Name: サイト監督スピン標識および五量体リガンド依存性イオンチャネルのEPR分光研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学ぶサイト監督スピン標識とEPR分光法による五量体リガンド依存性イオンチャネルの動態解析。この手法は膜タンパク質の生理学的環境における構造機能相関を明らかにする。

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私たちは、原稿上の重要な読書とコメントChakrapaniラボの現在および過去のメンバーに非常に感謝しています。 この作品は、国立衛生研究所の助成金（1R01GM108921）とアメリカ心臓協会（NCRPサイエンティスト開発グラント12SDG12070069）によって、およびSCにサポートされていました。

著者らは開示するものは何もない。

EPR分光法はネイティブに近い環境での膜タンパク質の立体構造変化を定量化するに比類のない構造的アプローチであることが証明されました。このアプローチは、私たちにX線結晶構造解析とクライオ電子顕微鏡から高解像度の構造に隠されているタンパク質のダイナミクスの分子の詳細にのぞき見することができます。しかし、他のシステムへの一般的な適用に影響を与える可能性があり、また、心の中で道に沿って潜在的な実験的な障害を保つために、このアプローチの技術的な制限を考慮することが重要です。私たちは、以下のトラブルシューティングのための推奨戦略に沿って、これらの態様のいくつかを議論します。 1は、大規模な突然変異摂動を伴う技術で遭遇した、より一般的な問題の中でタンパク質の収率が低く、貧しいオリゴマー安定性があります。このようなイオンチャネルのような複雑な多量体膜タンパク質で作業するときに、この態様はさらに悪化します。それは番目です広範囲の突然変異誘発に着手する前に、これらの2の生化学的な側面を最適化することが重要erefore。私たちは、有毒なGLIC変異体の発現がBL21細胞のC41とC43株における忍...

過去10年間、五量体リガンド依存性イオンチャネル（pLGIC）の構造的理解は、家族のいくつかのメンバーの高分解能構造の群衆に起因して、飛躍的に成長してきました。フィールド内の現在の進歩につながった主な要因は、構造決意アプローチ中の原核pLGICチャンネルの発見、真核生物の膜タンパク質の発現に1-3主要な進展、4-6と驚異的なブレークスルーを含む。7これらの構造は、上の明確なコンセンサスを提供しますpLGICの3次元構造の全体的な保全。しかし、背後に引きずるように見える二つの主要な分野は、これらのチャネル製剤の機能的特徴およびチャネル機能のメカニズムの説明があります。 ゲーティングコンフォメーション変化は複雑であり、チャネルの長さに沿って60オングストロームの距離にわたって起こり、これらの遷移は広くによって調節されます膜脂質。具体的には、負の脂質、コレステロール、およびリン脂質はpLGIC 8-11の機能を調節することが示されています。チャネル機能におけるこれらの脂質成分の正確な役割は不明のままであるが、ゲーティングの完全な分子的理解は、彼らのネイティブ環境でこれらのチャネルを研究が必要となります。部位特異的スピンラベリング（SDSL）および電子常磁性共鳴（EPR）分光法は、再構成されたシステムでは、タンパク質のダイナミクスを研究するための選択肢の技術です。 EPR分光法（蛍光分光法のように）分子の大きさ（NMRのように）、またはサンプルの光学的特性によって制限され、それによって天然の脂質状態に再構成全長構築物の測定が可能です。技術は非常に敏感であり、（ピコモルの範囲内で）比較的低いサンプル要件があります。これらの両方の側面がミリグラム以上で表現することが困難な大規模な膜タンパク質を研究するための技術は非常に適して作ります量。 部位特異的スピン標識と組み合わせて、EPR分光法を使用することは、ウェインハベルらによって開発された、およびタンパク質の種類の範囲を研究するために適合されている。12-24 EPRデータは、二次構造を調査するために使用されている、タンパク質の変化を立体構造、膜挿入深さ、およびタンパク質 - タンパク質/タンパク質 - リガンド相互作用。 この方法は、部位特異的突然変異誘発により、目的の位置にシステイン置換を含みます。部位特異的な標識化を確実にするために、システインレステンプレートを作成する別のアミノ酸（ 例えば 、セリン）で天然のシステインを置換することが必要です。これまでのところ、最も人気のあるスピン標識は、チオール特異的MTSLである：（1-オキシル2,2,5,5-テトラメチルΔ3-ピロリン-3-メチル）ジスルフィド結合のブリッジを介してタンパク質に付​​着methanethiosulfonate。その高い特異性、比較的小さいサイズ（トリプトファンよりわずかに大きい）、およびフレキシへリンカー領域の性は、このスピン標識も埋め込みシステインに優れた反応性を有することが示されています。さらに、反応性を最大化するために、タンパク質の標識反応は、界面活性剤可溶化形態で行われます。サイズ排除クロマトグラフィーにより過剰の遊離スピン標識を分離した後、タンパク質は、リポソームまたは定義された脂質組成物の二重層模倣システムに再構成されています。一般的には、システイン突然変異誘発はよくタンパク質のほとんどの地域では許容され、かつスピンプローブの比較的小さいサイズは、二次および三次構造に最小限の摂動を引き起こします。修飾は、野生型の機能を保持することを保証するために、標識され、再構成されたチャネルは、パッチクランプ測定によって研究することができます。 標識機能性タンパク質は、その後、本質的に情報の主に3つのタイプを提供する分光測定に供される：lineshにより12,14,15,20,22,23,25-27スピンプローブダイナミクスを猿の分析;常磁性緩和剤に対するプローブのアクセス;距離分布27 EPR距離は、2つの異なるアプローチによって測定されます。最初は（8 - 20Åの距離範囲）をスピン標識との間の双極子相互作用に起因するスペクトルの広がりは連続波（CW）技術に基づいている。距離を決定するために使用されている28,29秒パルス、EPRであります距離測定は、二重電子電子共鳴（DEER）で70Å。30-34にまで拡張することができる方法は、スピンエコー振幅の振動は、距離と距離の分布を決定するために分析されます。ここでのスピンエコーは双極子相互作用の周波数で変調されます。一緒に、これらのパラメータは、タンパク質のトポロジーは、二次構造要素、およびタンパク質コンホメーション変化を決定するために使用されます。

