アナスタシスはIn Vivo CaspaseTracker バイオ センサーによる検出

この手順の全体的な目標は、Drosophila melanogasterをモデルとして使用して、生きた動物におけるカスパーゼ活性化後の細胞死プロセスの逆転を検出し、追跡することです。死の刺激に応答して、細胞はアポトーシスなどのプログラムされた細胞死を受けますが、これは伝統的に細胞死につながる不可逆的なカスケードと考えられてきました。しかし、興味深いことに、死の刺激を取り除いた後、一部の死にかけている細胞は、後期段階でも細胞死プロセスを逆転させることができます。

アナスタシスと呼ばれる新たに発見された細胞回収現象を通じて。生細胞顕微鏡法では、アポトーシス死にかけている細胞は、プラスミド膜のブレブ、核の凝縮、細胞の縮小など、独特の形態学的特徴を示すことが示されています。一般的に、これらの細胞は死ぬことが予想されます。

しかし、死にかけている細胞を洗浄し、新鮮な培地でインキュベートした後、アナスタシスを経て回復し、後で分裂することができます。生きた動物のアナスタシスを検出して追跡することは困難です。なぜなら、回収された細胞は形態学的に周囲の健康な細胞と区別がつかないからです。この問題を解決するために、哺乳類のCaspaseTrackerバイオセンサーシステムを開発し、アポトーシスの特徴である実行またはカスパーゼ活性化後の細胞死プロセスを逆転させる細胞を特定し、追跡しました。

このバイオセンサーシステムは、カスパーゼ活性化トランスアクチベーターであるrtTAと、Cre LoxPベースのrtTA活性レポーターの2つのコンポーネントで構成されています。カスパーゼ活性のない健康な細胞では、rtTAはカスパーゼ切断可能なDEVDリンカーを介して原形質膜アンカーにつながれています。テザーされたrtTAはサイトゾルから核に転座できないため、rtTAレポーターは非アクティブのままです。

しかし、細胞死誘導に応答して活性化すると、カスパーゼはDEVDリンカーを切断し、rtTAが解放されて核に移動し、rtTAレポーターを活性化します。核に入ると、rtTAは四面体応答要素(TRE)に結合し、Creリコンビナーゼの一過性発現を誘発し、CAGプロモーターと赤色蛍光タンパク質DsRedのコード配列との間の終止コドンカセットを除去する不可逆的な組換えイベントを引き起こします。これにより、DsRedが永久に発現し、カスパーゼ活性を経験した後も生存し続けることができる細胞とその子孫の永久蛍光マーカーとして機能します。

生細胞共焦点顕微鏡法では、一過性細胞死誘導後、CaspaseTrackerバイオセンサー細胞は回復中および回復後にDsRedを発現するため、白矢印で示されている非回復細胞や、細胞死刺激にさらされなかったコントロールバイオセンサー細胞と区別されます。アポトーシスなどのプログラムされた細胞死は、蔓延する大規模な細胞破壊によって実行されるため、一般に不可逆的であると考えられています。しかし、シトクロムcの放出後、カスパーゼ-3の活性化、DNA損傷、原形質膜のブレブ、細胞の縮小、アポトーシス体の形成など、これまで後戻りできないと考えられてきた後期でも、死にかけている細胞は実際には回復できることが分かってきました。

私たちは、これらの細胞死プロセスの逆転をアナスタシスと名付けました。これは、ギリシャ語で生命に蘇ることを意味します。生細胞顕微鏡を用いることで、培養細胞のアナスタシスを観察することができます。しかし、生きた動物でアナスタシスを観察することは技術的に困難であり、回収された死細胞は細胞死を全く試みなかった正常な健康な細胞のように見えることがあります。

そこで、生きた動物のアナスタシスを検出・追跡するためのCaspaseTrackerバイオセンサーシステムを開発しました。CaspaseTrackerシステムのショウジョウバエバージョンは、カスパーゼ活性化可能な使用転写因子であるGAL4と、G-TRACEとして知られるGAL4活性レポーターの2つのコンポーネントで構成されるデュアルバイオセンサーです。カスパーゼ活性のない細胞では、酵母転写因子であるGAL4が、カスパーゼ切断可能なDQVDリンカーを介して原形質膜アンカードメインにつながれています。

カスパーゼが活性化すると、活性化されたカスパーゼはDQVDリンカーを切断してGAL4を放出し、GAL4は核に移動してG-TRACEレポーターを活性化します。核のGAL4は、特定の上流の活性化配列(UAS)に結合して、RFPの一過性発現を誘発し、RFPは、カスパーゼとGAL4の活性が停止してRFPタンパク質が分解されるまで、最近または現在のカスパーゼ活性のレポーターとして機能します。また、GAL4はFLP組換え酵素の発現を誘発し、これにより、ユビキチン(略称:Ubi)プロモーターと核標的GFPのコーティング配列との間のストップカセットを除去する組換えイベントが起こります。

