Name: アナスタシスはIn Vivo CaspaseTracker バイオ センサーによる検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 20 min 16 s
Description: 学ぶアナスタシス検出法：CaspaseTrackerバイオセンサーを用いてDrosophila melanogasterで細胞死の可逆性を追跡する手法。この技術は細胞回復メカニズムの理解と治療応用に貢献します。

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ショウジョウバエイメージ図 3 およびビデオの原稿; ありがとうダレン ObbardJ. マリー ・ ハードウィック、ウェイド ・ ギブソン、ヘザー M. ラムこの原稿の貴重な議論のため。この作業によって、卿エドワード ・ ユード記念フェローシップ (H.L.T.)、博士ウォルター Szeto 記念奨学金 (H.L.T.) が支持されたフルブライト付与生命科学研究財団フェローシップ (H.L.T.) と NCI K22 付与 CA204458 (H.L.T.) 007-2009 (H.L.T.) です。ホー ラム唐は、Shurl と生命科学研究財団 (2014-2017) ケイ Curci 財団研究員だった。

1) ハエ CaspaseTracker バイオ センサーの作製
<ol><li>CO2ハエを麻酔し、絵筆を使用してはえの食糧と新鮮な酵母のペーストと同じ瓶で 7 に 10 カスパーゼに依存した Gal4 (DQVD)19処女女性および 7 10 G トレース53 Gal4 記者若い男性のハエ (またはその逆) を転送します。 注:カスパーゼに依存 (DQVD) Gal4 と G トレース ハエの十字架 CaspaseTracker 子孫ハエが生成されます。カスパーゼ -で機密性の高い (DQVA)19 Gal4 のクロス、G トレース ハエはネガティブ コントロール ハエ (ディスカッションを参照) を提供します。新鮮な酵母ペーストは子孫の数が増加するので、卵の生産を強化するたんぱく源として提供しています。処女の女性とその表現型54によると若い男性のハエを選択します。</li>
	<li>3 〜 7 日、十字架の中に摂氏 18 度 (oC) でハエをインキュベートし、18 ° C で新しいクロスを設定する新しいバイアルにハエを転送子孫が eclose を飛ぶまでに 18 ° C で元のバイアルをインキュベートし続けます。 注:親のハエを元のバイアルに子孫の混雑を避けるために新しい瓶に転送します。親のハエは最初 2 に 3 スイッチで生鮮食品酵母の子孫を作り出すことができるし、生産性が時間大幅減少します。ハエを発生させる 18 の ° C は、CaspaseTracker バイオ センサーの非固有の信号を減らすことができます (ディスカッションを参照してください)。</li>
	<li>選択の子孫は次の実験のための正しい表現型54で飛ぶ。 注:ここで両方のカスパーゼに依存した Gal4 と G トレースの transgenes、CyO バランサーとのバランス、2 番目の染色体にあります。カスパーゼ依存 Gal4 および G トレースの両方の遺伝子を持つ (町)、なし非巻き毛翼子孫を選択します。</li>
</ol>2) 一時的な細胞死誘導 CaspaseTracker バイオ センサーへの応用を飛ぶ
<ol><li>10 に 20 新しく卵卵室の生産を許可する 18 の ° C で 1 日新鮮なはえの食糧と新鮮な酵母ペースト新しいバイアルにこの女性がジャンプを転送します。 注:雄と雌を維持する産卵室を高める可能性があります。</li>
	<li>低温ショックによってアポトーシスを受けるに卵室を誘導して、メスの成虫を 1 h の-7 ° C に配置され、新しい空のバイアルに転送します。 注: 低温プラズマ膜破裂55,56を誘導することによって細胞を傷つけます。</li>
	<li>タンパク質飢餓によるアポトーシスを受けるに卵室を誘導して、3 日間の 18 ° C で 8% 蔗糖および 1% 寒天の食物と一緒に新しいバイアルにメスの成虫を転送します。 注:タンパク質不足 (非蛋白質食品) は、アポトーシス57,58,59とオートファジー60,61を受ける卵室をトリガーできます。はえの食糧、ショ糖の最適な状態を保つために、毎日 8% のショ糖と 1% の寒天食品と新しいバイアルにハエを切り替えます。</li>
	<li>回復することを許可するように 18 ° C で 3 日間新鮮なはえの食糧と新鮮な酵母ペースト新しいバイアルに強調したハエを転送します。飢え死にしたと記述されている62として卵巣に卵室を取得する飢えた回復ハエを解剖します。 注:ショウジョウバエ卵巣を取得するを解剖、CO2ハエを麻酔しハエの頭を削除する鉗子の 2 組を使用し、ハエの卵巣を削除する腹部の基部をプルする鉗子を使用します。</li>
