Name: 光安定シアニン色素を用いた波長シフトDNAハイブリダイゼーションプローブの合成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学ぶ光安定シアニン色素を用いた波長シフトDNAハイブリダイゼーションプローブの合成法。クリック化学によるDNA標識と蛍光エネルギー移動を可視化し、分子イメージングや核酸相互作用のリアルタイム観察に応用できます。

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ドイツ学術協会（DFG、ワ1386 / 17-1）によって財政支援、研究研修グループGRK 2039（DFGが資金提供）およびKITは深く感謝されています。

注意：使用する前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。これらの合成に使用される化学物質のいくつかは、毒性および発癌性があります。典型的には、実験室のコートを着て安全メガネや手袋などの有機化学研究室で必要とされるすべての適切な安全対策を使用してください。 染料の1の合成注：両方の色素は、反応の同じタイプによって合成することができる。図2は、これらの反応の概要を示します。 <ol><li> 1-（3-アジドプロピル）-4-（2-（1-メチル-1H-インドール-3-イル）ビニル）ピリジン-1-イウムヨウ化物（染料1）の合成 <ol><li> 1-（3-ヨードプロピル）-4-メチルピリジン-1-イウムヨウ化物の合成（図2（a）は、工程a） <ol><li> 466 mgの4-ピコリンと20ミリリットルのヘッドスペースバイアル中のアセトニトリルの10ミリリットル中5.91グラムの1,3-ジヨードプロパンを溶解し、セプタムキャップでしっかり密封。 </li><li> 16時間85℃に加熱します。 </li><li>その後、室温まで冷却し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去することを可能にします。 </li><li>残油に酢酸エチル20mlを加え、3分間120 W超音波浴中の混合物を扱います。 </li><li>濾過により形成された沈殿物を回収し、酢酸エチルで5回洗浄します。真空O / Nの下で固体生成物を乾燥させます。 </li></ol></li><li> 1-（3-アジドプロピル）-4-メチルピリジン-1-イウム（図2A、ステップb）の合成 <ol><li> 、20ミリリットルのヘッドスペースバイアル中のアセトニトリルの12ミリリットル中に900mgの1-（3-ヨードプ​​ロピル）-4-メチルピリジン-1-イウムヨウ化を溶解し、アジ化ナトリウムの376ミリグラムを追加し、セプタムキャップでしっかり密封。 </li><li> 16時間85℃に加熱します。 </li><li>その後、室温まで冷却し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去することを可能にします。 </li><li>残渣にジクロロメタンの15ミリリットルを追加します。 </li><li>オフフィルターと得られた沈殿物を捨てます。 </li><li>腐敗を用いて減圧下で溶媒を除去進蒸発は、褐色の油状物として生成物を得ました。 </li></ol></li><li> 1-メチル-1H-インドール-3-カルバルデヒド（図2A、ステップc）の合成 <ol><li>不活性ガス（アルゴン）下で、還流冷却器を備えた50ml丸底フラスコ中の10 mlの無水ジメチルホルムアミド1.45グラムインドール-3-カルバルデヒド1.52グラムの炭酸カリウム2.70グラムのジメチルカーボネートを溶解します。 </li><li> 19時間130℃で混合物を攪拌します。 </li><li>その後、氷の上に混合物を注ぐ、室温まで冷却します。 </li><li>水層を150 mLの酢酸エチルで3回抽出します。 </li><li>有機層を合わせ、水でそれらを洗浄し、硫酸ナトリウム上でそれらを乾燥し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下50℃で溶媒を除去します。 </li></ol></li><li> カップリングの1-（3-アジドプロピル）-4-（2-（1-メチル-1H-インドール-3-イル）ビニル）ピリジン-1-イウムヨウ化物（染料1）（図2A、ステップd） <ol><li>アルゴン下、湿気の排除下で働きます。 Dissol還流冷却器を備えた20 mL丸底フラスコ中で4 mlのエタノール中に90mgの1-（3-アジドプロピル）-4-メチルピリジン-1-イウム及び48mgの1-メチル-1H-インドール-3-カルバルデヒドまし。 </li><li> 4時間80℃に0.07ミリリットルピペリジンと熱を追加します。 </li><li> RTに冷却します。 </li><li>濾過により得られた沈殿物を収集し、ジエチルエーテルで3回洗浄します。 </li><li>上澄み液にジエチルエーテルを加え、濾過により得られた沈殿物を収集します。ジエチルエーテルで3回洗浄します。 </li><li>沈殿物を組み合わせます。 </li></ol></li></ol></li><li> 1-（3-アジドプロピル）の合成-4-（2-（1-メチル-2-フェニル-1H-インドール-3-イル）ビニル）キノリン-1-イウムヨウ化物（色素2） <ol><li> 1-（3-ヨードプロピル）-4-メチルキノリン-1-イウムヨウ化物の合成は、（図2Bには、工程a） <ol><li> 715 mgの4 - メチルキノリン及び20ミリリットルのヘッドスペースバイアル中のアセトニトリルの10ミリリットル中5.91グラムの1,3-ジヨードプロパンを溶解し、セプタムキャップでしっかり密封。 </li><li>熱16時間85℃です。 </li><li>その後、室温まで冷却し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去することを可能にします。 </li><li>残りの油を酢酸エチル20mlを加え、3分間120 W超音波浴中の混合物を扱います。 </li><li>濾過により形成された沈殿物を回収し、酢酸エチルで5回洗浄します。真空O / Nの下で固体生成物を乾燥させます。 </li></ol></li><li> 1-（3-アジドプロピル）-4-メチルキノリン-1-イウムの合成（図2B、ステップb） <ol><li> 、20ミリリットルのヘッドスペースバイアル中のアセトニトリルの12ミリリットル中に900mgの1-（3-ヨードプ​​ロピル）-4-メチルキノリン-1-イウムヨウ化を溶解し、アジ化ナトリウムの333ミリグラムを追加し、セプタムキャップでしっかり密封。 </li><li> 16時間85℃に加熱します。 </li><li>その後、室温まで冷却し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去することを可能にします。 </li><li>残渣にジクロロメタンの15ミリリットルを追加します。 </li><li>オフフィルターと得られた沈殿物を捨てます。 </li><li>溶剤のuを削除しますファインダー褐色の油状物として生成物を得るために、ロータリーエバポレーターを使用して圧力を減少させました。 </li></ol></li><li> 1-メチル-2-フェニル-1H-インドール-3-カルバルデヒドの合成（図2B、ステップc） <ol><li>不活性ガス（アルゴン）下で、還流冷却器を備えた50ml丸底フラスコ中の10 mlの無水ジメチルホルムアミド1.45 G 2フェニル-1H-インドール-3-カルバルデヒド、0.996グラムの炭酸カリウム1.77グラムのジメチルカーボネートを溶解します。 </li><li> 19時間130℃で混合物を攪拌します。 </li><li>その後、氷の上に混合物を注ぐ、室温まで冷却します。 </li><li>水層を150 mLの酢酸エチルで3回抽出します。 </li><li>有機層を合わせ、水でそれらを洗浄し、硫酸ナトリウム上でそれらを乾燥し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去します。 </li></ol></li><li> 1-への結合（3-アジドプロピル）-4-（2-（1-メチル-2-脱pheニル-1H-インドール-3-イル）ビニル）キノリン-1-イウムヨウ化物（図2B、ステップd） <ol><li> argの下での作業上と水分の排除下で。を備えた20 mL丸底フラスコ中で4 mlのエタノール中に90mgの1-（3-アジドプロピル）-4-メチルキノリン-1-イウム及び59.7 mgの1-メチル-2-フェニル-1H-インドール-3-カルバルデヒドを溶解還流冷却器。 </li><li> 4時間80℃に0.06ミリリットルピペリジンと熱を追加します。 </li><li> RTに冷却します。 </li><li>濾過により得られた沈殿物を収集し、ジエチルエーテルで三回洗浄します。 </li><li>上澄み液にジエチルエーテルを加え、濾過により得られた沈殿物を収集します。ジエチルエーテルで3回洗浄します。 </li><li>沈殿物を組み合わせます。 </li></ol></li></ol></li></ol> DNAストランドの2合成注：DNA合成機でM.カルザース11で説明したようにDNA鎖の合成は、固相上のホスホルアミダイト法を用いて行われます。シンセサイザーの機能は、合成手順の前にテストされ、試薬があれば更新します必要。 <ol><li> Prearrangements <ol><li>アミダイト希釈剤（余分な乾燥アセトニトリル）の1.2ミリリットルで、市販の2&#39;-O-プロパルギルdeoxyuridinephosphoramidite（CU）を溶解します。シンセサイザーバイアルにバイアルにソリューションを移動して、シンセサイザーにねじ込み。 </li><li>何のアルゴンガス漏れがないことを確認する（製造者の指示に従って）、「リークテスト」を実行します。 「リークテスト」が失敗した場合は、より緊密にバイアルにねじ込みます。 </li><li>プライム固相合成室に接続する管を充填することによりCuのソリューション。 </li><li>アセトニトリルですべての行を洗ってください。 </li></ol></li><li> DNA鎖の合成 <ol><li>製造業者のプロトコルからの指示に従って、DNA配列との結合方法を入力するように接続されたコンピュータを使用してください。 CUビルディングブロックのカップリング工程は、従来の7パルスで40秒に比べ7パルス（各パルスは16マイクロリットルである）で168秒を要しビルディングブロックとしてホスホラミダイト。 </li><li>シンセサイザーに最初の塩基（DNA合成は、3 &#39;から5&#39;から行われる）の1マイクロモルで修飾されている固相としてCPG（孔制御ガラス）を含むカラムをマウントします。 </li><li> DNA合成11上の合成を開始します。 </li></ol></li><li> 合成されたDNA鎖の後処理 <ol><li>真空O / Nの下で合成されたDNA鎖の列を乾かします。 </li><li>列を開き、反応バイアルにCPGを解放するためにピンセットを使用してください。オリゴヌクレオチドを​​脱保護し、CPGからDNA鎖を解放するために濃アンモニア水溶液700μlのを追加します。 </li><li> 18時間50℃にバイアルを閉じて、破裂を防ぐために、反応容器にセキュリティ蓋を適用し、熱。 </li><li> 30℃で30分間減圧（100ミリバール）下での遠心分離によってアンモニアを除去。 </li><li> CPGからろ過を開始します。遠心分離容器を11,000×gでFOでR 3分。上清を取り、孔径0.45μmの遠心分離装置にそれを転送します。 4分1,000×gで遠心分離します。 </li><li>一方CPG、3分間、11,000×gで20秒間遠心のための渦に蒸留水300μlを添加します。 4分間の千×gで遠心分離装置及び遠心分離に上清を移します。 2回洗浄手順を繰り返します。 </li><li> 0.1ミリバールと25°CO / Nで遠心分離することにより、合わせた水溶液から水を除去します。 </li></ol></li></ol> 3.「クリック」の手順<ol><li> 、アスコルビン酸ナトリウム溶液（水中0.4 M）を25μl、50μlの34μlのトリスを二重蒸留水を追加 - [（1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル）メチル]アミン（0.1 DMSO中のM / tBuOH 3：アジ化物の1）、114μL（0.01 DMSO中のM / tBuOH 3：1）およびテトラキス17μlの（アセトニトリル）銅（I）ヘキサフルオロリン酸溶液（0.1 DMSO中のM / tBuOH 3： 1）凍結乾燥されたアルキン修飾DNAサンプルへ。 </l私&gt; <li> 1.5時間、60℃でサンプルをインキュベートします。 </li><li> RTに冷却します。 </li><li> DNAサンプルと10ミリリットルチューブへの転送に150μlののNa 2 EDTA（水中の0.05 M）および450μlの酢酸ナトリウム（水中の0.3 M）を追加します。 </li><li> 10ミリリットルのエタノール（100％）を加え、16時間、-32℃で保管してください。 </li><li>千×gで15分間遠心分離容器、上清を除去します。 </li><li> 2ミリリットルの冷エタノール（80％）でDNAペレットを洗浄します。 </li><li>減圧下で乾燥したペレット。 </li></ol> 4. HPLC精製注：HPLCは正常に動作していることを確認するDNAの鎖を分離する前に、十分な溶媒が利用可能で、列がきれいです。バッファ/アセトニトリルの出発濃度でカラムを洗浄します。 <ol><li>二重蒸留水250μlの粗DNAペレットを溶解し、HPLCバイアルに移します。 </li><li>染料1およびgradiのためにアセトニトリルの15％、0％アセトニトリルの勾配で45分のHPLCの実行を開始します<html>色素2のアセトニトリルの17％、0％のアセトニトリルの耳鼻咽喉科を、260nm（DNA吸収）と459 nmの（染料1）または542 nmの（色素2）をチェックすることによって実行を監視します。両方の波長チャネルでの吸収を示し、それらの画分を収集します。 </li><li> 3-ヒドロキシ酸（3HPA）とdiammoniumhydrogencitrateからなる行列を使用して、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）質量分析法によって権利質量のために集めた画分を確認してください。 <ol><li>水中のdiammoniumhydrogencitrate溶液（100グラム/ L）100μlのアセトニトリルと水の1：1混合物に飽和3-HPA溶液を900μLを混合することにより、マトリックスを準備します。 </li><li>ターゲット上のDNAプローブのピペット1-2μlを、空気にそれを乾燥させてください。 </li><li>サンプルに3-HPA / diammoniumhydrogencitrate行列の0.2μlを添加して、それが結晶化するまで混合します。 </li><li> MALDI質量分析を実行します。 </li><li>右の質量を示すそれらのHPLC画分を兼ね備えています。 </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 5。濃度​​の決意注：濃縮は、DNA塩基と色素の吸光係数（ε260）に基づいて、UV /可視分光光度計を用いて260nmでの吸収を測定することによって決定されます。 <ol><li>二重蒸留水200μlの - 100でDNAを溶解します。 </li><li> UV /可視分光光度計でのDNA溶液1μlを適用します。 </li><li> 260nmの吸収を測定します。 3回繰り返します。 </li><li>溶液の濃度を計算するために平均値をとります。吸光係数の計算のために、全体のDNA鎖のεの260nmのを得るために4つの天然塩基12のε260nmのと（自然ウリジンとみなす）を購入ビルディングブロックCUのεの260nmの 12を使用します 。染料1については、使用率ε260nmの = 10200のL *モル-1 * cm -1で色素2、使用率ε260nmの = 13100のL *モル&lt;SUP&gt; -1 * cm -1で。吸光係数と測定された吸光度に基づいて、ランバート・ベールの法則以下の溶液の濃度を計算する。13 </li></ol> 6.サンプル調製と分光<ol><li> 一本鎖サンプルの調製 <ol><li> 200mMのNaCl、50mMののNaP iはバッファに変更されたDNA1とDNA2の各2.5μMのソリューションの個別に1ミリリットルのpH = 7を準備します。 </li></ol></li><li> 二本鎖サンプルの調製 <ol><li>反応容器中で200mMのNaCl、50mMののNaP iは緩衝液、pH = 7にDNA2の2.5 DNA1のμM、2.5μMを含む溶液の1ミリリットルを準備します。 </li><li> 10分間90°Cに安全キャップと熱で蓋を固定します。その後、加熱をオフにして、RT O / Nまで冷却することができます。 </li></ol></li><li> 吸光分光法 注：蛍光スペックの励起波長を決定するにはtroscopy吸収スペクトルが記録されています。 <ol><li> 一本鎖の測定 <ol><li>唯一の200mMのNaCl、50mMののNaP iは緩衝液、pH = 7を含むブランク測定を記録します。 </li><li> 1cmの石英ガラスキュベットにDNA1の調製した溶液を移し、吸収を記録します。ブランクデータに対する測定を修正してください。色素吸収の最大値を決定します。 </li><li> DNA2のために繰り返します。 </li></ol></li></ol></li><li> 蛍光分光法 <ol><li> 一本鎖の測定 <ol><li>唯一の200mMのNaCl、 私はバッファ50 mMの仮眠を含むブランク測定を記録し、pH = 7に。色素1の励起波長を使用して。 </li><li> 1cmの石英ガラスキュベットにDNA1ソリューションを転送します。 </li><li>蛍光スペクトルを記録します。 </li></ol></li><li> 二本鎖の測定 <ol><li>石英ガラスキュベットに二本鎖のソリューションを転送します。 </l私&gt; <li>染料1の励起波長を用いて蛍光スペクトルを記録します。 </li></ol></li></ol></li><li> 可視化実験 注意：適切な眼の保護が目に紫外線によるダメージを回避するために着用する必要があります！ <ol><li>記録されたスペクトルが表示されているものをよりよく理解するために、携帯型UV-ランプ（ 図5）でキュベットを照射します。二本鎖DNAへのシングルからの蛍光色の変化を観察します。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、アジド修飾された蛍光色素によりCuAAC経由して、DNA合成後に標識するための完全な手順を示しています。これは、染料およびアルキン修飾DNAの合成と同様にラベリング手順を含みます。 色素の合成は、4つのステップに従います。すべての製品は、それらの正電荷のためにではなく、簡単な沈殿によって得ることができ、何時間のかかるカラムクロマトグラフィーは必要ありません。中央のカップリング工程の前にアジド官能基の導入は、4の代わりに、5つの連続反応工程への色素の合成を短縮します。 1,3-ジヨードプロパンの代わりに、アルキル化工程、アペル反応およびヨード機能にヒドロキシル官能基を​​変換するには、次のフィンケルシュタイン反応のための3-ヨードプ​​ロパノールの適用は回避されました。公表された方法と比較してこれらの変更は、私たちは、より大きなスケールと時間の短い期間で色素を合成することができます。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;適用される色素は、優れた光安定性ではなく、固相DNA合成および後処理時に必要な安定性を示します。このため、...