<table><tbody><tr><td>Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PfuUltra HF reaction buffer</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-52</td><td></td></tr><tr><td>dNTPS</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>N0447L</td><td>10 mM each dNTP</td></tr><tr><td>pfu Ultra DNA ポリメラーゼ</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-51</td><td>2.5 U/ul</td></tr><tr><td>DPNI</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>R0176S</td><td>20,000 U/ml</td></tr><tr><td>XL10 GOLD</td><td>Agilent Technologies</td><td>200314</td><td></td></tr><tr><td>SOC media</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>フィッシャー サイエントフィック</td><td>BP905</td><td></td></tr><tr><td>LB 培地</td><td>Invitrogen</td><td>127957084</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep キット</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>C43 コンピテントセル</td><td>Lucigen</td><td>60446</td><td></td></tr><tr><td>発現と精製</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>フィッシャー サイエントフィック</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>アムレスコ</td><td>J850</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0705</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0781</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (イソプロピル-チオ-ベータ;-ガラクトシド)</td> <td>ゴールドバイオテクノロジー</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Trizma ベース</td><td>Sigma ライフサイエンス</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>シグマライフサイエンス</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>アムレスコ</td><td>M145</td><td></td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td>アムレスコ</td><td>J580</td><td></td></tr><tr><td>ペプスタチン</td><td>アムレスコ</td><td>J583</td><td></td></tr><tr><td>DDM(n-ドセシル-&ベータ;-D-マルトピラノシド)</td><td>アナトレース</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>アミロース樹脂</td>ニュー<td>イングランドバイオラボインク&lrm;</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Amresco</td><td>K831</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Acros Organics</td><td>329915000</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr><tr><td>空のポリプロピレンクロマトグラフィーカラム</td><td>BioRad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>サイトデレクテッドスピンラベリング</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) メタネチオスルホン酸</td><td>トロントReaserch chemicals Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>(1-アセトキシ-2,2,5,5-テトラメチル-&デルタ;3-ピロリン-3-メチル) メタネチオスルホン酸</td><td>トロント Reaserch chemicals Inc</td><td>A167900</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>J.T. Baker</td><td>9224-01</td><td></td></tr><tr><td>再構成</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アソレクチン脂質</td><td>Avanti polar lipids Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>バイオビーズ (ポリスチリンビーズ)</td> <td>Bio Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー ケミカルズ</td><td>A413</td><td></td></tr><tr><td>FRET</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フルオレセイン-マレイミド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>F-150</td><td></td></tr>テ<tr><td>トラメチルローダミン-マレイミド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>T-6027</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>アバンティ極性脂質株式会社</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td> ア<td>バンティ極性脂質株式会社</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌極性脂質抽出物</td><td>Avanti極性脂質株式会社</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES シ</td><td>グマライフサイエンス</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EPR測定</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TPXプラスチック毛細血管</td><td>ブル</td><td>カーER221</td><td></td></tr><tr><td>EDDA(エチレンジアミン-N、N'-二酢酸)</td><td>アルドリッチ</td><td>158186</td><td></td></tr><tr><td>Ni(OH)2</td><td>アルドリッチ</td><td>283622</td><td></td></tr></tbody></table>

