Name: 用いた環境サンプルから新規Faustovirusesの単離のための迅速な戦略 Vermamoeba vermiformis (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 学ぼう、Vermamoeba vermiformisを宿主細胞として用いたFaustovirusの新規単離戦略。フローサイトメトリーによる高速リysis検出で、巨大ウイルスの生態と病原性研究に貢献します。

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著者は確認すべきことがありません。

1.サンプルコレクション<ol><li>異なる環境と地域から70のサンプルを収集します。サンピエールドMeyzoargues（フランス）、マルセイユ（フランス）でボレリー公園内の湖から15のサンプルの村から5汚れた水試料;：この場合は、以下を使用マルセイユのSamenaで岩の入口（フランス）、アルプスから25河川水試料（フランス）からの土砂で15海水サンプル、ラ・シオタ（フランス）で下水から最終的に、10サンプル。 </li><li>任意の処理をせずに室温で1分間、接種前に、均質化のための渦サンプル。 </li></ol> 2.単離操作<ol><li>ブラインド文化の手順とサンプル接種のための準備をホスト<ol><li>使用V.共培養のための細胞のサポートなどvermiformis（株CDC19）。 </li><li>プロテアーゼペプトン-酵母エキス-グルコース培地30mlで75cm 2の細胞培養フラスコ中、28℃でアメーバを維持する（PYG）。 表1にPYG組成を確認してください。 注：48時間後、アメーバはカウントスライドを使用して、通常のカウント（ 例えば 、Kovaslides）によって定量化されています。 </li><li> 10分間、720×gで遠心分離することによって、5×10 5〜10 6細胞/ mlであり、ペレットアメーバの濃度で細胞を回収します。 </li><li>吸引により上清を除去し、滅菌ページのアメーバ生理食塩水（PAS） 表1の30ミリリットルでアメーバペレットを再懸濁する。この洗浄手順を繰り返します。 </li><li>約10 6アメーバ/ mlの濃度で抗生物質や抗真菌混合物と飢餓培地30ml中のアメーバを再サスペンド。飢餓培地は、シスト化や乗算なしで生き続けるためにそれを可能にする、アメーバの生存媒体です。 表1に組成を確認してください。 注：抗菌剤ミックスを10μg/ mlのバンコマイシン、10 / mlのイミペネム、20 / mlのシプロフロキサシン、20μを含有していましたグラム/ mlのドキシサイクリン、および20μg/ mlのボリコナゾール。この混合物は、ウイルス増殖を減少または変更することができ、細菌および真菌汚染を低減するのに役立ちました。 </li><li>直接湿潤環境が入った袋の内側に湿布を置くことで構成され（アメーバ接着に有利な96ウェルプレート平底に200μlのアメーバの単層上に各サンプルを25μl接種し、湿潤環境で30℃でインキュベート蒸発を避けるためにプレート）。これは、プリモ・文化で​​す。任意のサンプル接種せずにアメーバの2つのウェルを残します。これは、陰性対照として働きます。 3日間このプリモ・文化をインキュベートします。 </li><li>三日新鮮なアメーバの最初の接種、サブカルチャープリモ培養プレートの後の顕微鏡で観察することなく、上述したように。プリモ培養と同じ条件下で3日間の新しいプレートをインキュベートします。 </li><li>インキュベーションのこれらの3日後に目の場合と同じように、最終的な培養を行います電子primo-とサブカルチャー。 2日間の最終培養をインキュベートします。そして、検出に進みます。 </li></ol></li><li>自動化フローサイトメトリーによる溶解の検出 注：フローサイトメトリーで結合されたブラインド文化は分離の前の標準的なシステムとは異なります。これは、より敏感な正確かつ自動化されています。検出目的のために、我々は、最高速度で、顕微鏡観察することなく溶解を検出するために開発された新たな技術を適用しました。この技術は、スクリーニング試料について有利で ​​あり、より古い技術よりも優れた感度を有している。