用いた環境サンプルから新規Faustovirusesの単離のための迅速な戦略

この新しい分離戦略の全体的な目的は、この新しいウイルス科のパンゲノムを研究し、それらのエコシステムおよびヒトに対する潜在的な病原性をより深く理解するために、新しいウイルス分離株の数を増やすことです。この手法はウイルス学分野における重要な疑問に答えることができ、巨大ウイルス、特にFaustovirusの探索に関心を持つ世界中のウイルス学者の役に立ちます。この技術の主な利点は、抗生物質と抗真菌剤の混合物、アメーバに適応させた新しい飢餓培地、およびより迅速で感度の高い溶解検出のためのフローサイトメトリーの使用など、多くの段階において新たな改善を示している点にあります。テキストプロトコルに従って汚水サンプルを採取した後、アメーバを30 mLのプロテアーゼ・ペプトン・酵母エキス・グルコース（PYG培地）を含む75 cm²の細胞培養フラスコに加え、28 °Cで48時間インキュベートして、宿主細胞であるV. vermiformisを調製します。計数盤を用いてアメーバをカウントし、濃度が5 × 10⁵ ～ 10⁶ cells/mLに達したとき、720 ×gで10分間遠心分離して細胞を回収します。

上清を吸引し、30 millilitersの滅菌済みPage's amoebal saline（PAS）を用いてアメーバペレットを再懸濁します。ペレットを2回目に洗浄した後、抗生物質と抗真菌剤を含む30 millilitersの飢餓培地を用い、細胞濃度が約10 to the 6th amoeba per milliliterになるように再懸濁します。飢餓培地を用いることで、アメーバは嚢子形成や増殖を行うことなく生存し続けることができます。

次に、96ウェル平底プレートの各ウェルに200 µLのアメーバを播種し、30 °Cで30分間インキュベートします。その後、室温で水サンプルを1分間ボルテックスし、各サンプルの25 µLをアメーバ細胞に接種します。この際、陰性対照としてサンプルを加えないウェルを2つ設けます。蒸発を防ぐため、一次培養液が入ったプレートを濡れタオルを入れた袋に入れ、プレートを入れた加湿チャンバーを30 °Cのインキュベーターに入れます。

最初の接種から3日後、顕微鏡による観察は行わず、先ほど示した方法で、初代培養プレートから新しいアメーバ入りの96ウェルプレートへ継代培養します。30 °Cで3日間インキュベートしてください。その後、この継代培養物を用いて、前述の手順で3枚目のプレートに接種し、2日間インキュベートします。

最終的な共培養プレートにおける溶菌を検出するため、サイトメーターの電源を入れ、メーカーのプロトコルに従ってクリーンおよびリンスを行い、バックグラウンドノイズを低減させます。40分間の完全自動データ収集を行うには、メーカーのプロトコルに従い、ハイスループットサンプラー（HTS）を起動して96ウェルプレートからサンプルを自動的にロードします。HTSの設定を以下のようにプログラムします：サンプル容量 150 µL、混合容量 50 µL、混合速度 180、混合回数 5回、サンプル間の洗浄容量 400 µL、流量 2.5 µL/sec、記録イベント数 10,000。［home］をクリックし、HTSにプレートの位置を特定させます。次に、宿主のアメーバ細胞を含む陰性対照ウェルをまず評価し、アメーバ集団をゲートし、物理的特性に基づいて細胞比率を決定します。均質なアメーバ集団と、デブリやノイズに相当するイベント数の少ない第2の集団が確認できることを確認してください。次に、［acquire sample］をクリックしてゲーティングを開始します。

次に、ゲートを定義する矢印を使用して、目的のアメーバ集団を特定します。少なくとも10,000イベントのゲーティングを行った後、「run」をクリックして、HTSにプレート全体の自動実行をさせます。前方散乱光（forward scatter）によるサイズパラメータと、側方散乱光（side scatter）による構造パラメータに従って、データ収集および解析を行います。詳細については本文を参照してください。

フローサイトメトリーで溶血を確認した後、ピぺッティングにより溶出した共培養物を懸濁させ、残存するアメーバを分散させます。各サンプル50 µLをスライドガラスに分注し、そのまま800 ×gで10分間、サイトセントリフュージ（細胞遠心機）にかけます。

次に、純メタノールを使用してスライドを固定し、室温で乾燥させます。固定後、スライドをESN溶液に4秒間ずつ3回浸し、その後、ブルーアズール溶液に6秒間浸します。最後に、スライドをPBSに45秒間浸します。

観察に進む前に、スライドを室温で乾燥させます。固定済みの新しいスライドをDAPIで染色するには、15 µLのDAPIを乾燥したスライドにピペットで滴下します。光学顕微鏡を用いて1000倍の倍率でスライドを観察し、ウイルスファクトリーの有無を確認します。

電子顕微鏡観察を行うには、グロー放電処理を施したグリッド上に陽性試料を5 µL滴下し、室温で約20分間インキュベートします。グリッドを慎重に乾燥させた後、1% モリブデン酸アンモニウムを少量加え、10秒間インキュベートします。液滴を慎重に取り除いた後、グリッドを5分間乾燥させます。次に、電子顕微鏡を200 keVに設定します。その後、グリッドをホルダーにセットし、ホルダーを顕微鏡内に導入します。真空オーバービューアイコンをクリックして真空度を確認します。次に、バルブを閉じ、スポットサイズを5に、倍率を25,000倍に設定してから観察を開始します。キャプチャ画面上で巨大ウイルスを確認した後、計測ツールを使用してウイルスの大きさを測定します。

テキストプロトコルに従って、分子生物学的操作およびウイルスゲノムシーケンシングを実施してください。

この図は、信頼性の高い陰性対照と比較した、2種類のFaustovirusの検出結果を示しています。溶菌の陰性対照には、86%のアメーバ集団が含まれていました。対照的に、陽性サンプルでは最も高いデブリ率を示し、アメーバの60%以上が溶菌していました。

ここで示されているように、ESNおよびblue-azurは、非感染および感染アメーバ細胞の核と、感染細胞内部のウイルス工場（virus factory）を染色します。また、DAPI染色によってもアメーバ内部にウイルス工場が存在することが確認されます。これらの画像において、電子顕微鏡観察により、繊維状構造を持たない正二十面体カプシドで構成され、サイズが200 nanometersであるメガウイルス特有の外観を持つFaustovirusの存在が明らかになります。

習得し、共培養を完了した後であれば、適切に実施することで、この溶菌検出およびウイルス特性評価の手法を1時間で完了させることができます。この手順を行う際は、アメーバの生存率を管理し、想定される汚染を確認することが重要です。本手順に続き、巨大ウイルスを標的とした分子生物学的な手法などの他の方法を実施することで、ウイルスの科や遺伝子型といった追加の疑問を明らかにすることが可能です。

この技術の開発後、ウイルス学分野の研究者は、このウイルス科、その特異的な宿主、および潜在的な病原性を探求するための道を切り拓きました。このビデオを視聴することで、サンプルの数と種類を拡大し、最適な宿主細胞と培養条件を選択することにより、巨大ウイルスを容易に単離する方法について十分に理解できるはずです。特に下水サンプルを扱う場合、ヒトに対して潜在的な病原性を持つウイルスを扱うことは極めて危険であることに留意してください。

したがって、本手順を実施する際は、安全な条件下でSB2ラボで作業するなど、常に十分な予防措置を講じる必要があります。