分子イメージングは、生きた細胞内の生物学的プロセスを理解するための基本的な技術を表している。1-3、化学、生物学的応用のための蛍光核酸ベースのプローブの開発が拡大する研究分野となっています。これらの蛍光プローブは、細胞イメージングのために適したツールとなるために、いくつかの要件を満たす必要があります。まず、適用される染料は、in vivoイメージングに長期を可能にするために、高い量子収率、大きなストークスシフトと、最も重要なのは、高いphotostabilitiesで蛍光を示すべきです。そして第二に、彼らは信頼性の高い蛍光読み出しを示すべ​​きです。従来の発色団-消光剤、システムは、蛍光強度の簡単な変更によって、単一の蛍光色の読み出しに基づいている。4このアプローチは、細胞内の成分の自己蛍光または低い信号対雑音比に起因する偽陽性または偽陰性結果のリスクを負います他のCOMによって望ましくない消光によるものンポーネント。4 我々は最近、二つの異なる発色団を使用して二重蛍光色の読み出しを示す「DNAの交通信号灯」の概念に報告した。5-6概念は蛍光を変更するアクセプター色素にドナー色素からのエネルギー移動（ET）に基づいています色（ 図1参照）。これは、より信頼性の高い読み出しを可能にし、それによって蛍光イメージングプローブのための強力なツールを提供します。蛍光色素を有するオリゴヌクレオチドの標識には、2つの異なるアプローチによって達成することができます。染料は、それに応じて修正されたホスホルアミダイトビルディングブロックを使用して、固相に化学的DNA合成の間に組み込むことができる。7、この方法は、標準的なホスホルアミダイトおよび脱保護条件下で安定であり、色素に限定されます。別の方法として、合成後修飾方法は、オリゴヌクレオチドの化学的性質に設立されました。ここでは、私たちの新しい写真の1の合成を実証しますテーブルのエネルギー伝達対8,9とアジドとアルキン（CuAAC）間の銅触媒1,3-付加環を使用して、DNAの合成後の標識。10