7-9 <ol><li>溶解を検出するために、最終的な共培養の96ウェルプレートを使用してください。 </li><li>サイトメーターの電源をオンにし、製造業者のプロトコルに従って、より低いバックグラウンドノイズを得るために、クリーンですすぎサイクルを実行します。 </li><li>サイトメーター自動的に96ウェルプレートからサンプルをロードし、accordin 40分以内に完全に自動化された取得を実行するために、フローと組み合わせるハイスループットサンプラー（HTS）を起動製造業者のプロトコルにグラム。 </li><li>サンプル容量150μLを、体​​積50μLを混合速度180、ミックス5の数、各サンプルを400μl、流速2.5μL/秒、記録されたイベント万の数との間の洗濯量を混合、次のようにHTSを設定します。 </li><li>ゲートするために、第1アメーバ集団を、最終的な共培養マイクロプレートの陰性対照ウェルを評価し、それらの物理的特性に応じて、これらの細胞宿主の割合を決定します。均質なアメーバの人口と破片やノイズ​​に対応する下のイベントの第二集団を持っているようにしてください。 注：このゲーティング手順は、前方散乱によって推定さ、サイズによって単一細胞から細胞内破片や凝集塊を区別します。正確に可能な限り最高のゲーティング手順を使用して各集団の割合を決定することが重要です。これらのパーセンテージは、原生動物の多くの種類が使用される場合は特に、変化し得るので、negativを有することが常に重要ですサンプルの残りの参照集団として使用することができる電子制御。 </li><li>サンプルを取得クリックして、ゲーティングを開始します。 </li><li> 10,000事象未満ではないイベントの数を記録します。 </li><li>矢印を使用して、関心のアメーバ集団をローカライズします。これは、ゲートを定義する方法です。 </li><li>その後、自動的にプレート全体を実行し、ゲーティングした後、HTSスポットを聞かせまたは「ホーム」をクリックして、プレートを見つけます。サイズおよび構造パラメータに従ってデータ収集と分析を実行します（それぞれ、FSC（前方散乱）およびSSC（側方散乱））。 注：アメーバ依存性人口の損失を検出するには、アメーバ溶解を担当する病原体の存在を示します。ウイルス感染に関連原虫溶解アナライザによってゲート及び信頼陰性対照として使用したものと同じ非感染個体群と比較して、アメーバ集団の50％溶解を任意に設計しきい値を用いて検出されます。 </li></ol></li></ol><pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 3。溶解検出後の新分離株のキャラクタリゼーション<ol><li>巨人ウイルスの存在を明らかにするための予備染色<ol><li>フローサイトメトリーによる溶解検出した後、残りのアメーバを中断し溶解した共培養をピペット。その後、直接10分間、800×gで懸濁液50μlの細胞遠心。 </li><li>遠心分離した後、純粋なメタノール溶液でスライドを固定します。ウイルスの工場が存在するかどうかを確認するために、エオシン/ブルーアズールとDAPI染色の商業迅速な染色を用いてスライドを染色し、1,000倍の倍率で光学顕微鏡下で観察します。 <ol><li>迅速な染色のために、第一のエオシン溶液にスライドを突入後、リン酸緩衝液で45秒間スライドをすすぎ、最終的に6秒間青色ジュールを含む第二の定着液中にスライドを突入に直接渡し、及び（4秒を3回繰り返します） pHは7.2。 observatiに進み、その後、室温で乾燥さスライドを残しますに。 </li><li> DAPI染色、預金固定乾式スラ​​イド上にDAPI商用原液15μlのために。観察に進み、その後、光から保護します。 </li></ol></li></ol></li><li>電子顕微鏡<ol><li>スライド上の最初の同定後、上清を培養物の電子顕微鏡観察によって巨大なウイルスの存在を評価します。 </li><li>グロー放電したグリッド上に正のサンプルの寄託5μlの。室温で約20分間待ちます。 </li><li>その上で10秒間、1％モリブデン酸アンモニウムの小滴を慎重にグリッドと堆積物を乾燥させます。 