Name: 中に組み込み血管新生による組織工学インビボティッシュ・エンジニアリング商工会議所 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 学ぶ 動静脈ループを用いた組織工学チャンバーの作製法。ラットを用いて血管化組織を作製し、再生医療や臓器再生、薬物スクリーニングへの応用を探索する。

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この作品は、NHMRCとスタッフォード・フォックス医療財団からの助成金によってサポートされていました。著者はスー・マッケイ、リリアナペペ、アンナDeftereosと実験的医療や外科ユニットのアマンダRixon、セントビンセント病院、メルボルンの外科的な支援を認めます。サポートはまた、ビクトリア朝の州政府のイノベーション省、産業と地域開発の運用インフラ支援プログラムによって提供されています。

ここで説明するプロトコルは、セントビンセント病院メルボルン、オーストラリアの動物倫理委員会によって承認されており、オーストラリア国立保健医療研究評議会のガイドラインに厳守下で行いました。 注：二室プロトコールを以下に記載します。 2つの異なるモデルおよびその特定のチャンバ設計は、 図1に示されている。チャンバは、（1）（ラット動静脈ループ室モデルの場合）、ポリカーボネートで作られています。これは、内径13ミリメートル、高さ4ミリメートルを有する円筒形です。壁内の1つのポイントでウィンドウが椎弓根のために妨げられることなくアクセスすることができます。 （ラットのフロースルー茎室モデルの）第2のモデルでは、チャンバは、アクリル製の矩形（10×4×8 mm 3で内部寸法）です。それは、チャンバを犯すように大腿動脈および静脈に適応するように両側に2つの1.5ミリメートルの開口部を有します。 1.ラット動静脈ループ商工モデル（Oneチャム動物当たりBER） 注：手術を開始する前に、すべての機器が適切に滅菌されていることを確認してください。同様に、滅菌タオル上の機器の残りを確保し、手続き中の汚染を避けるために、手術野から合理的な距離にあります。 <ol><li>手術のための動物の準備<ol><li>動静脈ループを作成するための血管のサイズが大きいために、少なくとも250gのラットを使用してください。 </li><li> 4％のイソフルラン吸入で動物をAnaesthetize。つま先ピンチに無応答性を評価することによって麻酔の十分な深さを裏付けます。麻酔した後、適切に2％イソフルランと手順を通して麻酔動物を維持します。 </li><li>温暖化パッド上に仰臥位で動物を置き、手術中の乾燥を防ぐために、目に無菌潤滑剤を適用します。 </li><li>電気かみそりを使用して、両方の股間を剃ると湿ったガーゼで髪を削除します。 </li><li>クロルヘキシジンと手術部位をPREP/ 70％エタノール溶液および無菌タオルで動物をドレープ。鎮痛剤としてカルプロフェン（5 mgの/ kgを皮下）の単回投与を管理します。 </li></ol></li><li>大腿静脈グラフトの収穫<ol><li> ＃15ブレードを使用して、鼠径靱帯に左鼠径部に平行に長さ4cmの皮膚切開を行います。これは、鼠径部脂肪パッドを露出させます。 </li><li>上腹部管に基づいて、その血管茎に取り付けられ、それを残してはさみで円周方向に脂肪パッドを通してカット。 </li><li>マイクロはさみを使用して、腹壁とその下にある大腿血管の間にフィルム状の結合組織の癒着を解放します。 </li><li>腹壁に開創器を置き、内側引き出します。これは、鼠径靱帯と大腿血管の全長を公開しています。 </li><li>マイクロ鉗子を使用し、湾曲したハサミを静かに引っ張り、切断によって上腹部静脈を分析し、その周囲の脂肪からそれを分離します。ループを構築するときに、この静脈は、テザーとして機能します。 </li><li> Usinグラムマイクロ鉗子湾曲マイクロハサミは大腿血管や神経の心窩部支店への分岐末端に鼠径靭帯からのすべての方法を含む血管周囲鞘を開きます。 </li><li>マイクロ鉗子を使用して、その外膜によって大腿静脈をピックアップし、静かに周囲の組織および添付動脈からそれを分離します。離れて組織を引っ張り、それを介して切断することにより、マイクロ鉗子湾曲ラウンド尖ったマイクロハサミでこれを行います。 注：これは血栓症の脆弱性が発生内膜への外傷を引き起こす可能性があるとして、静脈壁の全体の厚さをつかむことはありません。 </li><li>ライゲーション側枝は10/0ナイロン縫合糸で切開中に発見されたまたはバイポーラ凝固でそれらを凝固します。 </li><li>大腿静脈完全に無料で、4/0シルク縫合糸で、その近位端および遠位端を連結。少なくとも10ミリメートルの長さの静脈グラフトを取得することを確認しますと、男のロープのテザーとして使用する上腹部の枝の約0.5センチメートル長を含みますチャンバー内の開ループを保持します。 </li><li>マイクロ鉗子とストレートマイクロはさみを使用して、静かに引き出し、切断することにより、移植片の端部から外膜をトリミングします。これはまた、顕微吻合前に、後に行うことができます。 </li><li>ヘパリン添加生理食塩水（ヘパリンの10 U / ml）で静脈グラフトをフラッシュし、溶液中で休むようにそれを残します。連続走行4/0絹縫合糸と2つまたは3つの追加の簡単な中断されたステッチを使用して傷を閉じます。 </li></ol></li><li>商工会議所の動静脈ループと移植の作成<ol><li>繰り返しは、対側肢にまったく同じ方法で、1.2.4に1.2.1を繰り返します。 </li><li>マイクロ鉗子を使用して、上腹部動脈と静脈の両方を分析し、単離周囲の脂肪パッドを形成します。静かに血管から組織を引っ張ることによってこれを行います</li><li>マイクロ鉗子を使用して、その外膜により大腿動脈をピックアップし、周囲の組織からそれを解放します。マイクロ鉗子湾曲ラウンド尖ったマイクでこれを行います離れて組織を引っ張り、それを切断することにより、roのはさみ。その側枝を結紮または凝固。 </li><li> 4/0絹縫合糸を用いて、上腹部管の出現に大腿動脈と静脈の先端を連結。 </li><li>大腿動脈と静脈のそれぞれの近位に単一のクランプを置きます。鋭いストレートマイクロはさみを使用して、上腹部枝の出現に各容器の先端でクリーンな横カットを行います。船の下の滅菌プラスチックコントラストの背景を配置します。 </li><li>すべての血液が内腔から除去されるまで、ヘパリン化生理食塩水の寛大な量と激しく血管をフラッシュします。 </li><li>術野に静脈グラフトを持参し、必要に応じて、ステップ1.2.10に従って船 &#39;末端から任意の冗長な外膜を除去します。 </li><li> 10/0ナイロン縫合糸と顕微吻合の両方を実行します。大腿静脈と大腿動脈への遠位端部に静脈グラフトの近位端を吻合。これがf血液が流れるようになります静脈グラフトの内側バルブから抵抗なく静脈側への動脈をROM。 注：任意のねじれずに大腿血管とその自然な位置にある静脈グラフトの残りの部分を確認してください。 </li><li>両方の吻合部に漏れがないか確認してください。上に脂肪の小片を置き、静かに5〜10分間圧縮することにより、吻合部位から出てくる非脈動血のように見える小さな漏れを解決します。急速にフィールド全体をあふれさせるより大きな脈動漏れが追加ステッチが必要になります。 </li><li>動静脈ループの開存性を確認してください。大腿動脈の穏やかな閉塞は、大腿静脈内の同じがそれをガブガブ飲むべきである、それが縮小する必要があります。 </li><li>ねじれやよじれのないその自然な位置にある後者の休息と動静脈ループの下に組織工学室のベースを置きます。 </li><li> 6/0ナイロン縫合糸で鼠径靭帯およびその下の筋筋膜に、チャンバのベースを固定します。 </li><li>上に蓋を置きベース大腿血管は、ノッチ（室側の窓）を通ってチャンバに入るようにします。