サイト監督スピン標識および五量体リガンド依存性イオンチャネルのEPR分光研究

本プロトコルの全体的な目的は、電子常磁性共鳴（EPR）研究に向けた、5量体リガンド門扉チャネルの精製、部位特異的スピンラベル化、および再構成について実演することです。生理学的に適切な環境で膜タンパク質のダイナミクスを研究することは、この膜輸送タンパク質の作動機序を完全に理解するために不可欠です。そして、これらのニーズに対し、部位特異的スピンラベル化とEPR法は理想的な手法であると考えられます。

この手法の主な利点は、タンパク質のサイズによる制限がないことです。したがって、巨大なタンパク質のダイナミクスや、膜に再構成されたタンパク質を研究したい場合には、部位特異的スピンラベル法とEPR分光法が最適な手法となります。部位特異的変異導入法により、GLIC遺伝子に単一のシステイン変異を導入します。

テキストプロトコルに従い、GLICシステイン変異体のオーバーナイト培養を準備します。次に、オートクレーブ滅菌済みのTerrific Broth培地に、滅菌したリン酸カリウム緩衝液を100 milliliters添加します。その後、滅菌したグルコース、Kanamycin、およびオーバーナイト培養液を10 milliliters添加します。

シェーカーを用いて250 rpm、37 °Cでインキュベートします。50 mLのグリセロールを加え、600 nmにおける吸光度（OD600）が1.0から1.2に達するまで培養を継続します。200 µMのIPTGで細胞を誘導した後、シェーカーを250 rpmに再設定し、18 °Cでさらに約16時間インキュベートします。

1リットルの遠心ボトルに入れた細胞を、8500 ×g、4 °Cで15分間遠心分離して回収します。上清をデカンテーションで除き、テキストプロトコルに従って細胞ペレットが入ったボトルの重量を測定します。培養液1リットルあたり150 mLの氷冷バッファーAを用いて、細菌ペレットを再懸濁します。

4°Cの低温室にて、細胞破砕機を用いて細胞をホモジナイズします。ほとんどの細菌が溶菌するように、この工程を3回繰り返します。その後、細胞を14,000 ×gで15分間遠心分離します。

次に、上清をピペットで取り出し、清潔な遠心チューブに移します。上清を168,000 ×gで1時間遠心分離した後、膜ペレットを乱さないように注意して上清をデカンテーションで除きます。1リットルの培養液から回収した膜ペレットを、10% glycerolを添加したBuffer Aに加え、最終容量を50 millilitersとして再懸濁します。

膜懸濁液に 0.5 grams の DDM を加え、4 °C で 2 時間ニューテーションさせます。膜の可溶化後、168,000 ×g で 1 時間遠心分離を行い、ライセートから細胞残渣を除去します。その間に、アミロースレジンを調製します。

ピペットを用いて3 mLの樹脂を空のポリプロピレン製クロマトグラフィーカラムに移します。10カラムボリュームの水で3回洗浄し、続いて0.5 mM DDMを含むバッファーAで10カラムボリューム分洗浄します。遠心分離後、上清をピペットで静かに採取し、清潔な50 mLコニカルチューブに移します。

バッチ法による結合を行うため、あらかじめ平衡化したアミロース樹脂をコニカルチューブに加えます。混合液を4°Cで2時間ニューテーティングし、抽出したタンパク質をアミロース樹脂に結合させます。次に、スラリー全体をクロマトグラフィーカラムに通し、フロースルーを回収します。

0.5 mM DDMおよび0.5 mM TCEPに加え、40 mM マルトースを含むBuffer Aを10 mL加え、GLICタンパク質を希釈します。TCEPはシステイン側鎖の酸化を防ぎます。溶出液をすべて回収します。

遠心濃縮器を用いて、溶出したタンパク質を4～6 mg/mLまで濃縮します。HRV 3Cプロテアーゼを加え、4 °Cで一晩インキュベートします。部位特異的スピンラベル化を行うには、まずプロテアーゼ消化後のサンプルにMTSLスピンラベルを10倍モル過剰に添加し、GLICモノマーに対するMTSLのモル比を1:10にします。

1時間のインキュベーション後、さらに5倍モル過剰量のスピンラベルを添加し、もう1時間インキュベーションします。切断されたMBPタグおよび過剰な遊離スピンラベルをGLIC五量体から分離するため、Buffer Aおよび0.5 millimolar DDMで平衡化したサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（FPLC）カラムにサンプルを通します。遠心濃縮器を用いてタンパク質溶液を最終濃度約8〜10 mg/mLまで濃縮し、氷上に置きます。