</ol>3) 固定およびイメージングの切り裂かれた卵室の汚損
<ol><li>0.5 mL リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 中一緒に切り裂かれた卵室を 1 mL の遠心管に転送します。定住する卵を許可します。 注:1% ウシ血清アルブミン (BSA) を水や卵室の先端のプラスチックの表面に固執するを防ぐために PBS に溶解とプラスチック ピペット チップをコートします。赤色けい光たんぱく質 (RFP、下流とも呼ばれます) の変質を避けるために暗闇の中で次の手順を実行、卵室で緑の蛍光蛋白質 (GFP)。</li>
	<li>ピペッティングで PBS を削除し、20 から 30 分のために室温で卵室を修正する PBS で 0.5 mL 4% パラホルムアルデヒドを適用します。 注:この手順と次のインキュベーション手順で緩やかな回転を適用します。</li>
	<li>ピペッティングして、パラホルムアルデヒドを削除し、0.5 ml の pbst; 卵室を洗浄し (PBS + 0.1% トリトン X-100) 3 回。 注:長期固定は、RFP と GFP の信号を減らすことができます。</li>
	<li>PBST と卵室に室温で 1 ~ 2 時間孵化させなさいまたは卵室を permeabilize 緩やかな回転で 4 ° C で一晩します。 注: pbst; また非 BSA のプラスチック表面に固執する卵室を避けることができます。</li>
	<li>ピペットで、pbst; を削除し、卵室に核を染色する室温で 1 ~ 2 時間に 10 μ g/ミリリットル PBST で青い核ヘキスト染料の 0.5 mL を適用します。 注 1:非固有の信号を高めるため核染付長期間の加温は避けてください。 注 2:ヘキストせず核を染色する方法は 200 を追加、DAPI μ L 抗漂白取付エージェント (資料参照) プロトコル 3.8 で説明したように、ガラス製カバー スリップ上組織をマウントする前に一晩63、孵化させなさいと。 注 3: 退色を避けるために暗闇の中で染色し、次の手順を実行します。</li>
	<li>ピペッティングで核染色を削除し、0.5 mL pbst; 洗浄の各ステップ間の緩やかな回転と 10 〜 20 分孵化での 3 時間のため 1 mL の遠心管に卵室を洗浄します。</li>
	<li>罰金のピペットですべて pbst; を削除し、200 を適用 μ L 抗漂白取付エージェント (参照資料) 卵室が管の底に沈むまで 4 ° C で 3 時間室温または一晩卵室をインキュベートします。 注意: 取り付けエージェントを完全に吸収している組織が管の底に沈みます。</li>
	<li>アンチ漂白 200 μ L でそれらを転送することによって汚された卵室をマウント 20 × 20 mm あらかじめ洗浄し、ガラス カバー スリップの卵室をカバーし、置くことによってスライド ガラスにカバーガラスをシール ピペッティングによるイメージングのためのあらかじめ洗浄し、ガラス スライド上のエージェントを実装マニキュア カバー スリップの端に。 注 1:あらかじめスライド ガラスと水または 70% エタノールとカバー スリップをきれい。 注 2:スライド ガラスと overcompression によって卵室を破壊しないようにカバー スリップの石油ゼリーを適用します。</li>
	<li>イメージの蛍光または 20 x、NA 0.8 を用いた共焦点顕微鏡を用いた卵溜まり計画アポクロマート目的は、染色性が核の励起光の波長 405 nm (検出排出 〜 461 nm)、561 RFP (進行中または最近カスパーゼ活性) 信号 (nm放出 ~ 590 nm を検出) と 488 (過去のカスパーゼ活性) GFP シグナルの nm (発光を検出 〜 518 nm)。 注:顕微鏡20,64の私たちの公開プロトコルを参照してください。</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

CaspaseTracker デュアル センサー システムが斬新で、最近の検出を可能にするユニークなツールまたは進行中のカスパーゼ活性と細胞死を逆転させた細胞の追跡処理およびカスパーゼ活性体内を経て生き残るため。成長の研究が非アポトーシス カスパーゼ活性がニューロン活動79,の規制などの多様な細胞機能の潜在的な役割を果たしていることを明らかにする一方、カスパーゼ活性がアポトーシスの特徴として伝統的に仮定されて、80、学習およびメモリ81,82,83,84, necroptotic 細胞死85,<sup class="...