5分間乾燥させるためにグリッドを残します。 </li><li> 200 keVので顕微鏡を電子に進みます。 </li><li>ホルダーにグリッドを配置します。顕微鏡にホルダーをご紹介します。対応するアイコンをクリックして真空の概要を確認してください。開閉弁とスポットサイズ5であり、x 25,000倍の倍率で観察を始めます。 </li><li> ImageJのか、直接を使用して巨大なウイルスを測定します取得画面上にある顕微鏡の尺度ツールを使用して、顕微鏡上LY。 注：200nm程度のカプシドサイズでFaustovirusグループ内に試料を分類します。 </li></ol></li><li>分子生物学 注：それらが同じ宿主特異性を持っていませんが、この同定した後、分子生物学的テストは、電子顕微鏡の下で同じカプシドのサイズと外観を有するMarseillevirusからFaustovirusを区別するために、確認のために非常に重要でした。 MarseillevirusがVermamoebaに成長できない、FaustovirusはVermamoebaに固有であり、そのようなアカントアメーバのような他のアメーバの上に成長するすべての試みは、これまでに失敗した。Reteno らの作品に記載されている特異的なプライマー/プローブシステムの設計とアプリケーションを。ウイルス遺伝子の増幅および配列決定を介して新たに分離されたウイルスのより正確な予備分類を可能にしました。 <ol><li>例製造業者のプロトコルに従って自動抽出システムを使用して、陽性培養試料から管DNA。 </li><li> Retenoに記載されているように。19らサーモサイクラーを用いてリアルタイムPCRを行います</li><li>増幅に使用した同じプライマーを用いて配列。 Fstv_S2F 5&#39;-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3 &#39;（フォワード）およびFstv_S2R 5&#39;-TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3&#39;（リバース）を持つ：DNA依存性RNAポリメラーゼサブユニット1遺伝子を標的とするプライマーを使用してくださいFstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRAプローブ。 </li></ol></li></ol> 4.ウイルス産生、精製およびゲノムシーケンシング<ol><li>終点希釈クローニングのための単一のウイルスアメーバ文化をサブカルチャー。 </li><li>生産のために：PYGの30ミリリットルを含む20フラスコ、Vermamoebaのvermiformis、すでに小さなフラスコに井戸から転送された単離ウイルスの5ミリリットルの10ミリリットルを準備します。 </li><li>完了するまで30℃でインキュベートアメーバの溶解。すべてのアメーバが溶解するまで倒立光学顕微鏡により毎日観察します。 </li><li>完全に溶解した後、一人の受信者にすべてのフラスコをプール。破片を除去するために0.45μmのフィルターでフィルタリングします。 </li><li> 75分間、89,800×gで超遠心分離による精製を開始します。遠心分離を開始する前に、チューブの重量を校正することを確認します。 </li><li>遠心分離した後、吸引によって各チューブから上清を除去し、遠心分離を繰り返す前に、キャリブレーションに使用したのと同じ量でPASでペレットを再懸濁。 </li><li>上記のように、上清を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）1ml中のすべてのペレットを再懸濁します。 </li><li> （0.22μmのフィルターで濾過PBS 100ml中のスクロース27.5 gで）25％のショ糖を使用して、製造されたウイルスを精製します。 <ol><li>ショ糖の8ミリリットルとウイルス懸濁液の2ミリリットルを使用してください。 1時間15分間、89,800×gで遠心します。 1mlのPBSでペレットを再懸濁。 -80℃で保管してください。 </li&gt; </ol></li></ol>