蓋を閉じたとき、それはテザーを所定の位置に動静脈ループを保持するように作用チャンバーベースと蓋との間で、心窩部枝をキャッチしていることを確認します。 </li><li>連続走行4/0絹縫合糸と2つまたは3つの追加の簡単な中断されたステッチを使用して傷を閉じます。 </li><li>動物は加温パッド上で麻酔から回復することを可能にします。 </li><li>それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。同様に、完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返しません。 24時間後、鎮痛剤としてカルプロフェン（皮下5ミリグラム/キログラム）の別の単一用量を投与。 </li><li> 5日間のための局所抗生物質軟膏で傷口を扱います。傷口が開いている場合、1.1.5を介してステップ1.1.2のように動物を麻酔し、1.3のように傷口を閉じます0.14。毎日、動物の健康状態を監視します。動物はinacitivity、食欲不振、体重減少及び色の損失の複数の適度な兆候を示している場合（23 G針で0.25ミリリットルで163ミリグラム/ kg）を腹腔内lethabarb注入の致死量を用いて動物を安楽死させます。 </li></ol></li></ol> 2.フロースルー椎弓根商工会議所（動物ごとに2つのチェンバース） <ol><li>手術のための動物の準備<ol><li>繰り返しは、1.1.4を介して1.1.1を繰り返します。二つのチャンバは、単一のラットの双方の鼠径部領域に移植することができます。 </li></ol></li><li>大腿血管の単離と商工会議所の挿入<ol><li>繰り返しは、1.2.8を介して1.2.1を繰り返します。 </li><li>動脈と完全に周囲の組織から解放され、その枝を結紮静脈の両方で、術野にチャンバをもたらします。 </li><li>チャンバーベースがないねじれやよじれがないことを確認することの対応するスリットに無傷の大腿血管のそれぞれを置きます。 </li><li> attachiによってチャンバを閉じますベースに蓋をngの。連続走行4/0絹縫合糸と2つまたは3つの追加の簡単な中断されたステッチを使用して傷を閉じ、前述のように、動物が回復することを可能にします。 </li></ol></li></ol> 3.チェンバースの収穫と組織処理<ol><li>実験の時間点（4-6週間移植後）に到達したら、ステップ1.1.2のように動物を麻酔し、1.1.5まで手順1.1.3を繰り返します。 </li><li> ＃15ブレードを使用して傷を開き、チャンバが完全に露出するまでハサミで組織を切断。 </li><li>その後、遠位方向に血液を牛乳、静かに2マイクロピンセットで血管を閉塞し、最終的には近位鉗子を解放：血管開通のための構築物およびテストに大腿骨近位部の血管を公開します。容器は再び血液でいっぱいになると、これは、開通性を確認します。動静脈ループの場合には近位大腿血管を結紮し、両方の近位および遠位番目の場合には電子フロースルー設定、および一括含む組織でチャンバーを削除します。 </li><li>実験の最後に、（23 G針で0.25ミリリットルで163ミリグラム/ kg）を腹腔内lethobarb注入の致死量を用いて動物を安楽死させます。 </li><li> 24時間室温で4％パラホルムアルデヒド中で組織を修正しました。ディバイド複数の横断切片に組織（1-2 mm厚）、パラフィンワックスまたはそれぞれパラフィン切片のための最適な切削温度化合物（5ミクロン）または凍結切片（10μm）を、中に埋め込 ​​む。3,4,8,17,22、 24 </li><li>組織の一般的な形態を調べるために、このようなヘマトキシリン​​およびエオシンなどの日常的な組織学的染色を実行します。例えば心筋細胞のための心筋トロポニンTの免疫染色を関心、3,4,8,17,22,24,29の細胞型を同定するための特定の抗体を用いて免疫組織化学染色を行ってください。 </li></ol>

