Name: 三次元ハイドロゲルでイメージングをFRET (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学ぶ三次元ハイドロゲル内細胞のFRETイメージング法。蛍光共鳴エネルギー移動を用いて細胞内シグナル伝達をリアルタイムで観察し、再生医療や創薬スクリーニングの研究に応用できます。

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著者らは、ピッツバーグ、健康賞K01 AR062598の国立研究所、および助成金P30のDE030740の大学歯科医学部の財政支援を認めます。著者らはまた、ImageJのマクロのためのImageJとマイケル・カメロを開発するためのICUE1プラスミド、ウェインRasband博士ジンチャンに感謝します。

著者には宣言すべき矛盾はありません。

細胞シグナリングは複雑で、薬理学、組織工学、再生医療などの多くの分野のための必然でもあります。有用な治験ツールは、細胞生物学の理解を促進し、組織再生のための最適な材料を開発するために必要とされます。蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）イメージングは受容体の活性化、分子のコンホメーション、および生細胞中で超分子相互作用を（ 例えば 、タンパク質/ DNA複合体形成）の分析を可能に不可欠なツールです。 FRETは、蛍光色素分子1との間の非放射エネルギー転送のタイプです。これは、ドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォア間の距離の6乗に反比例する効率を有します。 （ - 10ナノメートル、典型的には1）2このように、ナノメートルスケールでの2つの異なる分子間または1つの分子の領域にわたって空間的な距離情報を提供することができます。ドナーとアクセプターフルオロフォアは異なるメートルとすることができますolecule型ドナーは、より高いエネルギー放出（より短い波長）を有する、（ヘテロFRET）、または同じタイプの（ホモFRET）。 FRET画像化は、固定または生細胞に対して行うことができるが、高速共焦点システムが利用できない場合、一般的に固定された細胞は、高い空間分解能での分子相互作用のイメージングのために使用されます。生細胞は、このような応答3シグナリングリアルタイム細胞内などの阻害または固定することによって変更される相互作用およびプロセスを研究するために使用されます。 なぜなら、シンプルさとより低いバックグラウンド（平面セルのうちから無発光）の一部でFRETイメージング用2次元（2D）の細胞培養液を使用し、生細胞の研究。しかし、2D培養物はまた、生理学的微小環境と3次元（3D）培養4,5に比べて非常に多くの細胞プロセスを変化させます。例えば、細胞外マトリックス相互作用のセルとセルの天然の細胞が大幅にEASをもたらす2D培養で変更されますILY細胞形態と極性6の変化を観察しました。それらは、細胞骨格成分7,8及び細胞形状および細胞骨格構造が強く空間培養環境9によって調節される結合ので、膜マイクロドメイン（ 例えば 、カベオラおよび脂質ラフト）と受容体シグナル伝達が強く部分的に、培養環境によって調節されます。メカノだけ3Dマトリックスの影響を受けますが、より複雑な二次負荷条件によって2D培養10と比較して、3D環境で生み出されていません。最後に、3Dマトリックスの透過性は拡散を減少し、2D培養物と比較してシグナル伝達分子の細胞への結合の増加とともに一般に、培地未満です。 3D培養物と一つの接着剤、化学的、及び機械的な合図に対して生理学的により類似微小環境を作成して観察することができます。細胞相互作用の細胞を促進することができ、接着性がwを制御することができます3D素材11-13の構造、組成、およびアーキテクチャ（パターニング）は、i番目。材料の機械的性質は、同様の組成および構造14,15によって調整することができます。ヒドロゲル中の細胞を培養することは、したがって、許可は、他の脱分化になる初代細胞、または従来の技術を使用して表現型の変化、 例えば、上で検討をFRET、関節軟骨からの細胞。したがって、この方法は、ライブ3D培養におけるFRETアッセイを可能にするために必要とされます。 彼らは、光学的に透明と微小環境を制御し、携帯手がかりを提供するように調整することができるので、ヒドロゲル足場は、3D FRETベースの研究に最適です。天然ポリマーから作られるヒドロゲルは、ゼラチンおよびフィブリン16などの数十年のための細胞培養に使用されてきました。