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<li>Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Vermamoeba+vermiformis+and+associated+bacteria+in+hospital+water%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water.</a> Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).</li>
<li>Ogata, H., Toyoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remarkable+sequence+similarity+between+the+dinoflagellate-infecting+marine+girus+and+the+terrestrial+pathogen+African+swine+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus.</a> Virol J. 6, 178-178 (2008).</li>
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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

FaustovirusがASFVに近い新しいMegaviralesファミリーの最初のメンバーであるという可能性はまずReteno ら、19によって示唆されたが、いくつかの違いがまだ区別することができます。 Faustovirusがアスファウイルス科ファミリーに参加する必要があるかどうかではなく、新しい推定されるウイルスのファミリーを形成する必要があるかどうかは不明で表示されます。この問題はさらに調査、その形態、宿主範囲、複製サイクルおよび遺伝子レパートリーの特により包括的な特性評価が必要になります。もっとFaustovirus遺伝子型は、汎ゲノムを拡大すると、より良い、このウイルスのグループや家族の起源や親戚を理解するために分離する必要があります。我々が使用される技術は、私たちは、この潜在的な新しいファミリーの新しいメンバーを単離継続させます。この技術は、より良好な検出のための濃縮工程として働くわずかに変更共培養技術を用いて結合されています。 HUのためのデータを取得するためのフローサイトメトリーによって必要とされる時間サンプルのndredsは、以前の標準の共培養系に比べて大きな利点である、半時...

巨大なウイルスの発見、Megavirales順に属する特には、完全に粒子サイズおよびゲノムの複雑さの点でウイルスの世界を変えました。ウイルスは以前に小規模事業体であると考えられ、そしてミミウイルスは、すべてのルールを破るように見えた。1メタゲノムデータは、環境だけでなく、巨大なウイルスの普遍性を示唆して2-5でなく、ヒトで。6ので、必要性がまだあります大規模にこれらのウイルスを検索します。これらの巨大なウイルスの多様性は、世界的な水環境の多様性とそれに関連する堆積物だけでなくをサンプリングすることによって評価7-11だけでなく、ヒトサンプル12,13及び環境試料の様々なスクリーニングすることにより行った。7,9 アカントアメーバカブトムシ亜目のミミウイルスでした貪食原生生物を用いた共培養により単離され、主にアカントアメーバ属巨人ウイルスの14-16全体のコレクションはまた次いで科学界は、 アカントアメーバ属のための研究および単離手順を制限作られ、この指定された原生生物宿主から単離されました。明らかに、単一の宿主種で、この依存は見落とされているウイルスの大部分をもたらしました。巨大なウイルス、CroVは、非常に運動性の海洋原生動物カフェテリアroenbergensisで単離されたという事実は、17,18は、新しい系統または巨大ウイルスの家族を発見するために原生動物の広い範囲を使用する必要性を示しています。 Reteno らは以前に使用されていなかった細胞宿主として他の原生動物を選択するために管理され、巨大なウイルス（新しく名前を付けたFaustovirus）の新しいAsfar関連の系統を単離した。19 このウイルス系統のメンバーを拡大するために、新しいFaustovirus遺伝子型を分離する試みでは、我々は我々の単離手順を修正し、新しいFaustovirusesを収穫することが可能な環境サンプルをスクリーニングするためにそれらを使用しました。私たちはその後、新しい分離株を特徴づけるプロトコル全体を説明。我々はすでに最初のFaustovirusプロトタイプE12の単離に使用されているVermamoebaのvermiformis、人間の環境で見られる最も一般的な自由生活原生生物、20-22を評価した 。19この原生生物は、現在まだホスト固有Faustovirusためです。我々は、我々の研究室で他の巨大なウイルスを成長させるいかなる試みはアメーバ溶解またはウイルス増殖を示さなかったので知られている巨大なウイルスのいずれもが、このアメーバのために病原性ではなかったことを知っていました。このような理由から、私たちはそれを信じてV. vermiformisは新しいFaustovirusesを単離するために、既知の最良かつ最もユニークな細胞支持体です。