<table><tbody><tr><td colspan="4">synthesis</td></tr><tr><td>4-Picoline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239615</td><td></td></tr><tr><td>1,3-ジヨードプロパン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238414</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>・10660131</td><td>HPLCグレード</td></tr><tr><td>酢酸エチル</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック<td>・サイ</td>エンティフィック <td>10456870 テクニカル・グレード</td></tr><tr><td>アジ</td><td>化ナトリウムシグマ アルドリッチ</td><td>71290</td><td>p.a. グレード</td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>10626642</td><td>テクニカル グレード</td></tr><tr><td>インドール-3-カルボキシアルデヒド; 98%</td><td>ABCR</td><td>AB112969</td><td></td></tr><tr><td>炭酸カリウム、99+%</td><td>アクロス</td><td>424081000</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルカーボネート</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>517127</td><td></td></tr><tr><td>N,N-ジメチルホルムアミド、99.8%、モレキュラーシーブア</td><td>クロス348435000</td><td></td><td></td></tr>硫酸<tr><td>ナトリウム</td>ベル<td>ントクラフト</td><td>12623.46</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、99.5%</td><td>アクロス</td><td>397690010</td><td></td></tr><tr><td>ピペリジン、99%</td><td>アクロス</td><td>147181000</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>10407830</td><td>テクニカルグレード</td></tr><tr><td>2-フェニルインドール-3-カルボキシアルデヒド、97%</td><td>ABCR</td><td>AB125050</td><td></td></tr><tr><td>4-メチルキノリン</td><td>ABCR</td><td>AB117222</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">DNA synthesis</td></tr><tr><td>Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer</td><td>Applied Biosystems</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dA(bz) ホスホロアミダイト</td><td>Σ Aldrich</td><td>A111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dT ホスホロアミダイト</td><td>Σ Aldrich</td><td></td><td></td>T111081</tr><tr><td>DMT-dG(dmf) ホスホロアミダイト</td><td>Sigma アルドリッチ</td><td>G11508</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dC(bz) ホスホロアミダイト</td><td>Σ アルドリッチ</td><td>C11108</td><td></td></tr><tr><td>DNA合成用アミダイト希釈剤</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>L010010</td><td></td></tr><tr><td>超高純度DNA合成用アセトニトリル</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>L010400</td><td></td></tr><tr><td>キャップA</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>L840000</td><td></td></tr><tr><td>キャップ B</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>L850000</td><td></td></tr><tr><td>CPG dT コラム 1.0&nbsp;&マイクロ;モル</td><td>Proligo 試薬</td><td>T461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dA(bz) カラム 1.0&nbsp;&マイクロ;モル</td><td>Proligo 試薬</td><td>A461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dG(ib) カラム 1.0&nbsp;&マイクロ;モル</td><td>Proligo 試薬</td><td>G461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dC(bz) カラム 1.0&nbsp;&マイクロ;モル</td><td>Proligo試薬</td><td>C461010</td><td></td></tr><tr><td>アンモニア(水溶液)&nbsp;</td><td>フルーカ・アナリティカル</td><td>318612</td><td></td></tr><tr><td>遠心装置 nanosep 0.45&nbsp;&マイクロ;m</td><td>ポール</td><td>ODGHPC34</td><td></td></tr><tr><td>5-(ベンジルチオ)-1H-テトラゾール(活性化剤)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>75666</td><td></td></tr><tr><td>2'-O-プロパルギル・デオキシウリジンホスホロアミダイト</td><td>化学遺伝子</td><td>ANP-7754</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">workup</td></tr><tr><td>vacuum concentrator</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>clicking procedure</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>テトラキス(アセトニトリル)銅(I)ヘキサフルオロリン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>346276</td><td></td></tr>酢<tr><td>酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>(+)-L-アスコルビン酸</td><td>ナトリウムシグマアルドリッチ</td><td>A7631EDTA</td><td></td></tr><tr><td>二ナトリウム塩</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>E5134TBTA</td><td></td></tr><tr><td>配位子</td><td>&nbsp;-</td><td>&nbsp;-</td><td>文献手順に従って合成1</td></tr><tr><td colspan="4">HPLC</strong</td></tr><tr><td>>HPLC-system</td><td>島津</td><td></td><td></td></tr>製作所 <tr><td>MALDI-Biflex-IV分光計</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LC-318 C18</td>カラム<td>Supelcosil via Sigma Aldrich</td><td>58368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">濃度の決定</td></tr><tr><td>ND 1000 分光光度計</td><td>nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">sample preparation and spectroscopy</td></tr><tr><td>Cary 100 Bio</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromax-3 fluorimeter</td><td>Jobin-Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.</td></tr></tbody></table>

