脈ループまたはフロースルーペディクル構成を用いて、生体内で血管化組織を構築する手順について概説します。作製された血管化組織は、臓器再生、組織欠損の置換、薬剤試験、および疾患モデリングに利用可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 組織工学
- 血管生物学
- 再生医療
背景
- 本手順は、強固な血液供給を伴う組織成長のための空間を構築することを目的としています。
- 再建目的の血管新生組織工学における重要な課題に対処します。
- 本手法により、独自の血管ネットワークを持つ組織の生成が可能になります。
- この方法は、臓器の置換および修復において極めて重要です。
研究目的
- 血管化組織を作製するための手法を開発すること。
- 臓器再生のための組織工学に関する理解を深めること。
- 薬剤試験および疾患モデリングのための信頼性の高いモデルを提供すること。
使用した手法
- 体重250g以上のラットの麻酔。
- 足指つまみ法による麻酔深度の評価。
- 処置中の2%イソフルランによる鎮静維持。
- Sue McKayおよびLiliana Pepeによる手順のデモンストレーション。
主な結果
- 血管化された三次元組織ブロックの作製に成功した。
- 作製された組織における固有の血管供給を実証した。
- 臓器再生および組織修復への応用の可能性。
- 血管化組織のエンジニアリングに関する知見を得た。
結論
- この手順により、血管化組織を効果的に生成できます。
- これは、組織工学における今後の研究の基礎となります。
- この手法は、再生医療への応用が期待されます。
よくある質問
産業における重要性
このin vivo血管化組織工学チャンバーモデルは、再建医学における重大なボトルネックである、信頼性の高い血管化組織代替体の不足という課題を解決します。保護されたチャンバー内で固有の血管ネットワーク形成を可能にすることで、拡散制限を克服した三次元的な灌流組織ブロックの作製をサポートします。この機能により、前臨床の組織工学戦略における予測の信頼性が向上し、血管新生に依存する治療アプローチのリスク軽減が促進されます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 生理学的に適切な環境において、血管新生の出芽および血管統合メカニズムの解析を可能にする。
- 運用的価値： 血管新生および組織成熟経路に関与するターゲットを検証するための、再現可能なin vivoモデルを提供する。
- 科学的価値： 組織特異性と生存に対する外来細胞またはマトリックスの寄与の評価をサポートし、再生医療アプローチにおけるターゲットの信頼性向上に寄与する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：血管新生、灌流、および組織統合に対する化合物の影響を評価するのに適した血管化組織床を構築できる。
- 運用的価値：レクチン染色やステレオロジーによる血管体積などの定量的な出力を得ることができ、標準化されたアッセイの読み取りが可能となる。
- 科学的価値：蛍光ラベルや種特異的抗体を用いて移植細胞の運命を追跡でき、生着と生存に関するメカニズムのスクリーニングをサポートする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：宿主のような組織構造を模倣した線維血管組織を生成することにより、発見から前臨床検証までの橋渡しをします。
- 運用上の価値：免疫能を有するモデルまたは免疫不全モデルにおける、組織の発達および血管安定性の経時的な評価を可能にします。
- 科学的価値：外来細胞やマトリックスの移植と組み合わせることで、組織特異的な分化（例：心臓、脂肪、肝臓）の評価をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
このチャンバーモデルは、発見から前臨床への連続的なプロセスに適合しており、特に血流供給形成の早期検証が極めて重要となる血管新生依存的な組織工学戦略に適しています。
- 基盤生物学研究：制御されたin vivo環境において、血管新生の駆動因子や虚血・炎症性細胞の動員に関する仮説検証を容易にします。
- スクリーニング：標準化された灌流組織構築物を提供し、血管新生または血管形成活性に関する信頼性の高い化合物スクリーニングを可能にします。
- 解析：血管容積、組織組成、および移植細胞のトラッキングを含む定量的エンドポイントを提供し、条件間の比較分析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：構築組織の形成から、構造的および機能的な成熟に関する前臨床評価までの一貫した流れを実現します。
- 汎用的な再利用：複数の組織タイプや治療領域にわたって血管化組織を生成するための、再利用可能な外科的プラットフォームとなります。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 内在的な血管新生を伴う組織を生成することで予測の信頼性を高め、外因性の灌流戦略への依存度を低減します。
- 運用上の価値： 定義された所要時間（20–90分）を持つ標準化されたマイクロサージャリープロトコルを提供し、研究室間での手順の一貫性をサポートします。
- 戦略的価値： 開発の早期段階で血管統合を検証することにより、組織工学プログラムにおけるgo/no-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響： 再現性のあるチャンバーベースの結果に基づき、血管化組織構築物のリスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の留意点
- 微小外科的手技、特に血管の剥離および吻合に関する専門知識が必要です。
- マイクロ鉗子、マイクロ剪刀、血管リトラクターなどの特殊な器具に依存します。
- 血栓症や感染を防ぐため、無菌的な手術条件および術後のモニタリングが不可欠です。
- 鎮痛剤の投与や、シングルまたはデュアルチャンバーの植込み能を含む、動物のハンドリングおよび回復プロトコルを伴います。
- 血栓症を回避し、ループの開通性を確保するためには、愛護的な血管操作と非外傷的な吻合が成功の鍵となります。