プログラムされたアポトーシスなどの細胞死は、多細胞生物1,2,3不要、負傷、または危険な細胞を排除することによって胚と通常の恒常性に重要な役割を果たしています。細胞死と生存のバランスの損失は、癌、心不全、自己免疫疾患、変性4,5,6,7,8など致命的な結果につながることができます。カスパーゼは、"ノーリターンのポイント「アポトーシス9,10、11、それとして従来考えられている死刑執行人の活性化を迅速かつ大規模な細胞解体12、トリガー 13,14,,1516。この一般的な教義に挑戦、我々 は実証が死ぬ主細胞と癌細胞を回復できるだけでも次の重要な細胞のカスパーゼ活性化後、膜ブレブ、細胞の収縮を含む死の特徴ミトコンドリアの断片化、細胞質、核 chromatin の凝縮が、DNA 損傷、核の断片化へのミトコンドリアのチトクロームcの放出細胞アポトーシス小体の形成とホスファチジルセリン (PS) の表面の露出17,18,19,20,21. 提案するそのアナスタシスは本質的な細胞回復現象、死細胞は細胞死の刺激17,18,19,20,を除去した後回復できるよう21. 私たちの造語「アナスタシスは」(Αναστάσης)18、「上昇生活に」ギリシャ語でを意味するこの予期しない細胞回復現象を記述します。アナスタシスはの私達の観察はホスファチジルセリン外在化22,23,24、限定ミトコンドリア、後細胞の回復も明らかに最近の独立した研究によってサポートされてさらに外側膜透過25キナーゼのような混合系の活性化 (MLKL) と細胞収縮26。
アナスタシスを規定しているメカニズムを特徴付けるお越しのパラダイム シフトの生理学的、病理学的、および治療の影響。アナスタシスは救助または左心室と心室をアンロードして重要な後細胞と置き換えるには、困難な組織、おそらく心不全逆転のアカウントを保持する未知の細胞保護メカニズムを表すことができます。脳損傷32後デバイス (LVADs)27,28, 視細胞の過度光29,30,31, 一時的な露出やニューロンの修理後の復旧を支援します。その場合推進アナスタシスは細胞・組織の回復を高めることができます。逆に、アナスタシスはがん細胞が細胞死誘導療法、がん再発17,18の原因を生き残るために使用予期しないエスケープ戦術かもしれない。したがって、アナスタシスは中にがん細胞が死ぬことで、がん治療後の再発を防止することによって癌を治療する新たな治療戦略を抑制します。
アナスタシスはの過程で、我々 は、アポトーシス18,20,21 の中に DNA 損傷原因の可能性が発生したこと、いくつかの回復された細胞恒久的な遺伝子変異を取得し、発癌を受けたを発見しました。.DNA ダメージを受けた細胞の死のプロセスを逆転させることができる腫瘍形成のメカニズム、食道の慢性的な熱損傷が誘発されるよう組織の様にがんのリスクを増加可能性のある組織の損傷を繰り返し観察の基礎となります。非常に熱い飲料33,34,35、アルコール中毒36,37による肝臓の損傷、腫瘍の進化の遺伝毒性癌療法38,後の消費によって39,40, および抗癌性療法41,42,43,44のサイクルの間隔中に発生した正常組織から新しい癌の開発.True の場合、アナスタシスはターゲットを防ぐ可能性があります。 または癌の発生と進行を逮捕します。我々 は、飢餓による死生殖細胞を再供給のショウジョウバエ19でアナスタシスは受けることを発見しました。 アナスタシスは DNA 損傷と生殖細胞の発生、環境ストレスを長期観察のためのアカウントは、遺伝病の開発を促進するかもしれない。たとえば、飢饉は継代継承可能な糖尿病と冠動脈心疾患45疾患の発展に貢献します。したがって、この潜在的なメカニズムに起因する継承可能な疾患の発症予防のための戦略理解アナスタシスは可能性があります。
アナスタシスはの発見を活用し、革新的な治療法の開発にそれを直接、原因とアナスタシスは生きている動物での結果を研究に不可欠です。ただし、それは技術的に識別し、細胞死のプロセスから回収した細胞は通常の健康な細胞と形態学的区別がつかない表示され、アナスタシスはマーカーがないため anastatic 細胞は生体内で、追跡に挑戦します。特定まだ17,18,21。これらの問題に対処するため、我々 は最近新しい生体内でカスパーゼ バイオ センサーを識別およびカスパーゼ活性化19,46, 後アポトーシスを生き残る細胞を追跡する"CaspaseTracker"19日を指定を開発、アポトーシス10,14の特徴。スキャット12,47、Apoliner48, CA GFP49、ApoAlert18,50, C3AIs51 iCasper52 など「リアルタイム」カスパーゼ バイオ センサーとそれを区別します。にカスパーゼ活性を検出する、CaspaseTracker バイオ センサーはまた永久にも一過性細胞その特急のカスパーゼ活性にラベルを付ける機能します。したがって、CaspaseTracker バイオ センサーは、カスパーゼを介した崩細胞死のプロセスで vivo後アナスタシスはの長期追跡を可能。 にします。