これにより、核GFPが永久的に発現し、カスパーゼ活性を経験しながらも生存している細胞とその子孫の永久マーカーとして機能します。したがって、このシステムは、一過性のRFPシグナルによって進行中または最近のカスパーゼ活性を持つ細胞を、永久的なGFPシグナルによる過去のカスパーゼ活性を同定することができます。対照バイオセンサーは、カスパーゼ切断部位にDQVAという変異を有しており、これはカスパーゼ活性に鈍感である。

カスパーゼ感受性GAL4バージンハエをG-TRACEの若い雄ハエと交配し、またはその逆を行ったところ、CaspaseTrackerハエが生まれました。カスパーゼ活性化後の細胞死プロセスの可逆性をテストするために、ハエは最初に、コールドショックやタンパク質飢餓などの一時的な細胞死を誘発する環境ストレスにさらされます。その後、ストレスを受けたハエを通常の培養条件に戻して回復させます。

組織は、対照、ストレスを受けた、または回復したハエから卵巣の卵室から採取されました。サンプルを共焦点顕微鏡にかけ、CaspaseTrackerバイオセンサーの蛍光シグナルを検出しました。まず、麻酔をかけた、最近閉鎖されたカスパーゼ感受性のDQVD GAL4は、二酸化炭素を使用して飛行し、ペイントブラシで、7〜10人の処女の女性を少量の酵母ペーストが入った生鮮食品のバイアルに移します。

雌を7〜10匹の若いG-TRACE GAL4レポーターオスと交配させます。新たに閉じられた処生バエは、幼虫の餌の残骸である矢印で示された濃い緑色の胎便を示しています。新しく閉じたハエは、成熟したハエよりも大きくなる傾向があります。

男性の腹部は丸で示されているように暗く、女性よりも小さい傾向があります。GAL4の活性は温度とともに増加するため、子孫のCaspaseTrackerバイオセンサーからの非特異的なシグナルを減らすために、十字架を摂氏18度に設定します。3〜7日ごとに、生産性が低下するまで、成虫をイーストペーストを含む新しいバイアルに移します。

子孫が閉じたら、ハエをカスパーゼ感受性GAL4とG-TRACEの両方の導入遺伝子と接続し、CaspaseTrackerの子孫ハエとして機能します。どちらの挿入もCurly-Oによってバランスが取れています。したがって、カーリーではない翼のあるハエは両方の導入遺伝子を持っています。

ネガティブコントロールの場合、カスパーゼ非感受性DQVA GAL4雌とG-TRACE GAL4レポーター雄との間の交配から、またはその逆の二重導入遺伝子子孫を採取します。実験的な交配から、新たに閉じた10〜20匹の雌ハエのコホートを酵母ペーストを含む新しいバイアルに移します。いくつかの男性を追加すると、卵の生産のために女性を助けるでしょう。

十分に餌を与えたハエを1日摂氏18度に移し、卵巣がOO生成を通じて卵室を生成するようにします。次に、卵室にアポトーシスを起こさせるには、コールドショックを使用します。ハエを餌のない新しいバイアルに移し、摂氏7度で1時間冷凍します。

卵室のアポトーシスを誘発する別の方法は、ハエを摂氏18度の8%ショ糖、1%の寒天食品に3日間住まわせることにより、タンパク質飢餓を使用することです。この方法を使用する場合は、タンパク質を含まない食品バイアルを毎日交換してください。いずれかの方法でハエにストレスを与えた後、ハエを通常の住居状態に戻し、酵母ペーストで3日間餌を与えて回復させます。

後でこれらのハエを解剖して、卵室と卵巣を分離します。麻酔をかけた後、2対の鉗子を使用して頭を取り除きます。次に、腹部の付け根にあるハエを引っ張って卵巣を取り出します。

卵室がピペットの先端にくっつかないように、プラスチック製のピペットチップを水またはPBSに溶解した1%BSAでコーティングして、卵巣を採取する準備をします。卵室を解剖した後、約1/半ミリリットルのPBSで準備した先端にそれらを集めます。次に、それらを1ミリリットルの遠心分離管に移し、卵が落ち着くのを待ちます。

蛍光タグの写真退色を防ぐために、暗い場所または完全に暗い条件下で手順を続行してください。PBSを吸引し、PBS中の4%パラホルムアルデヒドを500マイクロリットルを遠心分離管に装填します。卵を室温で20〜30分間、穏やかに回転させて固定します。

長時間の固定は、卵腔内の蛍光タンパク質のシグナルを枯渇させるため、避けてください。固定したら、PFAを取り外し、500マイクロリットルのPBS-Tで卵室を3回洗浄します。次に、PBS-Tで卵室を摂氏4度で一晩インキュベートし、穏やかに回転させて卵室を透過化します。

翌朝、500マイクロリットルのPBS-Tと5マイクログラムの青い核染料(Hoechstなど)を卵室に加えます。室温で1〜2時間緩やかに回転させてインキュベートさせますが、それ以上はインキュベートしないと、シグナルが非特異的になります。次に、卵室をPBS-Tで3回、1回の洗浄につき10分間洗浄します。

その後、細いピペットでPBS-Tを全て吸引し、200マイクロリットルの漂白防止用封入剤を塗布します。ティッシュは、封入剤を完全に吸収する前に上部に浮いています。卵室を薬剤内で摂氏4度で3時間から一晩インキュベートします。