光安定シアニン色素を用いた波長シフトdnaハイブリダイゼーションプローブの合成

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

このプロトコルでは、我々は、2&#39;-アルキンの合成のための方法を示す標準的なホスホルアミダイト化学を用いて自動化固相合成によってデオキシリボ核酸（DNA）鎖を修飾。オリゴヌクレオチドは合成後の銅触媒によるクリックケミストリーを使用して、2つの新しい光安定シアニン色素によって標識されています。両方のドナーとアクセプター色素の合成が記載されており、三つの連続工程で行われます。それらはハイブリダイゼーションにより近接させられるときに、周囲のアーキテクチャとしてDNAと、これら2つの色素が、エネルギー移動を受けます。したがって、2つの一本鎖DNA鎖のアニーリングは、蛍光色の変化によって視覚化されます。この色の変化は、蛍光分光法によって特徴付けられるだけでなく、直接ハンドヘルド紫外線（UV）ランプを使用して観察することができます。デュアル蛍光色読み出しの概念は、これらのオリゴヌクレオチドプローブを分子イメージング特に記載フォーのための優れたツールを作りますtostable染料が使用されています。これにより、イメージングプローブの光退色を防止し、かつ生物学的プロセスは、より長い期間のために実時間で観察することができます。

図4に示すように、一本鎖および二本鎖DNAの吸収および蛍光スペクトルが記録されています。 記録された吸収スペクトル（ 図4右）一本鎖DNA1（染料1）と一本鎖DNA2（色素2）のために546 nmのための465 nmでのショーの吸収極大λmaxを。アニールDNA1_2（染料1＆染料2）は、469 nmおよび567 nmの両方で最大値を示しています。両方の吸収極大は、これらの小さな分光変化、色素2用染料1および21 nmのための4nmの深色シフトを示す二重らせんDNAアーキテクチャ内の色素間の励起子相互作用の結果です。 単一のための607 nmにおける対応する蛍光スペクトルの一本鎖DNA1（染料1、435 nmでの励起）のために537 nmの（...