<table><tbody><tr><td>消耗品および試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield封入剤</td><td>ベクター製品</td><td>H-1000</td><td>色あせ防止剤</td></tr><tr><td>Vectashield 封入剤 (DAPI付き)</td><td>ベクター製品</td><td>H-1200</td><td>DAPI鉗子付き退色防止封入剤</td></tr><tr><td></td><td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>デュモンピンセット生物学グレード,ステンレス鋼</td></tr><tr><td>ハンギングドロップスライドフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>12-565B</td><td>ガラススライド</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>分子プローブ</td><td>H1399DNA</td><td>染色</td></tr><tr><td>MitotrackerレッドCMXRos&nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>M-7512</td><td>Mitochondria stain</td></tr><tr><td>Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#9661</td><td>Stain for active fragment of caspase-3</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BAS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td>Blocking agent for immunostaining</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline&nbsp;</td><td>VWR</td><td>114-056-101</td><td>Triton&tradeの洗浄および免疫染色のための媒体</td></tr><tr><td>;X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>細胞透過用洗剤</td></tr><tr><td>名前</td><td>企業名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM780 共焦点顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td>N/A</td><td>イメージング</td></tr><tr><td>カールツァイス実体顕微鏡ステミ2000&nbsp;</td><td>カールツァイス</td><td>N / A</td><td>ショウジョウバエの解剖</td></tr><tr><td>AmScope光ファイバーデュアルグースネック顕微鏡イルミネーター、150W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316&nbsp;</td><td>光源</td></tr></tbody></table>

アナスタシスはin vivo caspasetracker バイオ センサーによる検出

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

アナスタシスは (ギリシャ語の生活に""ライジング) という本質的に取り返しのつかないことに一般に見なされる後期細胞死のプロセスを逆転できる死ぬセルが最近発見された細胞回復現象であります。アナスタシスを促進が保持または原則レスキューけが細胞心筋細胞や神経細胞、これにより組織の回復を促進するなど交換しにくい。逆に、抗癌治療後アポトーシスを受けるアナスタシスは癌細胞を抑制することで、癌細胞の死をことを確認可能性があり、再発の可能性を減らします。ただし、これらの研究は、生きている動物のアナスタシスを受ける細胞の運命を追跡するためのツールの欠如によって妨げられています。課題は、回復後の形態学的正常な外観にもかかわらず細胞死のプロセスを逆転させた細胞を識別することです。この困難を克服するため、ショウジョウバエおよび哺乳類の CaspaseTracker バイオ センサー システムを識別および anastatic 細胞体外か体内を永久に追跡することができますを開発しました。生成と検出および細胞死の刺激に対する一時的な暴露後アナスタシスはキイロショウジョウバエを追跡する CaspaseTracker デュアル センサー システムの使用のため生体内でプロトコルを紹介します。一方、従来のバイオ センサー、プロトコル積極的に受けてアポトーシス細胞死細胞をラベルすることができます、CaspaseTracker バイオ センサー完全にカスパーゼ活性化 - 後期アポトーシスの特徴後回復した細胞にラベルをでき、同時にアクティブなアポトーシス プロセスを識別します。このバイオ センサーは、直接または間接的に関与カスパーゼ活性細胞死の他の形態をした細胞の回復も追跡できます。したがって、このプロトコルにより、私たちは継続的にこれらの細胞との生物学的機能、分子機構、生理学的および病理学的結果との治療上の含意将来の研究を促進する彼らの子孫の運命を追跡するにはアナスタシスは。また、非アポトーシス カスパーゼ活性のin vivoを表示するからアナスタシスを受けるセルを区別するために適切なコントロールを議論しました。