携帯の微小環境をより細かく制御は、これらのポリマーの化学修飾とし、合成ポリマー17,18の使用によって達成することができます。 Hydr機械的剛性をogel透磁率は、そのポリマー組成物を変えることによって制御することができ、サイズ（ポリマーと架橋密度）19,20メッシュ 。さらに、ヒドロゲルは、増殖因子および細胞リガンドを組み込むことによって、生物活性にすることができます。なぜならこれらの可能性、バイオセンシング、薬物送達、および組織工学用途のためのヒドロゲルの開発は、研究21の非常に活発な領域です。ヒドロゲルの3Dプリントはまた、微細組織の製造のための開発を受けて、15を -organsされます。したがって、ヒドロゲル中の細胞のFRETイメージングは​​、生理的な細胞挙動を近似するための手段として有用であるだけでなく、勉強や工学的組織の成長を最適化するためのツールと​​してだけではありません。 バイナリレシオメトリックFRETプローブは、細胞のシグナル伝達を研究するのに非常に有用であり、ヒドロゲル培養物中で利用することができます。公開された蛍光及びFRETプローブの部分的なリストについては、細胞遊走コンソーシアムのWebサイトを参照してください<sup&gt; 22。最も一般的なプローブタイプは、認識要素（複数可）（検体感知領域）によって関連するか、またはリンクされている2つの異なる蛍光体が含まれています。これらの領域は、（ 例えば 、イオンまたは分子の結合、地域の酵素的切断）を分析対象物の検出時にコンホメーション変化、協会、または解離を受ける蛍光団、したがって、FRETの大きさとの間の距離を変化させること（より高いまたはより低いのいずれか） 23。あまり一般的ではまだ有用なプローブ・タイプは、FRETの大きさを変化させる2つのフルオロフォアのスペクトルの重複、中の検体敏感な変化に依存しています。 「単鎖」レシオメトリックプローブは、単一分子に連結された蛍光団のペアを利用します。 「デュアルチェーン」プローブは、別々の分子上のフルオロフォアのペアを利用するが、それらの発現は、同じ発現カセット24の下に結合することができます。単一の蛍光体の式を用いた研究（ 例えば 、蛍光融合タンパク質）、研究レシオメトリックとは異なりFRETプローブは、トランスフェクション効率や細胞生存率を制御するために、二重トランスフェクションを必要としません。最小閾値（濃度小文字を区別しない）23,25上に発現した場合レシオメトリックFRETプローブは、トランスフェクション効率に比較的鈍感です。彼らは、励起源の変動および他の細胞内環境因子（ 例えば 、pHは、イオン）であれば、両方の蛍光団が同様に応答するように鈍感です。蛍光および生物発光プロモーター-レポーターは26,27を構築するとは異なり加えて、それらの応答は、転写遅延の対象ではありません。 レシオメトリックFRETプローブは、容易にかつ頻繁に、従来の広視野落射蛍光顕微鏡システムで使用されます。広視野顕微鏡はため、システムコスト、フルオロフォアの漂白、および十分な時間分解能で信号変化の捕獲に対する懸念の生細胞イメージングのためのライン走査型共焦点システムよりも好ましいです。また、単一細胞肛門細胞の大集団を超えるysisは、複数の視野を超える電動ステージと画像キャプチャで可能です。広視野顕微鏡は、ヘテロFRETプローブ信号の強度に基づいた分析が必要です。強度解析は、他のFRETの方法のような複雑なハードウェアを必要としませんが、より多くの取得後の作業は、フルオロフォアの行動や顕微鏡/イメージング・システム構成28の影響を補正するために必要とされます。フルオロフォアの捕捉発光強度は、励起エネルギー、フルオロフォア、量子収率、および合成フィルタ及びカメラ/検出器スペクトル感度と直線2の関数です。これらは、ドナーとアクセプターのために異なることがあり、定量的な分析のためのキャリブレーションを必要とします。また、アクセプター発光の画像化は蛍光体のスペクトルの重複によって影響される（ドナー励起光によって受容体の励起およびアクセプターの発光スペクトルにドナー発光のスルーブリード）2。4;単鎖二重鎖」プローブセル25,28を通じて異なる化学量論で存在してもよい場合の蛍光団。 &quot;&quot;プローブは、フルオロフォアは、一方で、それらの蛍光団がナノスケールで等モルであるため、内部的に正規化されている「単鎖」プローブは、同様の明るさ（吸光係数および量子収量の機能）、非線形検出器感度の効果は、バックグラウンド蛍光と23を必要とされる結合量子収量/検出器感度のために小さいだけ補正されているのである。