光安定性シアニン色素は、エネルギー移動によるハイブリダイゼーションを監視するためにオリゴヌクレオチドに結合します。

光安定シアニン色素を用いた波長シフトDNAハイブリダイゼーションプローブの合成

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

この実験の全体的な目的は、ある色素修飾DNA鎖から別のDNA鎖へのエネルギー転移を可視化することです。この手法は、生細胞内におけるsiRNAのプロセシングや完全性をリアルタイムでモニタリングすることによるRNA干渉など、分子生物学分野における重要な課題の解明に寄与します。この手法の主な利点は、蛍光の広がりと色の変化を容易にモニタリングでき、明確な結果が得られることです。これにより、偽陽性の結果が排除されます。この手順を開始するには、マグネチックスターラーと還流冷却器を備えた20 milliliterの丸底フラスコに、テキストプロトコルに記載されている適切な試薬を加えます。次に、0.06 mLのピペリジンを添加します。そして、反応混合物を80 °Cで4時間加熱します。反応液が室温まで冷却した後、得られた沈殿物をろ過により回収します。ジエチルエーテルで3回洗浄します。次に、上澄液に100 mLのジエチルエーテルを加えます。そして、生じた沈殿物をろ過により回収します。ジエチルエーテルで3回洗浄した後、沈殿物を最初のろ過で得られた固体と合わせます。DNAシンセサイザーに接続されたコンピュータを使用し、目的のDNA配列とカップリング法を入力します。メーカーのプロトコルの指示に従ってください。次に、1 µmolの第一面で修飾された、コントロールドポアガラスを含むカラムをシンセサイザーにセットします。続いて、DNAシンセサイザーで合成を開始します。DNAストランドのワークアップ後、テキストプロトコルに記載されている適切な試薬を、ジエチル化アルキンで修飾したDNAサンプルに添加します。サンプルを60 °Cで1.5時間インキュベートします。その後、サンプルを10 mLチューブに移します。室温まで冷却した後、DNAサンプルに0.05 M EDTA二ナトリウム塩溶液150 µLと0.3 M 酢酸ナトリウム溶液450 µLを加えます。その後、サンプルに10 mLのエタノールを加えます。そして-32 °Cで16時間保持します。次に、サンプルを1,000 ×gで15分間遠心分離します。終了後、上清を除去します。得られたDNAペレットを2 mLの冷えた80% ethanolで洗浄します。次に、凍結乾燥機を用いて減圧下でペレットを乾燥させます。粗DNAペレットをHPLCで精製します。ランのモニタリングは、260 nmおよびDye one用の459 nmで確認してください。または、Dye twoの場合は542 nmを使用します。両方の波長チャンネルで吸収を示す画分を回収します。単鎖吸収分光測定では、200 mM 塩化ナトリウムと50 mM リン酸ナトリウム緩衝液のみを含むブランク測定を記録してください。次に、あらかじめ調製したDNA1溶液を1 cmの石英ガラスキュベットに移します。吸光度を記録し、染料の最大吸収値を決定します。単鎖蛍光分光測定を行うため、Dye 1の励起波長を用い、200 millimolar 塩化ナトリウムと50 millimolar リン酸ナトリウムのみを含むブランク測定値を記録します。その後、DNA1溶液を入れたキュベットを分光光度計にセットし、蛍光スペクトルを記録します。二本鎖の蛍光分光測定を行うには、DNA1とDNA2の二本鎖溶液が入ったキュベットを分光光度計に設置します。次に、Dye oneの励起波長を用いて蛍光スペクトルを記録します。記録されたスペクトルの内容をより深く理解するために、ハンドヘルドUVランプでキュベットを照射してください。一本鎖DNAから二本鎖DNAへの蛍光色の変化を観察します。記録された吸収スペクトルでは、一本鎖DNA1は465 nanometersに、一本鎖DNA2は546 nanometersに極大値を示しています。アニールさせたDNA1とDNA2の二本鎖では、469 nanometersと567 nanometersの両方に極大値が見られます。両方の吸収極大にバソクロミックシフトが見られます。また、最小限の分光学的変化は、二重らせんDNA構造内における色素間のエキシトン相互作用の結果です。対応する蛍光スペクトルでは、単鎖DNA1において537 nanometersに極大を示します。一本鎖DNA2では607 nanometersに、アニールさせたDNA1とDNA2の二本鎖では615 nanometersにピークが見られます。DNA1とDNA2の二本鎖では、Dye oneを選択的に励起させたにもかかわらず、Dye twoの最大蛍光放出のみが観察されました。これは、Dye oneからDye twoへ効率的にエネルギー転移が起こっていることを証明しています。このビデオを視聴することで、アルキン修飾DNAストランドとA側とのいくつかの触媒反応によって、DNAを合成的に修飾する方法について十分に理解できるはずです。