<table><tbody><tr><td>LSR FORTESSAサイトメーター&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>フランス&nbsp;</td><td>649225B4</td></tr>の<tr><td>TECNAI G2 F20</td><td>FEI</td><td>ドイツ&nbsp;</td><td>5027年11月</td></tr><tr><td>光学倒立顕微鏡</td><td>ライカ&nbsp;</td><td>フランス</td><td>72643</td></tr><tr><td>DNA 抽出</td><td>Qiagen EZ1 Advanced XL 抽出ロボット</td><td>フランス&nbsp;</td><td>L106A0452</td></tr><tr><td>PCR Cycler CFX96</td><td>Bio rad</td><td>France</td><td>785BR06298</td></tr><tr><td>PYG medium, PAS, Starvation medium</td><td>社内ラボ生産&nbsp;</td><td>マルセイユ URMITE</td><td>x</td></tr><tr><td>アメーバ株 CDC-19</td><td>ATCC</td><td>France</td><td>50237</td></tr><tr><td>プレート</td><td>Cellstar</td><td>France</td><td>655180</td></tr><tr><td>PCR 材料、プライマー。</td><td>eurogentec</td><td>フランス</td><td>プライマーは、グリッド</td></tr><tr><td>Kova&nbspと</td>原稿<td>ガラススライド10</td>で引用されています。<td>アメリカ</td><td>H899871441F</td></tr><tr><td>エオシン/ブルーアズールヘマカラー染色</td><td>メルクミリポア&nbsp;</td><td>フランス</td><td>111955,6,57,109468</td></tr><tr><td>真空駆動フィルターThermo</td><td>scientific</td><td>France</td><td>BPV4550 / 20170115</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Thermo Fisher scientific&nbsp;</td><td>フランス&nbsp;</td><td>〒10010-023</td></tr><tr><td>DAPIステイン</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td>フランス&nbsp;</td><td>D1306</td></tr>の<tr><td>cytospin 4 cytocentrifuge</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>France</td><td>10522013JT184-31</td></tr><tr><td>Single cytology tunnel</td><td>Biomedical polymers inc.</td><td>フランス</td><td>BMP-cyto-S50</td></tr><tr><td>カーボングリッド&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>フランス&nbsp;</td><td>FCF400NI</td></tr><tr><td>モリブデン酸アンモニウム</td><td>VWR国際&nbsp;</td><td>フランス&nbsp;</td><td>21276185</td></tr><tr><td>フラスコ&nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>ドイツ</td><td>833911</td></tr><tr><td>0.22 &mu;mフィルター&nbsp;</td><td>Milexミリポル&nbsp;</td><td>フランス</td><td>SE2M229104</td></tr><tr><td>超遠心分離機Sorval WX 80</td><td>Thermo scientific</td><td>France</td><td>9102448</td></tr><tr><td>Rapid-flow</td><td>フィルターNalgene</td><td>フランス</td><td>450-0020</td></tr></tbody></table>

用いた環境サンプルから新規faustovirusesの単離のための迅速な戦略<em&gt; vermamoeba vermiformis</em

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

巨大なウイルスの分離は、これらの巨大なウイルスが原生生物に関連している、特に以来、ウイルス学のこの新しい時代に大きな関心です。ジャイアントウイルスは、原生生物の多くの種のための潜在的に病原性であってもよいです。彼らはMegaviralesの最近記載された順序に属しています。下水試料から単離された新しい系統Faustovirusは、哺乳動物の病原体アフリカ豚コレラウイルスの遠縁です。このウイルスはまた、そのアメーバホスト、Vermamoeba vermiformis、ヘルスケア水システムにおける共通の原生生物に固有のものです。 その遺伝子型のコレクションを拡大し、その汎ゲノムを研究するために、新しいFaustovirus遺伝子型を単離することを継続することが重要です。我々は、アメーバの共培養の細菌および真菌の汚染を回避するために、抗生物質および抗真菌組み合わせの使用を改善し、ウイルス増殖を有利にすることによって、追加の株の単離のための新たな戦略を開発しました。我々はまた、新しいstarvatioを実装しましたV.を維持するために、n個のメディアウイルス共培養のための最適な条件でvermiformis。最後に、我々は、細胞変性効果を検出するために、時間がかかり、フローサイトメトリーではなく、顕微鏡観察を使用します。私たちは、より自分の環境、宿主特異性と遺伝的内容を理解するために、この方法の効率を証明するため、Faustovirusesのコレクションを広げ、下水試料から2つの単離を得ました。