それは回復した細胞形態学的に区別がつかないためセルを受けた動物では、アナスタシスは識別するために挑戦的なコマ撮りの生細胞顕微鏡検査は、培養細胞20管アナスタシスは信頼性の高い方法は、通常の健康な細胞から、細胞死を試みていません。たとえば、ひと子宮頸癌 HeLa 細胞は細胞死に対してアポトーシス1,2,14細胞の収縮、核の凝縮膜ブレブなどの形態学的特徴を表示します。1 μ m スタウロスポリン17 (図 1 a図 1 b i ii) の刺激。新鮮な培地で培養、細胞死の刺激を除去した後死細胞細胞死のプロセスと、逆にアナスタシスは17,<...

アナスタシスは、細胞死のプロセスを逆転させた細胞は通常の健康な細胞と形態学的区別することができますので、生体内で検出する技術的に困難です。ここでの検出と追跡システムを使用して、新たに開発した生体内でCaspaseTracker バイオ センサー アナスタシスは生きている動物を受ける細胞のプロトコルについて述べる。

アナスタシスはIn Vivo CaspaseTracker バイオ センサーによる検出

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

この手順の全体的な目標は、Drosophila melanogasterをモデルとして使用して、生きた動物におけるカスパーゼ活性化後の細胞死プロセスの逆転を検出し、追跡することです。死の刺激に応答して、細胞はアポトーシスなどのプログラムされた細胞死を受けますが、これは伝統的に細胞死につながる不可逆的なカスケードと考えられてきました。しかし、興味深いことに、死の刺激を取り除いた後、一部の死にかけている細胞は、後期段階でも細胞死プロセスを逆転させることができます。アナスタシスと呼ばれる新たに発見された細胞回収現象を通じて。生細胞顕微鏡法では、アポトーシス死にかけている細胞は、プラスミド膜のブレブ、核の凝縮、細胞の縮小など、独特の形態学的特徴を示すことが示されています。一般的に、これらの細胞は死ぬことが予想されます。しかし、死にかけている細胞を洗浄し、新鮮な培地でインキュベートした後、アナスタシスを経て回復し、後で分裂することができます。生きた動物のアナスタシスを検出して追跡することは困難です。なぜなら、回収された細胞は形態学的に周囲の健康な細胞と区別がつかないからです。この問題を解決するために、哺乳類のCaspaseTrackerバイオセンサーシステムを開発し、アポトーシスの特徴である実行またはカスパーゼ活性化後の細胞死プロセスを逆転させる細胞を特定し、追跡しました。このバイオセンサーシステムは、カスパーゼ活性化トランスアクチベーターであるrtTAと、Cre LoxPベースのrtTA活性レポーターの2つのコンポーネントで構成されています。カスパーゼ活性のない健康な細胞では、rtTAはカスパーゼ切断可能なDEVDリンカーを介して原形質膜アンカーにつながれています。テザーされたrtTAはサイトゾルから核に転座できないため、rtTAレポーターは非アクティブのままです。しかし、細胞死誘導に応答して活性化すると、カスパーゼはDEVDリンカーを切断し、rtTAが解放されて核に移動し、rtTAレポーターを活性化します。核に入ると、rtTAは四面体応答要素(TRE)に結合し、Creリコンビナーゼの一過性発現を誘発し、CAGプロモーターと赤色蛍光タンパク質DsRedのコード配列との間の終止コドンカセットを除去する不可逆的な組換えイベントを引き起こします。これにより、DsRedが永久に発現し、カスパーゼ活性を経験した後も生存し続けることができる細胞とその子孫の永久蛍光マーカーとして機能します。生細胞共焦点顕微鏡法では、一過性細胞死誘導後、CaspaseTrackerバイオセンサー細胞は回復中および回復後にDsRedを発現するため、白矢印で示されている非回復細胞や、細胞死刺激にさらされなかったコントロールバイオセンサー細胞と区別されます。アポトーシスなどのプログラムされた細胞死は、蔓延する大規模な細胞破壊によって実行されるため、一般に不可逆的であると考えられています。