光安定シアニン色素を用いた波長シフトDNAハイブリダイゼーションプローブの合成

この実験の全体的な目標は、1つの色素修飾DNA鎖から別の色素DNA鎖へのエネルギー移動を視覚化することです。この方法は、分子生物学の分野における重要な問題に役立ちます。例えば、生細胞内のsiRNAプロセッシングと完全性をリアルタイムで監視することによるRNA干渉などです。

この手法の主な利点は、蛍光の手を伸ばし、色の変化を簡単に監視し、明確な結果が得られることです。そのため、誤検知の結果は排除されます。この手順を開始するには、テキストプロトコルに示されているように、磁気攪拌棒と還流コンデンサーを装備した20ミリリットルの丸底フラスコに適切な試薬を追加します。

次に、ゼロポイントゼロ6ミリリットルのピペリジンを追加します。そして、反応混合物を摂氏80度に4時間加熱します。反応が室温まで冷却された後、得られた沈殿物をろ過により回収します。

そして、ジエチルエーテルで3回洗ってください。次に、上清に100ミリリットルのジエチルエーテルを加えます。そして、得られた沈殿物をろ過により回収します。

ジエチルエーテルで3回洗浄した後、沈殿物を最初のろ過で分離した固体と混合します。DNAシンセサイザーに接続されたコンピュータを使用して、目的のDNA配列と結合方法を入力します。製造元のプロトコルのプロンプトに従います。

次に、制御された注ぎガラスを含むカラムを、最初の面の1マイクロモルで変更したものをシンセサイザーに取り付けます。次に、DNAシンセサイザーで合成を開始します。DNA鎖の精密検査に続いて、テキストプロトコールに示されているように、適切なリージェントをジエチル化アルキン修飾DNAサンプルに加えます。

サンプルを摂氏60度で1ポイント5時間インキュベートします。次に、サンプルを10ミリリットルのチューブに移します。室温まで冷却した後、DNAサンプルにゼロポイントゼロ5モルEDTA二ナトリウム塩溶液150マイクロリットルとゼロポイント3モル酢酸ナトリウム溶液450マイクロリットルを加えます。

これに続いて、サンプルに10ミリリットルのエタノールを加えます。そして、摂氏マイナス32度で16時間保ちます。次に、サンプルを1000回Gで15分間遠心分離します。

得られたDNAペレットを2ミリリットルの冷たい80%エタノールで洗浄します。次に、凍結乾燥機を使用して減圧下でペレットを乾燥させます。HP LC.Monitorで粗DNAペレットを精製し、260ナノメートルとDye oneの459ナノメートルを確認して実行

または、染料2の場合は542ナノメートル。両方の波長チャネルで吸収を示すフラクションを収集します。一本鎖吸収分光法の測定では、200ミリモルの塩化ナトリウムと50ミリモルのリン酸ナトリウム緩衝液のみを含むブランク測定を記録します。

次に、前に調製したDNA1溶液を1cmの石英ガラスキュベットに移します。吸収を記録します。次に、染料吸収の最大値を決定します。

一本鎖蛍光分光法の測定では、Dye oneの励起波長を使用して、200ミリモルの塩化ナトリウムと50ミリモルのリン酸ナトリウムのみを含むブランク測定を記録します。これに続いて、DNA1溶液の入ったキュベットを分光計に入れます。蛍光スペクトルを記録します。

二本鎖の蛍光分光法測定を行うには、DNA1とDNA2溶液の二本鎖が入ったキュベットを分光計に入れます。次に、Dye oneの励起波長を使用して蛍光スペクトルを記録します。記録されたスペクトルが何を示しているのかをよりよく理解するには、手持ちのUVランプでキュベットを照射します。

一本鎖DNAから二本鎖DNAへの蛍光色の変化を観察します。記録された吸収スペクトルは、一本鎖DNA1の465ナノメートル、一本鎖DNA2の546ナノメートルの最大値を示しています。DNA1とDNA2のアニールされた二本鎖は、469ナノメートルと567ナノメートルの両方で最大を示しています。

両方の吸収極大は、バタオロミックシフトを示します。そして、最小の分光学的変化は、二重らせんDNA構造内の色素間の興奮子相互作用の結果です。対応する蛍光スペクトルは、一本鎖DNA1に対して537ナノメートルで最大を示します。

一本鎖DNAの場合607ナノメートル2。また、615ナノメートルで、DNA1とDNA2のアニールされた二本鎖です。DNA1とDNA2の二本鎖は、色素2の発光最大のみを示しますが、色素1は選択的に励起され、エネルギー移動が色素1から色素2に効率的に発生することを証明しています。

このビデオを見れば、アルキン標識DNA鎖とA面のカップル触媒反応により、DNAを合成修飾する方法を十分に理解できるはずです。