サイト監督スピン標識および五量体リガンド依存性イオンチャネルのepr分光研究

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

イオンチャネルゲーティングは、タンパク質の動きを刺激的に調整し、閉じた状態、開いた状態、および鈍感な状態の間の遷移を引き起こします。これらの遷移の基本となるのは、タンパク質の本質的な柔軟性であり、これは膜脂質組成によって決定的に調節されます。チャネル機能の構造的基盤をより深く理解するためには、生理的膜環境におけるタンパク質動態を研究する必要があります。電子常磁性共鳴(ESR)分光法は、機能状態間のコンフォメーション遷移を特徴付けるための重要なツールです。NMRやX線結晶構造解析と比較すると、ESRから得られる情報は本質的に解像度が低いです。しかし、他の技術とは異なり、ESRではタンパク質の分子量に上限はなく、サンプルの必要量は大幅に低く、さらに重要なことに、タンパク質は結晶格子力によって制約されません。したがって、ESRは、再構成されたシステム内の大規模なタンパク質複合体やタンパク質の研究に特に適しています。この記事では、Gloeobacter violaceus(GLIC)由来の原核生物プロトン依存性五量体リガンド依存性イオンチャネル(pLGIC)を例に、部位特異的スピン標識と膜再構成の一般的なプロトコールについて説明します。定常状態の連続波(CW)とパルス(Double Electron Resonance-DEER)ESRアプローチの組み合わせについて説明し、チャネルダイナミクスの完全な定量的特性評価を可能にします。

スピン標識GLICの変異体の生化学的特徴 培養の12ミリグラム/ L - 上述のプロトコールに従って、典型的には10の範囲でGLIC-MBP融合タンパク質を生じます。この値は、特にタンパク質内に埋め込ま位置について、異なる変異体を横切って変化することができるが、収率が著しく損なわれる可能性があります。これらの場合には、培養容積はスケールアップが必要な場合があります。融合の切断HRV3Cプロテアーゼによる構築物は、便宜上、O / Nで行われます。 60分 - SDS PAGEゲル上でサンプルを実行することによって、我々は、この切断が30以内に完了したことを見出しました。 （ 図1A）。サイズ排除ゲル濾過カラム上で精製されたGLICは11.3ミリリットルの保持容量を持つ五量体として主に溶出します。 MBP画分を15 mlで溶出し、凝集体はカラム（〜7.0 ml）での空隙容積で溶出しま...

この記事では、電子常磁性共鳴研究のためのサイト指向スピンラベリングと五量体配位子依存性チャネルの再構成の方法について説明します。このプロトコールは、あらゆる膜タンパク質に適合させることができます。ここで説明する再構成法は、定義された脂質システムにおける巨視的電流および単一チャネル電流のパッチクランプ測定にも使用できます。

サイト監督スピン標識および五量体リガンド依存性イオンチャネルのEPR分光研究

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

本プロトコルの全体的な目的は、電子常磁性共鳴（EPR）研究に向けた、5量体リガンド門扉チャネルの精製、部位特異的スピンラベル化、および再構成について実演することです。生理学的に適切な環境で膜タンパク質のダイナミクスを研究することは、この膜輸送タンパク質の作動機序を完全に理解するために不可欠です。そして、これらのニーズに対し、部位特異的スピンラベル化とEPR法は理想的な手法であると考えられます。この手法の主な利点は、タンパク質のサイズによる制限がないことです。したがって、巨大なタンパク質のダイナミクスや、膜に再構成されたタンパク質を研究したい場合には、部位特異的スピンラベル法とEPR分光法が最適な手法となります。部位特異的変異導入法により、GLIC遺伝子に単一のシステイン変異を導入します。テキストプロトコルに従い、GLICシステイン変異体のオーバーナイト培養を準備します。次に、オートクレーブ滅菌済みのTerrific Broth培地に、滅菌したリン酸カリウム緩衝液を100 milliliters添加します。その後、滅菌したグルコース、Kanamycin、およびオーバーナイト培養液を10 milliliters添加します。シェーカーを用いて250 rpm、37 °Cでインキュベートします。50 mLのグリセロールを加え、600 nmにおける吸光度（OD600）が1.0から1.2に達するまで培養を継続します。200 µMのIPTGで細胞を誘導した後、シェーカーを250 rpmに再設定し、18 °Cでさらに約16時間インキュベートします。1リットルの遠心ボトルに入れた細胞を、8500 ×g、4 °Cで15分間遠心分離して回収します。上清をデカンテーションで除き、テキストプロトコルに従って細胞ペレットが入ったボトルの重量を測定します。培養液1リットルあたり150 mLの氷冷バッファーAを用いて、細菌ペレットを再懸濁します。4°Cの低温室にて、細胞破砕機を用いて細胞をホモジナイズします。ほとんどの細菌が溶菌するように、この工程を3回繰り返します。その後、細胞を14,000 ×gで15分間遠心分離します。次に、上清をピペットで取り出し、清潔な遠心チューブに移します。上清を168,000 ×gで1時間遠心分離した後、膜ペレットを乱さないように注意して上清をデカンテーションで除きます。1リットルの培養液から回収した膜ペレットを、10% glycerolを添加したBuffer Aに加え、最終容量を50 millilitersとして再懸濁します。膜懸濁液に 0.5 grams の DDM を加え、4 °C で 2 時間ニューテーションさせます。膜の可溶化後、168,000 ×g で 1 時間遠心分離を行い、ライセートから細胞残渣を除去します。その間に、アミロースレジンを調製します