これでサンプルの再構成準備が整いました。リポソームを調製するために、清潔な25 milliliterの丸底フラスコを5 millilitersのクロロホルムですすぎ、ドラフト内で窒素ガス流を用いてフラスコを乾燥させます。次に、10 milligramsのasolectinをフラスコに移し、連続的な窒素ガス流の下で脂質を乾燥させます。

クロロフォームが蒸発した後、完全に乾燥させるため、フラスコを1時間真空状態に置きます。次に、乾燥した脂質に再構成バッファーAを1 mL加え、フラスコを激しくボルテックスして脂質ペレットを懸濁させます。小単層小胞（SUV）を調製するために、小胞溶液がおおよそ半透明になり、凝集塊が見られなくなるまで、冷浴ソニケーターで脂質懸濁液を超音波処理します。

この混合液に、最終濃度が4 mMとなるようにDDMを加え、室温で30分間インキュベートします。タンパク質を再構成させるため、精製したタンパク質を脂質混合液に加えます。サンプルを4 °Cで1時間、緩やかに回転させながらインキュベートした後、Buffer Aを用いてサンプルを15 mLまで希釈します。界面活性剤をトラップする疎水性細孔を持つポリスチレンビーズを用いて、懸濁液中の残留界面活性剤を除去します。

洗浄済みビーズを80 mg加え、リポソーム懸濁液をニューテーターを用いて4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、カラムフィルターを用いてビーズを除去しながらリポソームを25 mL超遠心管に移し、サンプルをさらに25 mLまで希釈します。サンプルを168,000 ×gで2時間遠心分離した後、上澄みをデカンテーションで取り除き、100 µLのBuffer Bを用いてペレットを再懸濁します。連続波EPR分光法を行うには、まずリポソーム懸濁液を200 µLチューブに移し、遠心分離機を用いてサンプルをペレット化します。

上澄み液を廃棄した後、サンプルはEPR測定が可能な状態になります。リポソームサンプルから可能な限りバッファーを除去してください。バッファー交換を行うには、ピペットを使用してリポソームペレット 20 µLをマイクロ遠心チューブに移します。

Buffer Dを180 µL加え、42 °Cで5分間インキュベートします。サンプルを遠心分離し、ピペットで上清を除去します。この工程を3回繰り返し、バッファー交換を完全に完了させます。スペクトル線形と溶媒アクセシビリティの両方の測定には、ガス透過性プラスチックキャピラリーが適しています。

キャピラリーをペレット化したプロテオリポソームに軽く触れさせてサンプルを吸い込み、末端をボーンワックスで封止します。ここでは、MBPタグをタンパク質分解で切断した後のスピンラベル化GLICのゲルろ過クロマトグラムによる、スピンラベル化GLIC変異体の生化学的特性解析を示しています。ピークはGLIC五量体および遊離MBPに対応しています。

SDS-PAGEゲルは、ゲルろ過前の未切断のモノマーGLIC-MBP融合タンパク質、およびゲルろ過で回収したMBPおよびGLIC画分を示しています。さまざまな膜脂質に再構成されたGLICの凝集状態をモニタリングするためのFRETベースのアッセイを実施しました。FRET測定は、一晩の再構成後、およびサンプルの凍結融解サイクルを数回繰り返した後のサンプルに対して行われました。

再構成されたasolectinベシクルから切り出されたインサイドアウトパッチにおいて、高速溶液交換装置を用いたpHジャンプによりGLICを活性化させます。チャネルは約10 millisecondsで活性化し、1〜3 secondsの時定数で脱感作することが確認されます。チャネルの活性化に伴い、構造再編が観察されます。

ここでは、孔を形成するM2ヘリックスの特定部位における連続波電子常磁性共鳴（CW-EPR）スペクトルを用いて、pH変化に伴う振幅の変化や線形（ラインシェイプ）の変化を解析します。EPR分光法は、天然に近い環境における膜タンパク質の構造変化を測定するための比類なき構造解析手法であり、高分解能のX線構造解析やクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）構造では不明瞭なタンパク質ダイナミクスの分子レベルの詳細な情報を得ることができます。この手法を用いる際は、変異導入によってタンパク質のオリゴマー安定性が低下し、不十分な状態になることが多い点に留意することが重要です。

したがって、これらの課題に対処するための戦略を立てる必要があるかもしれません。これらのEPR研究から得られた知見を機能測定と組み合わせることで、構造と機能の関係を研究するためのより完全な全体像を得ることができます。今後の技術的進歩は、この強力なアプローチを用いて、より複雑なヒトチャネルをより精緻な脂質条件下で研究することを目指しています。