マウスの小腸リンパ球の単離およびフローサイトメトリーキャラクタリゼーション

この手順の全体的な目標は、異なる小腸コンパートメントから単一細胞集団を単離し、その後、フローサイトメトリー分析または特性評価の代替手段に使用できるようにすることです。この方法は、微生物叢が腸管免疫系の発達にどのように影響するかなど、粘膜免疫学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、迅速で再現性があり、面倒なパーコール勾配を必要としないことです。

この手順を開始するには、マウスの背側を下にして腹部に70%のエタノールをスプレーし、恥骨結合から剣状突起までの腹側正中線に沿って皮膚を順番に切断し、次に腹膜筋膜を順番に切断して開腹術を行い、腹腔を露出させます。次に、幽門括約筋を横断することにより、小腸を胃から分離します。腹膜から小腸をそっと取り除き、腸間膜脂肪を引き出します。

小腸を完全に除去するには、回盲接合部で2回目の切開を行います。単離した小腸を10%のFBSを含む摂氏4度のRPMI培地に入れて、細胞の生存率を最大化します。湾曲した鉗子を使用して大きな脂肪片を優しく取り除き、プロセス中に腸組織自体を引き裂かないように注意します。

腸の内容物を取り除くには、注射器に取り付けられた18ゲージの栄養針で小腸の近位端をカニューレし、15〜20ミリリットルの冷たいPBSで腸を穏やかに洗い流します。はさみを使用して、小腸の嫌悪性側に位置し、多葉性の白い塊として現れるパイエル板を切除します。次に、5%のFBSを含む冷たいRPMI培地に入れます。

次に、小腸を3〜4インチのセグメントに切り、RPMIで湿らせたペーパータオルで各小腸セグメントを転がして残留脂肪を取り除き、鈍いメスを使用して組織から脂肪をからかいます。腸間膜脂肪の完全な除去に細心の注意を払うことは、脂肪の微細な断片でさえ細胞を死滅させる可能性があるため、リンパ球の生存率を確保するために重要です。その後、湾曲した鉗子で腸管をカニューレで流し、組織の遠位端をつかんで組織を裏返しにした後、一対のまっすぐな鉗子を使用して組織セグメントを近位端からそっと取り除き、組織を反転させます。

30ミリリットルの抽出媒体と攪拌棒が入ったカップに組織セグメントを置きます。キャップの蓋を固定し、摂氏37度で15分間かき混ぜます。攪拌は激しく行う必要がありますが、乱流ではありません。

15分後、スチール製のストレーナーを使用して、曇ったように見えるはずの上清を含む上皮から組織片を分離します。RPMI培地で組織片を手動で攪拌し、残留抽出培地を洗い流します。次に、ティッシュを乾いたペーパータオルの上に置き、数回裏返して、抽出媒体によって放出されなかった残留粘液の除去を促進します。

その後、組織片を600マイクロリットルの消化培地を含む1点5ミリリットルのチューブに入れます。ピースがハサミにくっつかなくなり、溶液が均一に見えるまで、組織をミンチにします。このステップは、組織の完全な酵素消化を確実にするために重要です。

破片がハサミにくっつかなくなり、溶液が均一に見えるまで組織をミンチすることは、細胞の収量を確保し、結果の再現性を確保するために重要です。みじん切りにした小腸を25ミリリットルの消化培地が入ったカップに加え、摂氏37度で30分間攪拌します。消化の途中で、血清学的ピペットで上下にパイプでつなぎ、組織の大きな塊を分解します。

次に、100マイクロメートルのセルストレーナーを介して消化組織をろ過し、15ミリリットルのチューブに入れます。10%のFBSを含む20ミリリットルのRPMI培地でストレーナをすすぎます。その後、ろ過した溶液を摂氏4度で10分間遠心分離します。

上清を慎重にデカントし、10%のFBSを含む1ミリリットルのRPMI培地にペレットを再懸濁します。再懸濁した細胞を40マイクロメートルのセルストレーナーでろ過し、15ミリリットルのチューブに入れます。10%のFBSを含む20ミリリットルのRPMIでストレーナーをすすぎます。

続いて、ろ過した溶液を摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を慎重にデカントし、2%のFBSを含む1ミリリットルのRPMI培地にペレットを再懸濁します。この手順では、切除したパイエルパッチを25ミリリットルの消化媒体と攪拌棒を入れたカップに移します。.

蓋をしっかり閉め、37°Cで10分間回転させます。その後、消化されたパイエルパッチを40マイクロメートルのセルストレーナーで15ミリリットルのチューブにろ過します。塊が残っている場合は、1ミリリットルの注射器からプランジャーの平らな端を使用してストレーナーに押し込みます。

次に、10%のFBSを含む10ミリリットルのRPMI培地でストレーナーをすすぎます。ろ過した溶液を摂氏4度で10分間遠心分離します。次に、上清を慎重にデカントし、2%のFBSを含む1ミリリットルのRPMI培地にペレットを再懸濁します。

小腸リンパ球の単一細胞懸濁液のフローサイトメトリー解析により、脾細胞と同様の前方散乱および側方散乱特性を持つ細胞の目立たない集団が得られるはずです。単離の初期段階で組織が摂氏4度に維持されない場合、リンパ球は死滅し始める可能性があり、その結果、リンパ球集団の前方散乱が少なくなり、他の上皮細胞および死細胞から分離することがより困難になります。さらに、腸間膜脂肪が小腸組織から完全に除去されない場合、リンパ球は事実上完全に失われます。

通常、小腸LPリンパ球の生存率は80%です。習得すれば、4匹のマウスを処理し、4時間以内に1細胞懸濁液を染色することができます。この手順では、すべての腸間膜脂肪を完全に除去し、組織をよくミンチして完全な消化を確保することが重要です。

この手順に従うと、シングルセル懸濁液は、エビトロ実験、遺伝子発現解析、養子導入など、フローサイトメトリー以外の目的に使用して、これらの細胞の機能をさらに特徴付けることができます。この技術の開発後、この技術は、粘膜免疫学の研究者がマウスの腸管免疫系の個体発生と機能的意味を探求する道を開きました。このビデオを見た後、腸間膜脂肪を洗浄し、上皮層を抽出し、コラゲナーゼで組織を消化することにより、さまざまな小腸コンパートメントから単一細胞懸濁液を分離する方法を十分に理解しているはずです。