しかし、シトクロムcの放出後、カスパーゼ-3の活性化、DNA損傷、原形質膜のブレブ、細胞の縮小、アポトーシス体の形成など、これまで後戻りできないと考えられてきた後期でも、死にかけている細胞は実際には回復できることが分かってきました。私たちは、これらの細胞死プロセスの逆転をアナスタシスと名付けました。これは、ギリシャ語で生命に蘇ることを意味します。生細胞顕微鏡を用いることで、培養細胞のアナスタシスを観察することができます。しかし、生きた動物でアナスタシスを観察することは技術的に困難であり、回収された死細胞は細胞死を全く試みなかった正常な健康な細胞のように見えることがあります。そこで、生きた動物のアナスタシスを検出・追跡するためのCaspaseTrackerバイオセンサーシステムを開発しました。CaspaseTrackerシステムのショウジョウバエバージョンは、カスパーゼ活性化可能な使用転写因子であるGAL4と、G-TRACEとして知られるGAL4活性レポーターの2つのコンポーネントで構成されるデュアルバイオセンサーです。カスパーゼ活性のない細胞では、酵母転写因子であるGAL4が、カスパーゼ切断可能なDQVDリンカーを介して原形質膜アンカードメインにつながれています。カスパーゼが活性化すると、活性化されたカスパーゼはDQVDリンカーを切断してGAL4を放出し、GAL4は核に移動してG-TRACEレポーターを活性化します。核のGAL4は、特定の上流の活性化配列(UAS)に結合して、RFPの一過性発現を誘発し、RFPは、カスパーゼとGAL4の活性が停止してRFPタンパク質が分解されるまで、最近または現在のカスパーゼ活性のレポーターとして機能します。また、GAL4はFLP組換え酵素の発現を誘発し、これにより、ユビキチン(略称:Ubi)プロモーターと核標的GFPのコーティング配列との間のストップカセットを除去する組換えイベントが起こります。これにより、核GFPが永久的に発現し、カスパーゼ活性を経験しながらも生存している細胞とその子孫の永久マーカーとして機能します。したがって、このシステムは、一過性のRFPシグナルによって進行中または最近のカスパーゼ活性を持つ細胞を、永久的なGFPシグナルによる過去のカスパーゼ活性を同定することができます。対照バイオセンサーは、カスパーゼ切断部位にDQVAという変異を有しており、これはカスパーゼ活性に鈍感である。カスパーゼ感受性GAL4バージンハエをG-TRACEの若い雄ハエと交配し、またはその逆を行ったところ、CaspaseTrackerハエが生まれました。カスパーゼ活性化後の細胞死プロセスの可逆性をテストするために、ハエは最初に、コールドショックやタンパク質飢餓などの一時的な細胞死を誘発する環境ストレスにさらされます。その後、ストレスを受けたハエを通常の培養条件に戻して回復させます。組織は、対照、ストレスを受けた、または回復したハエから卵巣の卵室から採取されました。サンプルを共焦点顕微鏡にかけ、CaspaseTrackerバイオセンサーの蛍光シグナルを検出しました。まず、麻酔をかけた、最近閉鎖されたカスパーゼ感受性のDQVD GAL4は、二酸化炭素を使用して飛行し、ペイントブラシで、7〜10人の処女の女性を少量の酵母ペーストが入った生鮮食品のバイアルに移します。雌を7〜10匹の若いG-TRACE GAL4レポーターオスと交配させます。新たに閉じられた処生バエは、幼虫の餌の残骸である矢印で示された濃い緑色の胎便を示しています。新しく閉じたハエは、成熟したハエよりも大きくなる傾向があります。男性の腹部は丸で示されているように暗く、女性よりも小さい傾向があります。GAL4の活性は温度とともに増加するため、子孫のCaspaseTrackerバイオセンサーからの非特異的なシグナルを減らすために、十字架を摂氏18度に設定します。3〜7日ごとに、生産性が低下するまで、成虫をイーストペーストを含む新しいバイアルに移します。子孫が閉じたら、ハエをカスパーゼ感受性GAL4とG-TRACEの両方の導入遺伝子と接続し、CaspaseTrackerの子孫ハエとして機能します。どちらの挿入もCurly-Oによってバランスが取れています。したがって、カーリーではない翼のあるハエは両方の導入遺伝子を持っています。