封入剤を完全に吸収した後、組織はチューブの底に沈み込み、封入の準備が整います。まず、スライドガラスまたはカバースリップにワセリンを塗布して、過圧縮による卵室破壊を防ぎます。染色卵室を取り付けるには、200マイクロリットルの封入剤でスライドガラスに移し、20平方ミリメートルのガラスカバースリップで覆います。

カバースリップをマニキュアで密封し、共焦点顕微鏡を使用して進めます。健康なCaspaseTrackerハエの卵巣の卵室では、CaspaseTrackerバイオセンサーの活性はなく、緑と赤の蛍光が不足していることが示されました。しかし、ハエをタンパク質飢餓などの細胞死を誘発する環境ストレスに3日間さらした後、卵室はカスパーゼ活性化による細胞死プロセスを経験し、RFPおよびGFPバイオセンサーシグナルを誘導しました。

対照的に、カスパーゼ非感受性DQVAハエのカスパーゼ切断部位の変異は、バイオセンサー感度を消失させ、バイオセンサーシグナルがカスパーゼ活性に依存していることを示しました。その後、飢餓状態になり、カスパーゼ感受性のバイオセンサーハエに、3日間タンパク質食を与えました。回収されたハエの卵室は、RFP一過性カスパーゼレポーターを発現しておらず、最近または進行中のカスパーゼ活性がないことを示しました。

重要なことに、回収された卵室はGFPのみを発現し、カスパーゼ活性化後の細胞死プロセスを逆転させたことを示しています。アナスタシスは、一過性の細胞死を誘発する温度ストレスの後にin vivoでも観察されます。コールドショックに応答して、死にかけている卵室はRFPおよびGFPバイオセンサーマーカーを発現し、RFPシグナルで表される最近または進行中のカスパーゼ活性とGFPシグナルで表される過去のカスパーゼ活性を示します。

しかし、3日間通常の培養状態に戻してストレスを解消した後、回収されたハエの卵室にはGFPカスパーゼレポーターのみが表示され、これらの卵室の細胞がカスパーゼ活性化後の時点でアナスタシスを受けたことが示されました。特に、GFP CaspaseTrackerシグナルは、卵腔内の複数の細胞タイプが細胞死プロセスを逆転させ、卵母細胞やナース細胞などの生殖細胞系細胞、体細胞卵胞細胞などのカスパーゼからの損傷を修復できることを明らかにしています。興味深いことに、GFPは、幹細胞を含むゲルマリウム内の細胞と、それに関連する卵室を同じ卵巣鎖に標識しました。

したがって、これらのGFP陽性卵室は、アナスタシスを受けた幹細胞に由来している可能性があります。これは、環境ストレスにさらされることなくCaspaseTrackerバイオセンサーの活性を示す組織を示す画像です。これらは、口の部分、前腸、作物、中腸、後腸、マルピーギ尿細管、肛門、卵管、および卵巣であり、解剖され、新たに閉じられた、Day 0の雌のハエからのものです。

共焦点顕微鏡法は、RFPで示される最近のカスパーゼ活性とGFPで示される過去のカスパーゼ活性を明らかにします。拡大画像は、視神経葉、噴門、マルピーギ尿細管、後腸、およびF-アクチン染色と共局在する卵腔の筋肉壁における最近または進行中および過去のカスパーゼ活性を示しています。卵管などの一部の組織は、過去のカスパーゼ活性のみを示します。

これらのバイオセンサー活性は、胚発生または正常な恒常性維持中の潜在的な麻酔活性を示唆しています。また、現在または過去の非アポトーシス性カスパーゼ活性を示している可能性もあります。詳しくは原稿をご覧ください。

in vivo CaspaseTrackerバイオセンサーは、非カスパーゼ切断可能な配列DQVAの鈍感なCaspaseTrackerがバイオセンサー活性を持たないため、カスパーゼ活性を特異的に報告します。ここでの唯一のシグナルは、色素、キューティクル、および脂肪体からの自家蛍光の非特異的シグナルです。このビデオを見れば、CaspaseTrackerバイオセンサーシステムを使用して生きた動物のアナスタシスを検出および追跡する方法について、一般的な理解が得られるはずです。

これらのバイオセンサーは、アナスタシスの通貨と既知の機能の研究を容易にすることができます。それらのリーチの同定は、生理学的、病理学的、および治療的用途に幅広く応用されています。これらのバイオセンサーは、カスパーゼ活性化後のアポトーシスの逆転を検出できるだけでなく、カスパーゼ活性が直接的または間接的に関与する他の形態の細胞死を試みた後の細胞の回復も検出できます。

実験を設計する際には、麻酔細胞を追跡する蛍光バイオセンサーシグナルと、カスパーゼ活性が進行中の死にかけている細胞を区別するための相互制御を含めることが非常に重要です。現在または過去の既知のアポトーシスカスパーゼ活性と、色素、脂肪、および臨界からの非特異的自己蛍光シグナルを持つ健康な細胞。詳細な議論については、この原稿のPDF版をご覧ください。