synthesis-wavelength-shifting-dna-hybridization-probes-using

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、アーカイブホルマリン固定材料など、さまざまなソースから単離することができるDNAの唯一の25から100...

全ゲノムアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションの技術デモンストレーション

我々は将来の核酸ベースの治療のために均一とカスタマイズ可能なpolyplexesのよりよい制御および合成を提供することが期待される高分子電解質polyplexes、の形成を調査するナノフォトニクス（QD -...

組み合わせるQD - FRETとマイクロ流体はリアルタイムでDNAのNanocomplex自己組織化を監視する

染色体の複製タイミングの解析のための定量的な方法が記載されている。この方法は、蛍光との組み合わせでBrdUの取り込みを利用...

蛍光灯と組み合わせることで染色体の複製タイミング<em&gt;その場</em&gt;ハイブリダイゼーション

このビデオは、ポリエチレングリコールアンカー金ナノ粒子とDNAヘアピンテンションプローブを使用して、免疫細胞によって加えられる受容体力を評価する方法を示しています。CD8陽性T細胞の相互作用は、プローブのアンフォールディングをトリガーし、蛍光を発しながら、鎖をロックしてシグナルを維持し、免疫細胞が加える力を定量化します。...

DNAベースのテンションプローブを使用して、免疫細胞によって加えられる受容体の力を評価する

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直接標識プローブを用いた堅牢な3DのDNA FISH

ここでは、スライドマウント染色体上の反復ヘテロクロマティック配列を可視化するために、蛍光DNAのin situハイブリダイゼーション(DNA...

蛍光DNAための簡単​​な方法<em&gt;その場で</em&gt;ぺしゃんこ染色体へのハイブリダイゼーション

ここで重要な生物学的質問に取り組むためのケーススタディとして、赤外蛍光色素標識DNAプローブと一緒に精製されたSOX-2タンパク質を用いた蛍光電気泳動移動度シフトアッセイ（FEMSA）の最適化されたプロトコルを記述します。...

赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを使用したゲルシフトアッセイのために最適化されたプロトコル

ここでは、チアゾール オレンジをゲル電気泳動の実験で DNA の検出に使用するプロトコルを提案する.チアゾール オレンジの使用により、エチジウム...

エチジウム ブロマイドや代替染料ではなくチアゾール オレンジを用いた DNA 電気泳動

このプロトコルは、mRNA合成および分解のインビボ運動を測定するための一分子蛍光をその場所でのハイブリダイゼーション(smFISH)での適用について説明する。...

Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた 大腸菌 における空間と時間におけるmRNA運動学の探査

この論文では、DNAベースのテンションプローブを使用して免疫細胞によって加えられる受容体力を画像化するための詳細なプロトコルについて説明します。このアプローチは、受容体の力&gt;4.7pNをリアルタイムでマッピングし、時間の経過とともに力を積分することができます。...

免疫細胞による一過性ピコニュートン受容体力をマッピングするためのDNA張力プローブ

このプロトコールでは、蛍光灯アプタマーDAP-10-42をシグナルレポーターとして利用するスプリットハイブリダイゼーションプローブの設計と、核酸検出および単一ヌクレオチド置換を持つターゲット間の分化への応用について概説します。...

DNA蛍光発光アプタマーをシグナルレポーターとして用いたスプリットハイブリダイゼーションプローブによる塩基配列特異的核酸解析

学ぶ光安定シアニン色素を用いた波長シフトDNAハイブリダイゼーションプローブの合成法。クリック化学によるDNA標識と蛍光エネルギー移動を可視化し、分子イメージングや核酸相互作用のリアルタイム観察に応用できます。

光安定シアニン色素を用いた波長シフトDNAハイブリダイゼーションプローブの合成

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