この原稿で研究システムは、2つの新しいFaustovirusesを単離することによって、概念の、その証拠を検証しました。テストした70サンプルのうち、溶解の2つのエピソードは、私たちの信頼性が陰性対照とは対照的に、検出されました。溶解のためのネガティブコントロールは、86％のアメーバ集団を含んでいました。これとは対照的に、正のサンプル（サンピエール・デ・MeyzoarguesためのST1）、および（ラ・シオタサンプル9用LC9）はゲーテッドアメーバの劇的な減少を示しました。アメーバの60％以上は、破片の最も高い割合で溶解しました。我々の方法の検出段階のこれらの堅牢な結果を図1に示されている。エオシン/ブルーアズールとDAPI染色は、図2に示すように、アメーバ内部のウイルス工場の存在を確認した。電子顕微鏡は、二十面体カプシドとMegaviralesの典型的な外観を明らかにしましたサイズは、200nmで、および欠く線維（ 図3）。巨大なウイルス、PAのための特異的なPCRrt...

ここでは、巨大ウイルスの新しいアスファルウイルス関連系統であるファウストウイルスの新しい遺伝子型の特性評価のためのウイルス分離における最新の進歩について説明します。このプロトコルは、ウイルス、特にアメーバに感染する巨大ウイルスのハイスループット単離に適用できます。

用いた環境サンプルから新規Faustovirusesの単離のための迅速な戦略<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