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著者には競合する利益を宣言しません。

微小循環のエンジニアリングは、現在、二つのアプローチを通して、本質的に検討されています。最初は、移植されたときに、ホストの血管床からの毛細血管は、このように周囲に栄養素だけでなく、の配信を保証する、吻合と呼ばれるプロセスを通じて移植構築物のものと接続するようにin vitroでの構文内で高度に相互接続血管網を開発したが含ままた、コア。21,32,33にこれは前血管新生と呼ばれています。毛細管発芽前または同時に移植された細胞の分化と組織の成長とのいずれかが発生するように第2のアプローチは、 生体内で直接宿主自身の血管系を強化しようとします。17,34 ここで提示インビボ組織工学室プロトコルでは、いずれかの動静脈ループまたはフロースルー茎構成と、動脈と静脈を配置することによって、後者の概念を活用します。保護された空の空間内に、時間をかけて新しい毛細血管の有意な発芽および形成を可能にするチャンバ3の利点は、インビトロ操作の（1）存在しないことを含みます...

機能的な血管化組織を作製する組織工学アプローチを使用して再生医療における新興のパラダイムである。損傷した組織または欠陥のある臓器の置換のために新しく健康な組織を操作するために1,2の多くのアプローチが開発されている、3-6実験で小動物モデルで有望な臨床的可能性。7,8。しかし、血管新生は、臨床的に関連する大きさの組織を成長させる可能性を制限する組織工学のための大きな課題の一つである。9 組織は新しい血管が受信者血管床から成長外因性経路のいずれかに従うと、移植された組織は、10または脈管構造が成長し、新たに開発組織と一体となって展開する内因性血管新生経路を構築を通じて侵入する血管新生化するための現在のアプローチ。11外因性アプローチ伝統的な足場上に細胞を播種することを含みます血管の内部成長が遅すぎると非常に薄いインプラント（としてin vitroで 、以前に培養培地により供給される栄養素は、血液循環から供給されることを期待して生きている動物に完全な構築物を注入する。12,13コンセプトは&lt;単純化されて1〜2ミリメートルの厚さ）が生存したままになります。十分かつ迅速な血管新生によって栄養と酸素を提供することは、骨、筋肉、脂肪および固体臓器など、より複雑で、より大きな組織工学代用を成長させるための任意の成功した試みの心臓部である。14,15組み込み血管新生は、の可能性を提供していますより大きな構築物は、その拡大の血液供給に見合ったプログレッシブ組織の成長によって開発します。一つのデザインは、細胞播種足場を伴うまたは伴わない血管茎のチャンバ内へのin vivoでの移植である。5,6これは厚い本質的に血管新生した組織の生成のための新しい手順への道を開いた。16,17 &lt;/ P&gt; より最近では、戦略は、移植前に、事前血管を通す組織移植片に開発されてきました。これらの組み込まれた血管ネットワークは、移植厚い組織移植片のすべての部分の生存率を改善するための完全な血液供給の迅速な提供を可能にする注入でホスト血管と吻合することを目的としている。18 私たちは、灌流血管茎と細胞含有生体材料を含む皮下移植半硬質の密閉チャンバを伴う小動物におけるインビボ血管組織工学モデルを開拓してきました。室は、移植された血管からの血管新生発芽を刺激し、虚血性環境を作成します。3血管茎が再構成された動静脈ループまたは無傷のフロースルー動脈と静脈をいずれかであることができる。3-6,19この血管茎の芽機能と豊富な動脈を両方の芸術でリンク-capillary、静脈網erioleと静脈は血管茎で終わる。3,20また、周囲の中空の支持室が潜在的に機械的な力を変形させることから、発達中の組織を保護し、血管新生を高めるために、虚血性ドライブを延長する。3,21,22血管茎は単純に移植された場合室内の保護された空間内の正常組織ではなく、血管新生発芽は通常の創傷と同じタイムラインに沿って停止し、新しい組織が椎弓根の周りに蓄積されません。調べでは、支持的脈管構造とし、臨床的に関連する大きさの3次元機能に血管新生組織構築物を生成するために、このin vivoでの設定を使用しています。4,23さらに、その無傷の血管茎と工学血管組織構築物は、損傷部位でのその後の移植のために採取することができます。24,25より臨床的に実現可能なシナリオは、復興のための決定的なサイトでチャンバを作成することになります胸としてUCH。したがって、この新規組織工学アプローチは、再建手術のための機能的な標的組織の新たな供給源を提供するための臨床的可能性を有することができる。26-28 以下のプロトコルは、異なる動物モデルで適応および血管新生、マトリックス産生、および細胞遊走および分化の複雑な過程を調べるために使用することができるラットにおけるインビボ血管新生組織工学室を構築する一般的なガイドを提供します。