従って、「単鎖」レシオメトリックFRETプローブは、最も容易に広視野顕微鏡24に実装されています。 本稿では、従来の広視野落射蛍光顕微鏡を使用して3Dハイドロゲル培養における生細胞のFRETイメージングを実行するための簡単​​な技術が記載されています。これは、簡単に相互に興味がよく研究室のように、すでに2DでFRET実験を行う研究室によって採用することができます微細組織における細胞シグナリング。ここでは、環状アデノシン一リン酸（cAMP）光架橋内生軟骨細胞におけるレベル（PC-ゲル、ポリエチレングリコールジメタクリレート）および熱応答性（TR-ゲル、マトリゲル）ヒドロゲルのFRETイメージングベースの測定と方法を示しています。レシオメトリックFRETプローブは、フォルスコリンに応答したcAMPへのATPの変換を触媒するアデニル酸シクラーゼのための化学的アゴニストcAMPレベルを検出するためのEPAC1（ICUE1）に基づいて利用されています。 cAMPは、Gタンパク質共役受容体のシグナル伝達を媒介する主要なセカンドメッセンジャーの一つであり、それは、直接のcAMP（EPACs）によって活性化される下流の交換タンパク質を含む種々の因子を活性化します。フルオロフォアは、cAMPは、FRETが低下EPACドメインに結合すると離れて移動します。ここに記載のヒドロゲル材料の製造、ICUE1プローブを用いた細胞のトランスフェクション、および3Dヒドロゲル中の細胞の埋め込みです。 3D FRET実験手順および必要な画像解析細胞あたりのプローブの活性を評価するために説明されています。また、広視野顕微鏡を用いて、2Dと3DでのFRET分析の固有の限界を議論します。それは、より生理的な文脈で分析を可能にし、より少ない画像補正および較正を必要とするので、ここで提示された技術は、既存の2次元方法に対する改善です。大きな有用性は、細胞トランスフェクションの好みを維持することができるが、多くの透明な材料を使用することができるという事実にあります。

<table><tbody><tr><td>ポリジメチルシロキサン(PDMS)[シルガード184エラストマーキット]</td><td>フィッシャーサイエンティフィック(エルスワース接着剤)</td><td>NC0162601</td><td>試薬</td></tr>ポリエチレン<tr><td>グリコールジメタクリレート(PEGDM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95904</td><td></td></tr>試薬<tr><td>3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6514</td><td></td></tr>試薬<tr><td>3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>440167</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ジメチルフェニルホスホナイト</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>149470-5g</td><td>試薬</td></tr><tr><td>2,4,6-トリメチルベンゾイル塩化</td>物フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>AC244280100</td><td>試薬</td></tr><tr><td>2-ブタノン</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>AC149670010</td><td></td></tr>試薬<tr><td>臭化リチウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AC199871000</td><td></td></tr>試薬 <tr><td>イソプロパノール</td><td>Σ Aldrich</td><td>190764</td><td>試薬</td></tr><tr><td>Sigmacote(シリコーン化試薬)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2</td><td>試薬</td></tr><tr><td>トルエン&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AC36441-0010</td><td>試薬</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH3025601</td><td></td></tr>試薬 <tr><td>Opti-MEM 還元血清培地、フェノールレッドなし(フェノールおよび無血清培地)</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td>試薬</td></tr><tr><td>FuGENE HD トランスフェクション試薬(トランスフェクション試薬)</td><td>プロメガ</td><td>E2311</td><td>試薬</td></tr><tr><td>セルストリッパー(細胞解離液)</td><td>コーニング</td><td>25-056-CI</td><td>試薬</td></tr><tr><td>成長因子 還元型マトリゲル、フェノールフリー</td><td>コーニング</td><td>356231</td><td>試薬</td></tr><tr><td>フォルスコリン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>F6886</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ピペットチップ (10,200,1,000 &mu;l)&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-707-474、02-707-478、02-707-480</td><td>使い捨て実験装置</td></tr><tr><td>パウダーフリー検査用手袋</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>19-149-863B</td><td>使い捨て実験装置</td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>01-213-100</td><td>使い捨て実験装置</td></tr><tr><td>生検パンチ (3 mm)</td><td>ミルテックス</td><td>3332</td><td>使い捨て実験装置</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-544C</td><td>使い捨て実験装置</td></tr><tr><td>プレコートガラスカバースリップ(エポキシシラン)</td><td>Arrayit</td><td>CCSL</td><td>使い捨て実験装置</td></tr><tr><td>ガラススライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12550D</td>使い捨て<td>実験装置</td></tr><tr><td>滅菌バイアル(15 ml、50 ml円錐形)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-959-70C、14-959-49A</td><td>使い捨て実験装置</td></tr><tr><td>細胞培養皿(6-まあ)</td><td>ファルコン</td><td>351146</td><td>使い捨て実験装置</td></tr><tr><td>電動ステージ付き落射蛍光顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>MEA53100(Eclipse TiE反転)</td><td>大型/非使い捨て実験装置</td></tr><tr><td>XYステージ用調整可能な試料ホルダー</td><td>ニコン</td><td>77011393</td><td>非使い捨て実験装置</td></tr><tr><td>60X(1.3 NA)対物レンズ(CFIプランアポクロマート60XHラムダ)</td><td>ニコン</td><td>MRD01605</td><td>使い捨て不可実験器具</td></tr><tr><td>CFP/YFP光源と励起・発光フィルターホルダー(ラムダ光源&ホイール、ラムダ発光フィルターシステム)</td><td>ニコン(Sutter Instrument reseller)</td><td>77016231、77016088</td><td>使い捨て不可実験器具</td></tr><tr><td>CYF/YFPフィルターセット</td><td>ニコン(クロマテクノロジー)</td><td>77014928</td><td>使い捨て不要実験器具</td></tr><tr><td>カメラ(ORCA