この新しい分離戦略の全体的な目的は、この新しいウイルス科のパンゲノムを研究し、それらのエコシステムおよびヒトに対する潜在的な病原性をより深く理解するために、新しいウイルス分離株の数を増やすことです。この手法はウイルス学分野における重要な疑問に答えることができ、巨大ウイルス、特にFaustovirusの探索に関心を持つ世界中のウイルス学者の役に立ちます。この技術の主な利点は、抗生物質と抗真菌剤の混合物、アメーバに適応させた新しい飢餓培地、およびより迅速で感度の高い溶解検出のためのフローサイトメトリーの使用など、多くの段階において新たな改善を示している点にあります。テキストプロトコルに従って汚水サンプルを採取した後、アメーバを30 mLのプロテアーゼ・ペプトン・酵母エキス・グルコース（PYG培地）を含む75 cm²の細胞培養フラスコに加え、28 °Cで48時間インキュベートして、宿主細胞であるV. vermiformisを調製します。計数盤を用いてアメーバをカウントし、濃度が5 × 10⁵ ～ 10⁶ cells/mLに達したとき、720 ×gで10分間遠心分離して細胞を回収します。上清を吸引し、30 millilitersの滅菌済みPage's amoebal saline（PAS）を用いてアメーバペレットを再懸濁します。ペレットを2回目に洗浄した後、抗生物質と抗真菌剤を含む30 millilitersの飢餓培地を用い、細胞濃度が約10 to the 6th amoeba per milliliterになるように再懸濁します。飢餓培地を用いることで、アメーバは嚢子形成や増殖を行うことなく生存し続けることができます。次に、96ウェル平底プレートの各ウェルに200 µLのアメーバを播種し、30 °Cで30分間インキュベートします。その後、室温で水サンプルを1分間ボルテックスし、各サンプルの25 µLをアメーバ細胞に接種します。この際、陰性対照としてサンプルを加えないウェルを2つ設けます。蒸発を防ぐため、一次培養液が入ったプレートを濡れタオルを入れた袋に入れ、プレートを入れた加湿チャンバーを30 °Cのインキュベーターに入れます。最初の接種から3日後、顕微鏡による観察は行わず、先ほど示した方法で、初代培養プレートから新しいアメーバ入りの96ウェルプレートへ継代培養します。30 °Cで3日間インキュベートしてください。その後、この継代培養物を用いて、前述の手順で3枚目のプレートに接種し、2日間インキュベートします。最終的な共培養プレートにおける溶菌を検出するため、サイトメーターの電源を入れ、メーカーのプロトコルに従ってクリーンおよびリンスを行い、バックグラウンドノイズを低減させます。40分間の完全自動データ収集を行うには、メーカーのプロトコルに従い、ハイスループットサンプラー（HTS）を起動して96ウェルプレートからサンプルを自動的にロードします。HTSの設定を以下のようにプログラムします：サンプル容量 150 µL、混合容量 50 µL、混合速度 180、混合回数 5回、サンプル間の洗浄容量 400 µL、流量 2.5 µL/sec、記録イベント数 10,000。［home］をクリックし、HTSにプレートの位置を特定させます。次に、宿主のアメーバ細胞を含む陰性対照ウェルをまず評価し、アメーバ集団をゲートし、物理的特性に基づいて細胞比率を決定します。均質なアメーバ集団と、デブリやノイズに相当するイベント数の少ない第2の集団が確認できることを確認してください。次に、［acquire sample］をクリックしてゲーティングを開始します。次に、ゲートを定義する矢印を使用して、目的のアメーバ集団を特定します。少なくとも10,000イベントのゲーティングを行った後、「run」をクリックして、HTSにプレート全体の自動実行をさせます。前方散乱光（forward scatter）によるサイズパラメータと、側方散乱光（side scatter）による構造パラメータに従って、データ収集および解析を行います。詳細については本文を参照してください。フローサイトメトリーで溶血を確認した後、ピぺッティングにより溶出した共培養物を懸濁させ、残存するアメーバを分散させます。各サンプル50 µLをスライドガラスに分注し、そのまま800 ×gで10分間、サイトセントリフュージ（細胞遠心機）にかけます。次に、純メタノールを使用してスライドを固定し、室温で乾燥させます。固定後、スライドをESN溶液に4秒間ずつ3回浸し、その後、ブルーアズール溶液に6秒間浸します。最後に、スライドをPBSに45秒間浸します。観察に進む前に、スライドを室温で乾燥させます。固定済みの新しいスライドをDAPIで染色するには、15 µLのDAPIを乾燥したスライドにピペットで滴下します。光学顕微鏡を用いて1000倍の倍率でスライドを観察し、ウイルスファクトリーの有無を確認します。電子顕微鏡観察を行うには、グロー放電処理を施したグリッド上に陽性試料を5 µL滴下し、室温で約20分間インキュベートします。グリッドを慎重に乾燥させた後、1% モリブデン酸アンモニウムを少量加え、10秒間インキュベートします。液滴を慎重に取り除いた後、グリッドを5分間乾燥させます。次に、電子顕微鏡を200 keVに設定します。その後、グリッドをホルダーにセットし、ホルダーを顕微鏡内に導入します。真空オーバービューアイコンをクリックして真空度を確認します。次に、バルブを閉じ、スポットサイズを5に、倍率を25,000倍に設定してから観察を開始します。キャプチャ画面上で巨大ウイルスを確認した後、計測ツールを使用してウイルスの大きさを測定します。テキストプロトコルに従って、分子生物学的操作およびウイルスゲノムシーケンシングを実施してください。この図は、信頼性の高い陰性対照と比較した、2種類のFaustovirusの検出結果を示しています。溶菌の陰性対照には、86%のアメーバ集団が含まれていました。対照的に、陽性サンプルでは最も高いデブリ率を示し、アメーバの60%以上が溶菌していました。ここで示されているように、ESNおよびblue-azurは、非感染および感染アメーバ細胞の核と、感染細胞内部のウイルス工場（virus factory）を染色します。また、DAPI染色によってもアメーバ内部にウイルス工場が存在することが確認されます。これらの画像において、電子顕微鏡観察により、繊維状構造を持たない正二十面体カプシドで構成され、サイズが200 nanometersであるメガウイルス特有の外観を持つFaustovirusの存在が明らかになります。習得し、共培養を完了した後であれば、適切に実施することで、この溶菌検出およびウイルス特性評価の手法を1時間で完了させることができます。この手順を行う際は、アメーバの生存率を管理し、想定される汚染を確認することが重要です。本手順に続き、巨大ウイルスを標的とした分子生物学的な手法などの他の方法を実施することで、ウイルスの科や遺伝子型といった追加の疑問を明らかにすることが可能です。この技術の開発後、ウイルス学分野の研究者は、このウイルス科、その特異的な宿主、および潜在的な病原性を探求するための道を切り拓きました。このビデオを視聴することで、サンプルの数と種類を拡大し、最適な宿主細胞と培養条件を選択することにより、巨大ウイルスを容易に単離する方法について十分に理解できるはずです。特に下水サンプルを扱う場合、ヒトに対して潜在的な病原性を持つウイルスを扱うことは極めて危険であることに留意してください。したがって、本手順を実施する際は、安全な条件下でSB2ラボで作業するなど、常に十分な予防措置を講じる必要があります。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