<table><tbody><tr><td>15番メス 1本</td><td>Braun</td><td>BB515</td><td></td></tr><tr><td>有歯アドソン鉗子 1本</td><td>Braun</td><td>BD527R</td><td></td></tr><tr><td>持針器 1本</td><td>Braun</td><td>BM201R</td><td></td></tr><tr><td>バイポーラ凝固器 1台&amp;nbsp;</td><td>Braun</td><td>US335</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ持針器 B-15-8.3 1本</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00763</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ拡張鉗子 D-5a.2 1本</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00125</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ精密ピンセット JF-5 1本</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00108</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ scissors - 直型 SAS-11 1本</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00098</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ scissors - 弯曲型 SDC-11 1本</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00090</td><td></td></tr><tr><td>シングルクランプ B-3 2本</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00400</td><td></td></tr><tr><td>10/0 ナイロン縫合糸 2本</td><td>S &amp;amp; T</td><td>03199</td><td></td></tr><tr><td>6/0 ナイロン縫合糸 1本</td><td>Braun</td><td>G2095469</td><td></td></tr><tr><td>4/0 シルク縫合糸 2本</td><td>Braun</td><td>C0760145</td><td></td></tr><tr><td>キシロカイン 1%</td><td>Dealmed</td><td>150733</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム</td><td>Dealmed</td><td>272301</td><td>5,000 UI/ml</td></tr><tr><td>乳酸リンゲル液</td><td>Baxter</td><td>JB2323</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>ドーム型組織工学チャンバー 1個</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フロースルーチャンバー 1個</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lectin I, Griffonia Simplicifolia&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1105</td><td>1.67 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Troponin T 抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab8295</td><td>4 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>ヒト特異的 Ku80 抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab80592</td><td>0.06 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Desmin 抗体</td><td>Dako</td><td>M0760</td><td>2.55 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Cell Tracker CM-DiI ダイ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C-7000</td><td>3 mg/10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; cells</td></tr><tr><td>Lethabarb (ペントバルビタールナトリウム)</td><td><a href="www.virbac.com.au" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Virbac Animal Health</a></td><td>LETHA450</td><td>325 mg/ml</td></tr><tr><td>フレキシブル加熱パッド</td><td><a href="http://www.redzoneheating.com.au" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Redzone Heating</a></td><td>RZ/Medium</td><td></td></tr></tbody></table>

中に組み込み血管新生による組織工学<em&gt;インビボ</em&gt;ティッシュ・エンジニアリング商工会議所

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

再建手術では、複雑で自家復興の現在の方法に代わる、コスト高と貿易別のものの欠陥のための臨床的な必要性があります。組織工学は、この需要の増加に対処するための約束を保持しています。しかし、ほとんどの組織工学戦略が悪いため、血管新生の安定した機能的組織代替物を生成することができません。本論文では、灌流動脈と静脈のいずれかの動静脈ループまたはフロースルー椎弓根構成としては、保護された中空室の内部に向けられている固有の血管新生のin vivo組織工学室モデルに焦点を当てています。この室ベースのシステムでは、血管新生発芽は、動静脈の血管から発生し、このシステムは徐々に線維血管組織でチャンバ空間を埋め駆動虚血性および炎症性の内因性の細胞遊走を魅了しています。外因性の細胞/チャンバーの構築時に行列注入は、セルシュールを強化しますvivalと開発工学組織の特異性を決定します。我々の研究は、この室モデルがうまくそのような脂肪、心筋、肝臓などのような様々な組織を生成することができることを示しています。しかしながら、修正及び改良は、標的組織の形成を一貫して再現可能であることを確認する必要があります。この記事では、生体内で二つの異なる血管組織工学室モデルの製造のための標準化されたプロトコルについて説明します。

上記のプロトコールに記載されるように、組織工学室の顕微作成を行いました。チャンバ内部で発生組織3.種々の組織タイプの正常インビボ血管新生室（ 図2）を使用して操作されたプロトコルのステップで説明するように組織学的に調べることができます。これらは、新生児ラット心筋細胞（ 図2A）、脂肪組織の細胞外マトリックス（ 図2C）に由来ハイドロゲルラット骨格筋芽細胞（ 図2B）、および脂肪組織と筋肉組織との心臓組織が ​​含まれます。 組織の形態学的評価は、ステレオ治験システムまたはImageJソフトウェアのいずれかで行うことができる。3,4,8,17,22,29様々な組織成分の定性的評価に加えて、立体学システムは、公平な定量化を可能にします特定の組織体積のfication。例えば、レクチン...

