患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

この手法の全体的な目標は、大規模な患者コホートにおけるゲノム全体のDNAメチル化の状況を体系的に調査することです。この方法は、エピジェネティックな分野、特にDNAメチル化ランドスケープのどの領域が患者内で制御緩和されるかに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、多数の患者を費用対効果の高い方法で調査できることです。

この技術は、既存のバイオマーカーを調査し、新しいバイオマーカーを特定できるため、患者の治療と診断にプラスの影響を与えることができます。この方法は、患者コホートに関する洞察を提供することができますが、マウス由来サンプルの培養細胞株に由来する細胞のDNAメチル化など、他のシステムにも適用できます。Ya-Ting Hsu博士とともにこの手順を実演するのは、当研究室の技術者であるJoseph Liu氏です。

シーケンシング部分は、シーケンシングコアの技術者であるMs.Dawn Garciaによってデモンストレーションされます。テキストプロトコルに従って腫瘍または正常組織からゲノムDNAを単離した後、1.2マイクログラムの全ゲノムDNAを96マイクロリットルのTEバッファーと24マイクロリットルの5Xバインドウォッシュバッファーに加えて、120マイクロリットルの溶液を作ります。DNA溶液を30秒間超音波処理し、次に30秒間休ませます。

超音波処理を合計20〜25回繰り返します。メーカーのプロトコルに従って市販の高感度DNAキットを備えたバイオアナライザーシステムを使用して、1マイクロリットルの超音波処理DNA溶液を実行し、フラグメントのサイズを確認します。それらは150から350の塩基対の範囲にあるべきです。

単一画分溶出を行うには、低塩緩衝液と高塩緩衝液の1対1溶液を作製して溶出液を調製します。200マイクロリットルの溶出バッファーを使用して、メチル結合DNAまたはMBDビーズを再懸濁し、懸濁液を回転ミキサーで3分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを磁気ラックに1分間置き、ビーズ上のピペットの先端に触れずに慎重に液体をピペットでピペットし、きれいなDNaseフリーの1.5ミリリットル微量遠心チューブに移します。

このサンプルを氷上に保存します。2番目のサンプルに対して溶出を繰り返し、最初のサンプルと同じチューブに回収します。捕捉されていない各洗浄画分および希釈画分に、1マイクロリットルのグリコーゲン、3モル酢酸ナトリウム(pH 5.2)の10分の1の容量、および100%エタノールの2つのサンプル容量を追加します。

溶液をよく混合した後、マイナス80°Cで少なくとも2時間インキュベートします。次に、反応を11、363倍g、摂氏4度で15分間遠心分離します。ペレットを乱さずに上清を慎重に捨て、500マイクロリットルの冷たい70%エタノールを追加します。

エタノール洗浄を繰り返す前に、チューブを再度回転させます。ペレットを5分間風乾します。次に、DNaseを含まない水またはバッファーを使用して再懸濁します。

DNAの総量がテキストプロトコルに従って20ナノグラムを超えていることを確認してください。その後、DNAを氷の上に置くか、さらに使用するまで摂氏マイナス20度で保存します。DNAシーケンシングライブラリの調製には、全自動ライブラリ構築システムを使用し、メーカーが提供する標準プロトコルに従ってください。

ライブラリー調製のために、長さが200〜400塩基対のDNA断片を選択します。DNAシーケンシングライブラリーを調製した後、反応液を除去し、蛍光定量システムを使用してDNAシーケンシングライブラリーを定量します。PCR増幅反応を設定するには、PCRチューブに15マイクロリットルのDNAシーケンシングライブラリ、25マイクロリットルのPCRマスターミックス、2マイクロリットルのPCRプライマーミックス、および8マイクロリットルの水を追加します。

テキストプロトコルに概説されているプログラムを使用し、PCRミックスメーカーの推奨に基づいて必要に応じて調整を行います。2〜10ミリモルのライブラリDNAを生成するのに十分なサイクルを実行します。PCR反応をクリーンアップした後、各サンプルをバーコードでコーディングし、4つのサンプルをフローセルの1つのレーンにまとめます。

当社のシーケンシングの標準的な50塩基対シングルリードプロトコルを使用してください。テキストプロトコルに従ってバイオインフォマティクスを実行します。MBDキャップを使用して、正常組織に対して腫瘍で異なるメチル化が行われているさまざまなゲノム領域にわたるCpGアイランドを特定することを目指し、この研究では、遺伝子プロモーターにあるCpGアイランド全体のうち、19.5%が正常と比較して腫瘍で異なるメチル化を示したことが明らかになりました。

同様に、調査した遺伝子内CpGアイランドの55.2%がメチル化の違いを示しました。遺伝子内プロモーターは28.1%を示し、CpGアイランドのない遺伝子プロモーターでは1.8%がメチル化の違いを示しました。このヒートマップは、77の乳房腫瘍、10の乳房正常組織、および38の乳がん細胞株にわたる異なるメチル化領域を明確に示しています。

この図では、同定された標的遺伝子SFRP1のプロモーターCpGアイランドの異なるCpG部位の2人の患者において、非再発性対再発性の2つの子宮内膜がんサブグループでメチル化が定量化されています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、4〜5日で完了できます。

この手順を試みる際には、まず検査対象のゲノムDNAの品質をテストすることを忘れないでください。この手順に続いて、パイロシーケンシングのような追加の方法を実行して、次のような質問に答えることができます。これは、特定された差次的に濃縮された領域で変更された正確なCpGはどれか?その開発後、この技術は、エピジェネティクスの分野の研究者が大規模な患者コホートにおけるDNAメチル化を調査する道を開きました。

このビデオを見れば、MBDキャップシーケンシング技術を使用して患者サンプルのゲノムワイドDNAメチル化を調査する方法について十分に理解できるはずです。FFPやDNAサンプルなどからは、高いクオリティのDNAを捉えるのが難しい場合があるため、手順を行う際には必ずゲノムDNAの適切な評価が行われます。