Flash 4.0 v1)</td><td>ニコン(浜松)再販業者)</td><td>77054076</td><td>非使い捨て実験装置</td></tr><tr><td>NIS-Elements 40.20.02 顕微鏡ソフトウェア)</td><td>ニコン</td><td>MQS31100&nbsp;</td><td>使い捨て不可のラボ機器</td></tr><tr><td>プリズム (スプレッドシートおよびグラフ作成ソフトウェア)</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td>バージョン 6</td><td>使い捨て不可の実験装置</td></tr><tr><td>OmniCure S1000 365nmフィルターまたはその他の光源を備えたUVスポット硬化ランプシステム (&lambda; = 365 or 405)</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td>大型/非使い捨て実験装置</td></tr><tr><td>ピペットエイド&nbsp;</td><td>ドラモンド・サイエンティフィック社&nbsp;</td><td>DP-100</td><td>非使い捨て実験装置</td></tr><tr><td>血球計算計</td><td>ハウザー・サイエンティフィック</td><td>・ライヒェルト・ブライトライン 1475</td><td>非使い捨て実験装置</td></tr><tr><td>真空デシケーター チャンバー/デガッサー&nbsp;</td><td>大型</td><td></td><td>/使い捨て不可の実験器具</td></tr><tr><td>組織培養フード&nbsp;</td><td>大型</td><td></td><td>/非使い捨ての実験装置</td></tr><tr><td>化学ヒュームフード&nbsp;</td><td>任意の</td><td></td><td>大型/非使い捨ての実験機器</td></tr><tr><td>オーブン</td><td>任意の</td><td></td><td>大型/非使い捨ての実験機器</td></tr><tr><td>へら</td><td>使い捨て</td><td></td><td>でない実験装置</td></tr><tr><td>ビーカー</td><td>使い捨て</td><td></td><td>でない実験器具</td></tr><tr><td>インキュベーター&nbsp;</td><td>大型</td><td></td><td>/使い捨て不可の実験装置</td></tr></tbody></table>

三次元ハイドロゲルでイメージングをfret

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）の画像化は、リアルタイムで細胞生物学を調査するための強力なツールです。 FRETを利用した研究は、一般的に、三次元（3D）細胞の微小環境を模倣していない二次元（2D）培養物を用います。 3Dヒドロゲル環境内のセルの従来の広視野落射蛍光顕微鏡を用いてクエンチ発光FRETイメージングを実行するための方法が提供されます。ここで、プローブの活性化範囲にわたって線形比率をもたらすレシオメトリックFRETプローブの分析方法について説明します。細胞内の環状アデノシン一リン酸（cAMP）のレベルの測定は、EPAC1活性化（ICUE1）及びヒドロゲル材料の種類は、本明細書に光架橋ヒドロゲル（PC-ゲル依存シグナリングcAMPの相違を検出する能力のためにプローブを使用して、フォルスコリン刺激下の軟骨細胞で実証されていますポリエチレングリコールジメタクリレート）および熱応答性ハイドロゲル（TR-ゲル）。 2D FRET法と比較して、この方法は少し追加の作業が必要です。すでに2DでFRETイメージングを利用した研究所は、簡単に3D微小環境における細胞の研究を実行するには、この方法を採用することができます。さらに、操作された3D微細組織における高スループット薬物スクリーニングに適用することができます。さらに、このような異方性の測定と蛍光寿命イメージング（FLIM）としてFRETイメージングの他の形態では、共焦点、パルス、または変調された照明を使用して、高度な顕微鏡プラットフォームと互換性があります。