これは、組織工学チャンバー内の顕微動動静脈ループまたはフロースルー椎弓根構成を使用して、in vivo血管新生組織を構築するためのガイドラインです。生成された血管新生組織は、臓器の再生や組織欠損の置換、薬物試験や疾患モデリングに利用できます。

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

この手順の全体的な目的は、組織が成長・拡大すると同時に、強固な血液供給系が発達できる空間を構築し、最終的に血管を有する大きな三次元組織ブロックを生成することです。この手法は、再建目的の血管組織エンジニアリングや、臓器の置換および修復における重要な課題の解決に寄与します。この技術の主な利点は、新たに生成された組織が、生存のために周囲からの拡散に頼ることなく、組織固有の血管ネットワークによって内因的に血液を供給されることです。手順の実演は、Sue McKayとLiliana Pepeが行います。体重250 g以上のラットを麻酔し、足指のつまみ刺激によって麻酔深度を確認してください。ラットに反応が見られない場合は、処置の間、2% isofluraneを用いて鎮静状態を維持します。次に、眼にエプソム軟膏を塗布します。続いて、ラットを仰臥位にし、電気シェーバーで鼠径部を剃毛した後、湿らせたガーゼで毛を取り除きます。その後、70% ethanolを含むクロルヘキシジン溶液で手術部位を洗浄します。最後に、動物を滅菌タオルでドレープし、手術に進みます。15番メスを用いて、鼠径靭帯に平行に左鼠径部へ4 cmの皮膚切開を加えます。次に、露出した鼠径脂肪体を、上腹壁動静脈に基づく血管茎に付着させたまま、ハサミで周囲を切り離します。次に、マイクロシザーを用いて、腹壁と下層の大腿血管との間にある薄い結締組織の癒着を剥離します。その後、腹壁にリトラクターを配置し、内側に牽引して、鼠径靱帯と大腿血管の全長を露出させます。次に、マイクロフォーセプスと曲剪を用いて、腹壁下静脈を剥離し、周囲の脂肪から分離します。この静脈はテザーとして機能します。大腿血管と神経を含む血管周囲鞘を開いて進めてください。鼠径靭帯から、上腹壁動脈分枝より遠位の分岐点まで完全に開きます。この時点および全手順を通じて、大腿血管を慎重に取り扱うことが極めて重要です。血管を損傷させると血栓症を引き起こし、実験全体が失敗に終わる可能性があります。次に、マイクロピンセットを用いて大腿静脈の外膜をつかみ、周囲の組織および随伴する動脈から静かに分離させます。この工程では、静脈壁の全層を把握しないでください。内膜に損傷を与え、静脈血栓症を引き起こしやすくなる可能性があります。また、この工程で、側枝を10-0ナイロン縫合糸で結紮するか、バイポーラ凝固器で凝固させます。大腿静脈を完全に遊離させた後、近位側と遠位側を4-0シルク縫合糸で結紮し、腹壁下枝を約0.5 cm含む、長さ10 mm以上の静脈グラフトを得ます。この枝は、チャンバー内でループが開いた状態を維持するためのガイロープ（固定紐）として機能します。次に、グラフトの両端から外膜をトリミングします。必要に応じて、この工程はマイクロサージェリーによる吻合の直前まで延期しても構いません。ヘパリン含有生理食塩水で洗浄し、ヘパリン含有生理食塩水を充填した状態で静置し、静脈グラフトの準備を完了させます。次に、4-0シルク糸を用いた連続縫合と、さらに2〜3針の単純結節縫合で創部を閉鎖します。まず、前述の手法に従い、対側肢の鼠径靭帯および大腿血管の全域を露出させます。次に、マイクロ鉗子を使用して、上腹壁動脈と静脈の両方を周囲の脂肪組織から剥離し、単離します。血管から組織を剥がす際は、慎重に行ってください。続いて、大腿動脈の外膜をつかみ、周囲の組織から遊離させます。この工程では、動脈の側枝を結紮または凝固させます。次に、大腿動脈と大腿静脈の両方の近位側をクランプします。そして、4-0シルク縫合糸を用いて、腹壁下動静脈の分岐点より遠位で大腿動脈と大腿静脈を結紮します。次に、血管の下に滅菌済みのプラスチック製コントラスト背景を配置し、鋭利な直線型マイクロ剪刀を用いて各血管を横断的に切断します。