熱の予防によりラットに悪影響をストレス枯草菌ひずみ

私たちは、善玉菌による経口前処理によるラットの熱ストレス影響の予防のためのプロトコルを説明しました。このプロトコールは、さまざまな投与経路やさまざまな化合物の分析に変更を加えて使用できます。

この実験の全体的な目標は、暑熱ストレス後の合併症に対するB.subtilis BSB3株の予防効果を評価することです。この方法は、熱ストレスによる悪影響を防ぐための重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、熱ストレスの複雑さを軽減するためのさまざまなアプローチを評価するために使用できることです。

この手順をデモンストレーションするのは、Ludmila Globaです。そして、私たちの研究室の研究員であるOleg Pusovyy。まず、栄養寒天プレートで一晩成長させた枯草菌BSB3の単一のコロニーから始めます。

フラスコに10ミリリットルの栄養ブロスを接種します。摂氏37度で一晩で文化を育てます。ここに示されているレシピに従って、500ミリリットルの胞子形成培地を準備します。

そして、摂氏121度で20分間オートクレーブします。培地を摂氏50度まで冷ましてから、次の滅菌溶液を追加します。滅菌キャビネットで、調製した培地を室温で摂氏40度まで20分間冷却します。

そして、20個の滅菌ペトリ皿のそれぞれに25ミリリットルを注ぎます。媒体が一晩固まるのを待ちます。次に、0.5ミリリットルの一晩の枯草菌BSB3培養物を胞子形成培地プレートの表面に広げます。

プレートを摂氏37度で5日間インキュベートし、胞子形成が90%になるまで行います。次に、高解像度顕微鏡を使用して、位相が明るい胞子を確認します。バクテリアを採取するには、プレートに1ミリリットルのPBSを追加し、滅菌セルスプレッダーを使用して表面からバクテリアをこすり落とします。

必要になるまで、サスペンションを摂氏4度で保管してください。胞子形成培地プレートに細菌懸濁液の適切な希釈液0.1ミリリットルをめっきし、摂氏37度で18〜24時間インキュベートすることにより、細菌の生存率を確認します。コロニーカウンターを使用して細菌のコロニーをカウントし、試験した懸濁液中の細菌の力価を計算します。

次に、PBSに細菌懸濁液を1ミリリットルあたり10〜8分の1の最終濃度で調製します。B.subtilis BSB3またはPBSを用いてラットを2日間経口強制経口投与した後、動物を細分化して体温を測定した後、グループ1および2のラットを室温で25分間飼育します。グループ3と4の動物を摂氏45度、相対湿度55%の気候室に25分間置きます。

各ラットの直腸温を再度測定した後、すべての動物を室温で4時間置きます。次に、動物を安楽死させ、体幹の血液を採取し、テキストプロトコルに従って臓器を分離した後、各臓器サンプルを事前に計量した滅菌チューブに入れて計量します。滅菌PBSを各チューブに添加して、サンプルの体積希釈あたり1〜10重量を取得し、滅菌ガラス組織ホモジナイザーを使用して均質な組織懸濁液を生成します。

次に、滅菌PBSを使用して、各サンプルの段階希釈を行います。次に、0.1ミリリットルのすべての希釈液をMacConkeysの表面にプレートし、5%血液寒天培地にプレートします。そして、ヘミンとビタミンK1を含むブルセラ血液寒天培地。プレートをインキュベートした後、コロニーカウンターを使用して、プレートの各グループのコロニーをカウントします。

結果を、組織のグラムあたりのコロニー形成単位(CFU)の数として表します。テキストプロトコルに従って小腸の切片を調製および染色した後、高解像度顕微鏡を使用して腸絨毛および粘膜壁の総厚さを測定します。各ラットから少なくとも4つのサンプルを分析し、各サンプルで少なくとも20の測定を行います。

血液サンプルの高解像度光学顕微鏡検査を行うには、ビデオカメラとコンピューターを備えた顕微鏡システムのベースとして、防振プラットフォームを使用してライブ画像を記録します。テキストプロトコルに従ってテスト画像をキャリブレーションした後、各ラットから採取したばかりの血液7マイクロリットルをスライドガラスに置き、カバースリップを追加します。次に、各サンプルに72 x 53.3マイクロメートルの正方形の10個の画像フレームを撮影して記録します。

最後に、高解像度の直視光学画像をリアルタイムで提供するソフトウェアを使用して、小胞の濃度を測定します。熱ストレス前と直後の動物の平均体温は、それぞれマイナス07度が36.7度、マイナス0.17度が40.3度でした。ラットを熱にさらすと、絨毛の高さと粘膜全体の厚さが有意に阻害されました。

しかし、ストレスを受ける前にBSB3株で処理することで、腸を熱の有害な影響から保護しました。腸からの細菌の転座については、腸間膜リンパ節、肝臓、および脾臓を分析しました。ここに示されるように、PBS処理ラットの腸間膜リンパ節および肝臓から採取したサンプルのみ、熱に曝露したラットの組織1g当たり10倍から10

一方、BSB3株を投与された対照動物および熱ストレス動物からのすべての試験サンプルは無菌でした。IL 1β、IL-6、TNFalpha、またはインターフェロンガンマサイトカインレベルの変化は、熱ストレスを受けたラットでは記録されませんでした。しかし、IL-10およびLPSレベルは、熱処理前にPBS処理された動物で上昇していました。

そのため、B.subtilis BSB3前処理により、加熱処理後の血清中のIL-10とLPSの上昇を抑制した。最後に、熱ストレス前にPBSを投与されたラットの血液では遊離小胞の濃度の有意な増加が見られたが、BSB3で処理した動物では見られなかった。採血には発熱性材料を使用し、凍結と解凍を繰り返して血清液を摂氏マイナス20度に保つ精度を保つこと、および細菌の転座の分析中に無菌手順に従うことを覚えておくことが重要です。

この手順に従うと、熱ストレス後の細菌の投与のように、熱ストレスの合併症に関する追加の質問に答えるために実行できます。