すべてのヒドロゲル前駆体細胞、及び鋳型は、上記のように調製しました。セルを含んだ前駆体溶液は、PDMSの型にキャストした後、カバーガラスの近くに細胞を固定化し、FRETイメージング解析（ 図1）を容易にするために、ゲル化/光架橋前に遠心分離しました。添付のカバーガラスを有するヒドロゲルは、（ 図2）顕微鏡イメージングのために準備されたPDMS撮像ウェル内に置きました。 図3Aに示すように、光学的構成及び画像取得パラメータは、設定されました。非バイナリのプローブのために必要とされるようにCFP-YFPの蛍光団のペアのための4つのすべてのFRET関連画像チャネルのキャプチャは、（下参照「光学研究会。「 図3に）示されています。しかし、この作品で唯一の2つの画像が一本鎖バイナリICUE1プローブ、QE = &quot;CFP CFP」とAEM =&quot; YFP YFP」（励起発光）のために必要とされます。複数のFOV（XY位置単数または複数）は、いくつかのセルが均一照明領域（ 図3B）内に居住する選択しました。時間経過の取得後、プローブ用の信号データはエクスポートされました。チャネル信号のバックグラウンド補正のために、細胞分析のためのROIは、実験の開始（ 図4）から閾値処理AEM画像を用いて命名しました。細胞は、（あまりにも暗くない）十分ではなく、高すぎる（明るすぎる）プローブ（ 図4B）を発現するもののような細胞プールの中から選択しました。各取得の画素ごとのQEとSE FRET比は、背景減算画像チャネルの浮動小数点除算を用いて計算しました。セル当たりの平均FRET比（ すなわち、ROIあたり）、算出した刺激の前にベースライン信号に正規化（ すなわち、すべての時点から減算ベースライン上の回帰）、および標準エラーとしてエラーバーでプロット（SEM）を意味します。 QEとCSEベースのFRET比ドの両方フォルスコリン刺激（100 nMで、 図5）の下で軟骨細胞における増加したcAMP活性をTECT。 QE信号が原因でハイドロゲル内に埋め込まれた軟骨細胞におけるcAMP活性の低い基底レベルに低下したため、QE FRET比は、CSE FRET比よりもバックグラウンド補正に敏感でした。どちらのハイドロゲルタイプ（TR-ゲルおよびPC-ゲル）フォルスコリンの添加に増加したcAMPシグナル伝達応答を示す経時FRET比の増加（ 図6）を示しました。 QE FRET比で示すように、PC-ゲル、ヒドロゲル中の軟骨細胞は、cAMPの大きな変化（図示）およびcAMP（E QEの高い基礎レベルを示し= E QE = TR-ゲルで0.09 対 PC-ゲルで0.19、 ）は、ベースラインを差し引い図には示されていません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig1.jpg" /> 図1： 光架橋ヒドロゲル内のセル・ディストリビューション（PC-ゲル） </強いです&gt; A：細胞を含んだヒドロゲル前駆体は、カバースリップ周辺焦点面での細胞の数を最大にするために遠心分離しました。 B：これは、FOV内の細胞の数を増加させ、平面セルのうちからバックグラウンド信号を最小限に抑えることができます。 （スケールバー= 200μm）は<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig2.jpg" /> 図2：PDMS皿にヒドロゲル ヒドロゲルは、顕微鏡イメージングと検体刺激のためのカバーガラスをベースとよく背の高いPDMS（ヒドロゲルの10倍容量）の内側に配置しました。それらは、アッセイを通して所定の位置に残るようにPCゲルヒドロゲルは透明でカバースリップに接着されています。 PDMSは十分にに加えて、より広い生検パンチを使用して、ヒドロゲルの体積よりも10倍多くの媒体を含むように大きくすることができますhicker PDMSシート。 （スケールバー= 2ミリメートル） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig3.jpg" /> 図3：FRET イメージングのための取得の設定 ：買収は、複数の場所での画像取り込みごとに7秒を設定しました。 QE FRET比計算のために、2つだけの画像チャネルは、QE = &quot;CFP CFP」とAEM =&quot; YFP YFP」（励起発光は）の下で、ここで使用ICUE1プローブ（バイナリ単鎖プローブ）のために必要とされる「光学研究会。 &quot;顕微鏡ソフトウェアのλ]タブ内の列。 B：のFOV（「XY」の位置）は、いくつかの細胞が均一照明領域内に居住する選択しました。