切断後、管腔内からすべての血液が除去されるまで、十分な量のヘパリン加生理食塩水で血管内を強力に洗浄します。これで、静脈グラフトを術野に導入します。静脈グラフトを配置し、近位端をレシピエントの大腿静脈に、遠位端をレシピエントの大腿動脈に吻合できる状態にします。これにより、静脈グラフト内部の弁による抵抗なく、動脈側から静脈側へ血液が流れるようになります。大腿血管と静脈グラフトにねじれがなく、自然な位置に収まっていることを確認してください。10-0ナイロン縫合糸を用いて、両端に外科的吻合を行います。良好で非侵襲的なマイクロサージカル吻合を行うことが重要です。血管内膜の損傷、血管の乾燥、または縫合位置の不適切さは、吻合部位に血栓を形成しやすくさせる原因となります。次に、両方の吻合部位に漏れがないか確認します。吻合部位から拍動のない血液が流出しているような小さな漏れがある場合は、その上に少量の脂肪組織またはスポンジを置き、5～10分間軽く圧迫して止血します。術野全体に急速に血液が充満するような拍動性の大きな漏れがある場合は、追加の縫合が必要です。次に、動静脈ループの開通性を確認します。大腿動脈を軽く閉塞させると、ループは縮小するはずです。逆に、大腿静脈を閉塞させると、ループは充満します。次に、組織工学チャンバーの底部を動静脈ループの下に配置します。ループがねじれたり折れ曲がったりすることなく、自然な位置に収まっていることを確認してください。その後、6-0ナイロン縫合糸を用いて、チャンバーの底部を鼠径靭帯およびその下の筋膜に固定します。次に、チャンバーのベースの上に蓋を置きます。蓋の下で上腹壁動脈の枝を挟み、ループを固定します。その後、4-0シルク縫合糸を用いた連続縫合と、さらに2〜3本の単純結節縫合を用いて創 wounds を閉鎖します。最後に、個別のケージ内で動物を麻酔から回復させ、鎮痛剤としてカルプロフェンを単回皮下投与します。これまでと同様に、動物の手術準備を行います。1匹のラットの左右それぞれの鼠径部に、計2つのチャンバーを植え込むことが可能です。次に、前述の方法で大腿血管を単離します。動脈と静脈の両方を周囲組織から完全に遊離させ、分枝を結紮した後、チャンバーを術野に移動させます。そして、無傷の大腿血管をそれぞれチャンバー底部の対応するスリットに配置します。どちらもねじれたり折れ曲がったりしていないことを確認します。次に、蓋をベースに取り付けてチャンバーを閉じます。その後、前述の手順に従って創部を閉鎖し、動物を回復させます。組織工学チャンバーのマイクロサージャリーによる作製は、既報の通りに行った。このin vivo血管化チャンバーを用いることで、新生ラット心筋細胞を用いた心臓組織、ラット骨格筋芽細胞を用いた筋肉組織、および脂肪組織細胞外マトリックス由来のハイドロゲルを用いた脂肪組織など、さまざまな組織型の構築に成功した。ステレオロジーシステムにより、特定の組織体積の不偏な定量化が可能となる。例えば、横断面におけるレクチン染色の血管内皮細胞を用いて、血管体積を推定しました。蛍光色素で標識した細胞を生体内に移植した後、その運命を追跡することが可能です。例えば、dye i で標識した新生ラット心筋細胞が、移植から3日後の組織構築物内で検出されました。あるいは、異種移植研究において、導入された細胞を特定するために種特異的抗体を使用することも可能です。例えば、免疫不全ラットに移植したヒト人工多能性幹細胞を、チャンバーから回収した組織内で特定できます。習熟すれば、フロースルーチャンバーと動静脈ループの移植は、それぞれ約20分および90分で完了します。この手順を行う際は、常に無菌状態を維持し、汚染が発生した場合には必要な措置を講じることが重要です。血管を丁寧に扱い、非外傷的な微小外科的吻合を行うことが成功の鍵であることを忘れないでください。そのため、本手順、特に動静脈ループの構築を試みる前に、基本的な微小外科トレーニングを受けることを推奨します。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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