ネガティブコントロールの場合、カスパーゼ非感受性DQVA GAL4雌とG-TRACE GAL4レポーター雄との間の交配から、またはその逆の二重導入遺伝子子孫を採取します。実験的な交配から、新たに閉じた10〜20匹の雌ハエのコホートを酵母ペーストを含む新しいバイアルに移します。いくつかの男性を追加すると、卵の生産のために女性を助けるでしょう。十分に餌を与えたハエを1日摂氏18度に移し、卵巣がOO生成を通じて卵室を生成するようにします。次に、卵室にアポトーシスを起こさせるには、コールドショックを使用します。ハエを餌のない新しいバイアルに移し、摂氏7度で1時間冷凍します。卵室のアポトーシスを誘発する別の方法は、ハエを摂氏18度の8%ショ糖、1%の寒天食品に3日間住まわせることにより、タンパク質飢餓を使用することです。この方法を使用する場合は、タンパク質を含まない食品バイアルを毎日交換してください。いずれかの方法でハエにストレスを与えた後、ハエを通常の住居状態に戻し、酵母ペーストで3日間餌を与えて回復させます。後でこれらのハエを解剖して、卵室と卵巣を分離します。麻酔をかけた後、2対の鉗子を使用して頭を取り除きます。次に、腹部の付け根にあるハエを引っ張って卵巣を取り出します。卵室がピペットの先端にくっつかないように、プラスチック製のピペットチップを水またはPBSに溶解した1%BSAでコーティングして、卵巣を採取する準備をします。卵室を解剖した後、約1/半ミリリットルのPBSで準備した先端にそれらを集めます。次に、それらを1ミリリットルの遠心分離管に移し、卵が落ち着くのを待ちます。蛍光タグの写真退色を防ぐために、暗い場所または完全に暗い条件下で手順を続行してください。PBSを吸引し、PBS中の4%パラホルムアルデヒドを500マイクロリットルを遠心分離管に装填します。卵を室温で20〜30分間、穏やかに回転させて固定します。長時間の固定は、卵腔内の蛍光タンパク質のシグナルを枯渇させるため、避けてください。固定したら、PFAを取り外し、500マイクロリットルのPBS-Tで卵室を3回洗浄します。次に、PBS-Tで卵室を摂氏4度で一晩インキュベートし、穏やかに回転させて卵室を透過化します。翌朝、500マイクロリットルのPBS-Tと5マイクログラムの青い核染料(Hoechstなど)を卵室に加えます。室温で1〜2時間緩やかに回転させてインキュベートさせますが、それ以上はインキュベートしないと、シグナルが非特異的になります。次に、卵室をPBS-Tで3回、1回の洗浄につき10分間洗浄します。その後、細いピペットでPBS-Tを全て吸引し、200マイクロリットルの漂白防止用封入剤を塗布します。ティッシュは、封入剤を完全に吸収する前に上部に浮いています。卵室を薬剤内で摂氏4度で3時間から一晩インキュベートします。封入剤を完全に吸収した後、組織はチューブの底に沈み込み、封入の準備が整います。まず、スライドガラスまたはカバースリップにワセリンを塗布して、過圧縮による卵室破壊を防ぎます。染色卵室を取り付けるには、200マイクロリットルの封入剤でスライドガラスに移し、20平方ミリメートルのガラスカバースリップで覆います。カバースリップをマニキュアで密封し、共焦点顕微鏡を使用して進めます。健康なCaspaseTrackerハエの卵巣の卵室では、CaspaseTrackerバイオセンサーの活性はなく、緑と赤の蛍光が不足していることが示されました。しかし、ハエをタンパク質飢餓などの細胞死を誘発する環境ストレスに3日間さらした後、卵室はカスパーゼ活性化による細胞死プロセスを経験し、RFPおよびGFPバイオセンサーシグナルを誘導しました。対照的に、カスパーゼ非感受性DQVAハエのカスパーゼ切断部位の変異は、バイオセンサー感度を消失させ、バイオセンサーシグナルがカスパーゼ活性に依存していることを示しました。その後、飢餓状態になり、カスパーゼ感受性のバイオセンサーハエに、3日間タンパク質食を与えました。回収されたハエの卵室は、RFP一過性カスパーゼレポーターを発現しておらず、最近または進行中のカスパーゼ活性がないことを示しました。