site-directed-spin-labeling-epr-spectroscopic-studies-pentameric

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JoVE Journal

Chemistry

化学

我々は、ATP依存性P2X2受容体の全長のC末端に結合する脳の蛋白質を識別するための単純なプロトコルを記述する。すべてのP2X受容体へのこのアプローチの拡張と体系的なアプリケーションは、P2X受容体シグナル伝達の理解につながることが期待される。...

P2X2リガンド依存性陽イオンチャネルと相互作用するタンパク質を特定するためのプロテオミクス

我々は単一細胞の蛍光を用いて立体構造変化の部位特異的解析と並んで膜タンパク質のイオン輸送の動態を測定する方法を説明します。この手法は、イオンチャネル、トランスポーター、イオンポンプに適応可能であり、タンパク質サブユニット間の距離の制約を決定するために利用することができます。...

膜タンパク質の構造動力学を調べるその場で部位特異的蛍光標識を持つ

我々のGPCRの様​​々な標的位置に非天然アミノ酸p-アジド-L-フェニルアラニンを遺伝的に符号化し、異なる用途におけるアジド基の汎用性を示している。これらは、GPCRのリガンド結合ポケットに残基を同定するために目標と光架橋技術、およびペプチドエピトープタグまたは蛍光プローブでのGPCRの部位特異的バイオ直交修飾を含む。...

遺伝的にコードされた分子プローブは、Gタンパク質共役受容体を研究する

単一分子レベルでの高精度FRET実験のプロトコールをここに示します。さらに、この方法論は、N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体のリガンド結合ドメインにおける3つの構造状態を同定するために使用することができる。正確な距離を決定することは、FRET実験に基づく構造モデルを構築するための第一歩です。...

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

この記事では、分光分析用洗剤可溶化 TRPV1 の生化学的な量を取得する具体的な方法について説明します。結合されたプロトコルは、膜制御環境で哺乳類のイオン...

精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成

このプロトコルは、細胞環境において受容体に結合するアデニンヌクレオチドをリアルタイムで測定する方法を提示する。結合は、トリニトロフェニルヌクレオチド誘導体と非標準的な蛍光アミノ酸で標識されたタンパク質との間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)として測定されます。...

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

天然変性タンパク質の弱く一過性の分子間および分子内相互作用を検出するための常磁性緩和増強NMR分光法の適用のためのプロトコルが提示されています。...

天然的に無秩序なタンパク質の自己会合の検出と特性評価のための常磁性緩和増強

この研究では、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)の単一分子蛍光共鳴エネルギー移動(smFRET)実験を実行するための詳細な手順を示します 非天然アミノ酸(UAA)の取り込み による...

1分子FRETを用いた膜受容体の立体構造ダイナミクスの可視化

このプロトコールでは、高分子のクライオ電子顕微鏡マップで低分子リガンドをモデル化するために利用可能なツールを紹介します。...

クライオ電子顕微鏡法から得られたマップへの配位子のモデリング

電気生理学は、イオンチャネル活性を調査するためのゴールドスタンダードです。ただし、光学的方法など、多くの代替アプローチがあります。ここでは、8チャネル(LRRC8)形成陰イオンチャネルを含むロイシンリッチリピートの活性を、サブユニット間フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)ベースの方法を用いてモニターする方法について述べる。...

感作蛍光フェルスター共鳴エネルギー移動(SE-FRET)を使用したロイシンリッチリピート含有8チャネル(LRRC8/VRAC)活性のモニタリング

学ぶサイト監督スピン標識とEPR分光法による五量体リガンド依存性イオンチャネルの動態解析。この手法は膜タンパク質の生理学的環境における構造機能相関を明らかにする。

サイト監督スピン標識および五量体リガンド依存性イオンチャネルのEPR分光研究

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