代謝表現型が異なる未熟、熟女と寛容原性樹状細胞の生成

このプロトコルの全体的な目標は、実験またはワクチン開発のために単球から寛容性および成熟樹状細胞を生成することです。この方法は、樹状細胞の発生、成熟、抗原提示を研究するためのモデルを提供することにより、免疫学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、実験のためにin vitroで多数の樹状細胞を生成できることです。

あらかじめ調製した末梢血単核細胞20マイクロリットル、またはPBMC細胞懸濁液を20マイクロリットルのトリパンブルーと混合し、サイトメーターを使用して生細胞の数をカウントすることにより、単球濃縮を開始します。次に、細胞懸濁液を遠心分離します。上清を完全に吸引し、細胞ペレットを80マイクロリットルの濃度まで再懸濁し、10〜7番目の細胞について染色緩衝液にします。

7番目の細胞に10個あたり20マイクロリットルのCD-4マイクロビーズを追加します。よく混合し、細胞を摂氏4度で15分間インキュベートします。細胞を10〜7番目の細胞ごとに1ミリリットルの染色緩衝液で洗浄し、細胞を遠心分離します。

上清を完全に吸引し、細胞ペレットを再懸濁します。最大で2×10〜8番目の合計セルの中型カラムを取得し、カラムをセパレーターの磁場に配置します。次に、カラムを500マイクロリットルの染色緩衝液ですすいでください。

細胞懸濁液をカラムにピペットで移し、カラムを通過する非標識細胞を15ミリリットルのチューブに集めます。カラムの下に新しい 15 ミリリットルのチューブを交換し、500 マイクロリットルの染色バッファーでカラムを 3 回洗浄します。洗浄の間に新しい染色バッファーを追加する前に、カラムリザーバーが空であることを確認してください。

カラムをセパレーターから取り外し、新しい15ミリリットルのチューブに置きます。1 ミリリットルの染色バッファーをカラムにピペットで移し、プランジャーをカラムにしっかりと押し込んで、磁気標識された細胞をすぐに洗い流します。次に、新しいカラムでilludedフラクションを使用して磁気分離ステップを繰り返し、CD14 plus細胞の純度を高めます。

IL-4の細胞培養培地1ミリリットルあたり10〜6倍、ゼロポイント3〜ゼロポイント5×10〜6の濃度で、CD14と単球の4セットをシードします。組織培養インキュベーターで細胞を摂氏37度で5%のCO2でインキュベートします。4日目に、850マイクロリットルの培地を培養物から取り出し、遠心分離します。

上清を吸引し、ペレットを1ミリリットルの細胞培養培地に再懸濁します。細胞混合物を培養物に戻します。5日目に、1マイクロリットルのビタミンD3ストックと1マイクロリットルのデキサメタゾンストックを中培地1リットルから2セットあたり追加して、寛容性MoDCを生成します。

6日目に、GMCSFのミリリットルあたり200ナノグラムとIL-4のミリリットルあたり200ナノグラムをすべてのセットに追加します。GMCSFとIL-4のみで処理したセットの1つにLPS1ミリリットルあたり1マイクログラムを追加して、成熟したmoDCを生成します。LPSの1ミリリットルあたり1マイクログラムを1セットの寛容原性moDCに加えて、LPSの耐容性moDCを生成します。

最後に、7日目に、培養皿をPVS EDTAで洗い流して、さまざまな種類のmoDCを収穫します。未成熟なmoDCは、精製したCD-14と単球にGMCSFとIL-4を0日目、4日目、6日目に添加することによって生成されました。GMCFおよびIL-4後のビタミンD3およびデキサメタゾンの添加により、未成熟なmoDCが寛容性moDCに分化しました。

LPSは、未成熟moDCから成熟moDCへの成熟を誘導するために添加されました。また、寛容性MoDCをLPSで刺激して、成熟に対する抵抗性を確認しました。DC表面マーカーの分析により、成熟したmoDCは、HLA-DR、CD80、CD83、およびCD86の最高レベルの成熟マーカーを発現していることが明らかになりました。

逆に、寛容原性moDCは、未熟および成熟moDCと比較して、CD14、BDCA3、および免疫グロブリン様転写産物の発現増加を示した。赤色のCMXRosを使用してマイトコンドリア活性を反映すると、寛容原性moDCは、他のmoDC分化サブタイプと比較してミトコンドリア活性が高いことが観察されました。その開発後、この技術は、免疫学の分野の研究者がワクチンや免疫療法の開発のために樹状細胞の代謝特徴を探求する道を開きました。