光安定シアニン色素を用いた波長シフトDNAハイブリダイゼーションプローブの合成

この実験の全体的な目的は、ある色素修飾DNA鎖から別のDNA鎖へのエネルギー転移を可視化することです。この手法は、生細胞内におけるsiRNAのプロセシングや完全性をリアルタイムでモニタリングすることによるRNA干渉など、分子生物学分野における重要な課題の解明に寄与します。

この手法の主な利点は、蛍光の広がりと色の変化を容易にモニタリングでき、明確な結果が得られることです。これにより、偽陽性の結果が排除されます。この手順を開始するには、マグネチックスターラーと還流冷却器を備えた20 milliliterの丸底フラスコに、テキストプロトコルに記載されている適切な試薬を加えます。

次に、0.06 mLのピペリジンを添加します。そして、反応混合物を80 °Cで4時間加熱します。反応液が室温まで冷却した後、得られた沈殿物をろ過により回収します。

ジエチルエーテルで3回洗浄します。次に、上澄液に100 mLのジエチルエーテルを加えます。そして、生じた沈殿物をろ過により回収します。

ジエチルエーテルで3回洗浄した後、沈殿物を最初のろ過で得られた固体と合わせます。DNAシンセサイザーに接続されたコンピュータを使用し、目的のDNA配列とカップリング法を入力します。メーカーのプロトコルの指示に従ってください。

次に、1 µmolの第一面で修飾された、コントロールドポアガラスを含むカラムをシンセサイザーにセットします。続いて、DNAシンセサイザーで合成を開始します。DNAストランドのワークアップ後、テキストプロトコルに記載されている適切な試薬を、ジエチル化アルキンで修飾したDNAサンプルに添加します。

サンプルを60 °Cで1.5時間インキュベートします。その後、サンプルを10 mLチューブに移します。室温まで冷却した後、DNAサンプルに0.05 M EDTA二ナトリウム塩溶液150 µLと0.3 M 酢酸ナトリウム溶液450 µLを加えます。

その後、サンプルに10 mLのエタノールを加えます。そして-32 °Cで16時間保持します。次に、サンプルを1,000 ×gで15分間遠心分離します。終了後、上清を除去します。

得られたDNAペレットを2 mLの冷えた80% ethanolで洗浄します。次に、凍結乾燥機を用いて減圧下でペレットを乾燥させます。粗DNAペレットをHPLCで精製します。ランのモニタリングは、260 nmおよびDye one用の459 nmで確認してください。

または、Dye twoの場合は542 nmを使用します。両方の波長チャンネルで吸収を示す画分を回収します。単鎖吸収分光測定では、200 mM 塩化ナトリウムと50 mM リン酸ナトリウム緩衝液のみを含むブランク測定を記録してください。

次に、あらかじめ調製したDNA1溶液を1 cmの石英ガラスキュベットに移します。吸光度を記録し、染料の最大吸収値を決定します。

単鎖蛍光分光測定を行うため、Dye 1の励起波長を用い、200 millimolar 塩化ナトリウムと50 millimolar リン酸ナトリウムのみを含むブランク測定値を記録します。その後、DNA1溶液を入れたキュベットを分光光度計にセットし、蛍光スペクトルを記録します。

二本鎖の蛍光分光測定を行うには、DNA1とDNA2の二本鎖溶液が入ったキュベットを分光光度計に設置します。次に、Dye oneの励起波長を用いて蛍光スペクトルを記録します。記録されたスペクトルの内容をより深く理解するために、ハンドヘルドUVランプでキュベットを照射してください。

一本鎖DNAから二本鎖DNAへの蛍光色の変化を観察します。記録された吸収スペクトルでは、一本鎖DNA1は465 nanometersに、一本鎖DNA2は546 nanometersに極大値を示しています。アニールさせたDNA1とDNA2の二本鎖では、469 nanometersと567 nanometersの両方に極大値が見られます。

両方の吸収極大にバソクロミックシフトが見られます。また、最小限の分光学的変化は、二重らせんDNA構造内における色素間のエキシトン相互作用の結果です。対応する蛍光スペクトルでは、単鎖DNA1において537 nanometersに極大を示します。

一本鎖DNA2では607 nanometersに、アニールさせたDNA1とDNA2の二本鎖では615 nanometersにピークが見られます。DNA1とDNA2の二本鎖では、Dye oneを選択的に励起させたにもかかわらず、Dye twoの最大蛍光放出のみが観察されました。これは、Dye oneからDye twoへ効率的にエネルギー転移が起こっていることを証明しています。

このビデオを視聴することで、アルキン修飾DNAストランドとA側とのいくつかの触媒反応によって、DNAを合成的に修飾する方法について十分に理解できるはずです。