重要なことに、回収された卵室はGFPのみを発現し、カスパーゼ活性化後の細胞死プロセスを逆転させたことを示しています。アナスタシスは、一過性の細胞死を誘発する温度ストレスの後にin vivoでも観察されます。コールドショックに応答して、死にかけている卵室はRFPおよびGFPバイオセンサーマーカーを発現し、RFPシグナルで表される最近または進行中のカスパーゼ活性とGFPシグナルで表される過去のカスパーゼ活性を示します。しかし、3日間通常の培養状態に戻してストレスを解消した後、回収されたハエの卵室にはGFPカスパーゼレポーターのみが表示され、これらの卵室の細胞がカスパーゼ活性化後の時点でアナスタシスを受けたことが示されました。特に、GFP CaspaseTrackerシグナルは、卵腔内の複数の細胞タイプが細胞死プロセスを逆転させ、卵母細胞やナース細胞などの生殖細胞系細胞、体細胞卵胞細胞などのカスパーゼからの損傷を修復できることを明らかにしています。興味深いことに、GFPは、幹細胞を含むゲルマリウム内の細胞と、それに関連する卵室を同じ卵巣鎖に標識しました。したがって、これらのGFP陽性卵室は、アナスタシスを受けた幹細胞に由来している可能性があります。これは、環境ストレスにさらされることなくCaspaseTrackerバイオセンサーの活性を示す組織を示す画像です。これらは、口の部分、前腸、作物、中腸、後腸、マルピーギ尿細管、肛門、卵管、および卵巣であり、解剖され、新たに閉じられた、Day 0の雌のハエからのものです。共焦点顕微鏡法は、RFPで示される最近のカスパーゼ活性とGFPで示される過去のカスパーゼ活性を明らかにします。拡大画像は、視神経葉、噴門、マルピーギ尿細管、後腸、およびF-アクチン染色と共局在する卵腔の筋肉壁における最近または進行中および過去のカスパーゼ活性を示しています。卵管などの一部の組織は、過去のカスパーゼ活性のみを示します。これらのバイオセンサー活性は、胚発生または正常な恒常性維持中の潜在的な麻酔活性を示唆しています。また、現在または過去の非アポトーシス性カスパーゼ活性を示している可能性もあります。詳しくは原稿をご覧ください。in vivo CaspaseTrackerバイオセンサーは、非カスパーゼ切断可能な配列DQVAの鈍感なCaspaseTrackerがバイオセンサー活性を持たないため、カスパーゼ活性を特異的に報告します。ここでの唯一のシグナルは、色素、キューティクル、および脂肪体からの自家蛍光の非特異的シグナルです。このビデオを見れば、CaspaseTrackerバイオセンサーシステムを使用して生きた動物のアナスタシスを検出および追跡する方法について、一般的な理解が得られるはずです。これらのバイオセンサーは、アナスタシスの通貨と既知の機能の研究を容易にすることができます。それらのリーチの同定は、生理学的、病理学的、および治療的用途に幅広く応用されています。これらのバイオセンサーは、カスパーゼ活性化後のアポトーシスの逆転を検出できるだけでなく、カスパーゼ活性が直接的または間接的に関与する他の形態の細胞死を試みた後の細胞の回復も検出できます。実験を設計する際には、麻酔細胞を追跡する蛍光バイオセンサーシグナルと、カスパーゼ活性が進行中の死にかけている細胞を区別するための相互制御を含めることが非常に重要です。現在または過去の既知のアポトーシスカスパーゼ活性と、色素、脂肪、および臨界からの非特異的自己蛍光シグナルを持つ健康な細胞。詳細な議論については、この原稿のPDF版をご覧ください。

detecting-anastasis-in-vivo-by-caspasetracker-biosensor

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アナスタシスはIn Vivo CaspaseTracker バイオセンサーによる検出

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アナスタシスはIn Vivo CaspaseTracker バイオ センサーによる検出

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