研究では、MSTのツールと​​して提案したヒト/ブタ/ウシDNAウイルス、アデノウイルスとpolyomaviruses、特定の定量化のために定量PCRを用いて水中の硝酸塩による尿/糞便汚染または汚染源の同定のための費用対効果の高い方法を説明します。...

特定のヒトと動物のウイルスを用いた微生物ソースのトラッキングのための費用対効果の高い方法

アメーバ共培養は、選択的アメーバおよびマクロファージなどの食細胞に耐え細胞内病原体を成長させるために接着性アメーバを用いた細胞培養系である。したがって、新たな感染性病原体を発見するための重要なツールを表しています。アメーバ濃縮は、新たアメーバ種とそれらの特異的な細胞内細菌の発見を可能にする。...

アメーバ共培養し、アメーバ濃縮アプローチによって新しい細胞内病原体の発見

EPA Method 1615は、環境水や飲料水中のエンテロウイルスとノロウイルスを濃縮するために、電気陽性フィルターを使用します。この原稿では、メソッド 1615...

エンテロウイルスと文化およびRT-QPCRによる水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。ウイルスサンプルのI.コレクション

ここでは、バッファロー・グリーンモンキー腎臓細胞株を使用して培養可能なウイルス全体を測定する手順を紹介します。この手順は、環境水および飲料水中の感染性ウイルスの発生を測定するための標準化されたツールを提供します。...

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ここでは、逆転写定量PCRを使用して、環境水と飲料水中のエンテロウイルスとノロウイルスを定量化する手順を紹介します。EPA メソッド 1615 のこの標準化された手順による地下水からの平均ウイルス回収率は、ポリオウイルスで 20%、マウスノロウイルスで 30%...

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巨大ウイルス混合物分離のための蛍光活性化細胞選別の代替戦略としての単一細胞マイクロ吸引

このプロトコルは、現場の天然基質から生きた線虫を効率的に抽出する方法を概説する。...

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環境水および廃水サンプルからのウイルス濃度は困難な作業であり、主にウイルスの同定と定量のために実行されます。いくつかのウイルス濃縮法が開発およびテストされていますが、ここでは、異なるサンプルタイプのRNAウイルスに対する限外ろ過と脱脂粉乳凝集の有効性を示します。...

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光合成微生物とそのウイルスの環境サンプリング:フィールドからラボまで

学ぼう、Vermamoeba vermiformisを宿主細胞として用いたFaustovirusの新規単離戦略。フローサイトメトリーによる高速リysis検出で、巨大ウイルスの生態と病原性研究に貢献します。

用いた環境サンプルから新規Faustovirusesの単離のための迅速な戦略

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