画像の下のプロットは青色に沿って照明強度がラインを矢印付き示していますそれは、FOVの中心を通って横断する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig4.jpg" /> 図4：FRETイメージング解析のためのROIの選択 A：細胞を含まない関心領域（ROI）は、各チャネルのバックグラウンド信号を補正するために選択しました。細胞密度または遊走が高い場合、または細胞が均一な照明フィールド内にないときに遮光マスクを使用しない場合、無細胞ヒドロゲルの画像ではなく、バックグラウンド減算のために使用することができます。 B：細胞のROIを画像しきい値とAEMチャネルのバイナリマスクを用いて選択しました。バックグラウンドnから生成された細胞外の比率の包含に悪影響セルあたりの平均FRET比の算出に影響を与える細胞よりも大きなROIを選択オワーズ。この比率を過小評価として細胞あたりの各チャンネルの平均を用いた携帯FRET比の算出は推奨されません。 （スケールバー= 50μm）は<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig5.jpg" /> 図5：熱応答性ハイドロゲル（TR-ゲル）でFRET比の比較 QEとSEベースのFRET比の両方が、フォルスコリン刺激下の軟骨細胞で増加しcAMP活性を検出します。フォルスコリンは、cAMPの産生を誘導するアデニルシクラーゼアゴニストです。 ICUE1プローブがキャンプを結合する場合にFRETが減少し、したがって、QE FRET比（E QE = SQE /（SAEM X QS））が増加します。 CSE / SAEM -逆に、SE FRET比が減少し、従って= 1 E SEとしてプロットされています。ヒドロゲル埋め込まれた軟骨細胞では、QE FRET比率が低い基礎cAMP活性にSE FRET比よりもバックグラウンド補正QE信号が低いために、より敏感です。エラーバー= SEM、N = 25 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig6.jpg" /> 図6： 異なるヒドロゲルでFRET比の比較 両方のハイドロゲルタイプで軟骨細胞を経時的に増加QE FRET比によって示されるように、cAMP活性の増加に伴って、フォルスコリン刺激に応答しました。ヒドロゲル型の影響フォルスコリンに、基底細胞cAMP活性の透過性の違いなど、いくつかの効果を介して、細胞応答（E QE = E QE 対 PC-ゲル中0.19 = 0.09 TR-ゲルで、図示していません）。エラーバー= SEM、nはTR-ゲル用= 25、nはPC-ゲル= 15のため<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）画像化は、リアルタイム細胞生物学研究のための強力なツールです。ここで、従来の落射蛍光顕微鏡を用いて生理学的3次元（3D）ヒドロゲル微小環境におけるFRETイメージング細胞のための方法が提示されます。活性範囲にわたって線形比率をもたらすレシオメトリックFRETプローブの分析が記載されています。

三次元ハイドロゲルでイメージングをFRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

この実験方法の全体的な目標は、自然組織を模倣した三次元ハイドロゲル内に埋め込まれた細胞のFRETイメージングを使用して、細胞内シグナル伝達のリアルタイム研究を可能にすることです。この方法は、最適な生体材料の開発や人工3D微小組織におけるハイスループット薬物スクリーニングなど、発生生物学、薬理学、再生医療の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、FRETを従来の広視野顕微鏡システムを使用して、多数のヒドロゲルタイプの多数の細胞に使用できることです。ハイドロゲルキャスティング用の型を作製し、テキストプロトコルに従って培養細胞をヒドロゲル溶液に懸濁した後、組織培養フード内で、無菌技術を使用して前駆体を含む細胞をキャスティング型に加えます。架橋する前に、ヒドロゲル前駆体に懸濁した細胞をセンターフュージして、細胞を単一の焦点面に閉じ込め、面外シグナルを最小限に抑えることでイメージングを最適化します。次に、PCハイドロゲルを架橋するために、UVA光源を厚さ1ミリメートルあたり1ミリメートルの2乗で3.2ジュール/センチメートルの2乗に等しい露光時間で使用し、前駆体を含む細胞を照射します。あるいは、より安価なハンドヘルド歯科用ランプを使用してください。ハイドロゲルを過度に露出させると、細胞の生存率が低下するため、避けてください。代わりに、物理的に架橋されたハイドロゲルは摂氏37度に配置されます。架橋後、PDMSハイドロゲル鋳造型を取り外し、以前に準備したPDMSディッシュと交換します。滅菌ヘラを使用してPDMSをガラスに押し下げ、接着します。PDMSディッシュに作成したウェルに、フェノールフリーの無血清培地または化学的に定義された培地を、ハイドロゲルを浸漬しておくためのカバースリップで加えます。皿を摂氏37度で30分間インキュベートします。ハイドロゲルを塗布したPDMSディッシュを顕微鏡ステージに固定し、オイルを対物レンズに塗布したら、透過光を使用してイメージング用の細胞を少なくとも15個見つけ、蛍光イメージングによるトランスフェクションを確認します。顕微鏡ソフトウェアで、視野の中心付近にあるいくつかのセルから選択してFRET画像チャンネルのカメラ設定を行い、テキストプロトコルに従って画像チャンネルごとの露出とゲインを最適化します。ハイドロゲルの中心に近く、比較的平坦な照明フィールド内で、明るすぎず暗すぎず、FRET比が00〜1.0のセルを選択します。次に、複数の視野を選択して、少なくとも15個のトランスフェクション細胞の画像を取得します。露出を制限するために、終了したらライトをオフにしてください。タイムラプス画像取得のキャプチャレートを設定するには、キャプチャの周期を入力します。ベースライン信号の捕捉には、視野あたり 5 秒ごとなど、速い速度を使用し、その後の長期的な信号伝達速度論には低速の速度を使用します。[今すぐ実行] を選択して画像取得を開始し、5 分間画像をキャプチャして、指定した視野でのプローブ応答のベースラインを確立します。画像取得の5分後、目的のアゴニストまたはアンタゴニストをピペットでピペットで移動し、ピペッティングで混合し、イメージングを続けます。テキストプロトコルに従ってFRETキャリブレーションを実施した後、顕微鏡ソフトウェアで背景の関心領域アイコンの矢印を選択し、楕円形の背景の関心領域の描画を選択します。セルの近くの視野ごとに 1 つの関心領域 (ROI) を描画して指定し、背景レベルを定義します。「背景オフセットの更新を保持」が選択されていることを確認し、「背景関心領域」アイコンをクリックして、背景関心領域の表示をアクティブにします。または、関心領域アイコンを選択し、関心領域のプロパティを [背景の関心領域として使用] に設定し、関心領域は各マルチポイントで異なります。関心領域の背景アイコンを使用して、「関心領域を使用して背景を減算」を選択します。ポップアップ ウィンドウの [Subtract Background Region of Interest] で [Every Image] を選択し、[Apply To] で [All Frames] を選択します。各視野で、アクセプター放出チャネルとバイナリ マスクを使用してセルの周囲の関心領域を定義するには、メニューの [バイナリ]、[しきい値の定義] を使用し、[現在のフレームに適用] を選択します。次に、下限しきい値を調整してセルを選択します。次に、必要に応じて、Binary Close 関数を使用してバイナリ マスクの穴を埋めます。次に、[Region of Interest] アイコンを使用して [Copy Binary to Region of Interest] を選択し、バイナリ マスクを関心領域として保存します。後続の視野の関心領域を、既存の関心領域のプールに追加します。誤った関心領域をすべて削除します。次に、関心領域を右クリックし、そのプロパティが標準関心領域として使用されており、関心領域が各マルチポイントで異なることを確認します。関心のある細胞領域は手描きにすることができますが、偽の値を取り除くように注意する必要があります。このプロトコルには、フラット照明フィールドの外側にある細胞とフラットフィールドを持たない顕微鏡の手順が含まれています。ゲル化前にヒドロゲル前駆体を遠心分離すると、カバーガラス近くの1つの焦点面にある細胞の数が最大化されました。これにより、バックグラウンドノイズが最小限に抑えられ、イメージングスループットが向上しました。このFRET実験では、クエンチエミッション(QE)のFRET比の計算に、1本鎖バイナリICUE1プローブに必要な画像は、励起と発光のQEとCFP CFPと、励起と発光のアクセプターエミッションとYFP YFPの2つの画像のみでした。ここに示すように、いくつかの細胞が均一な照明領域内に存在する複数の視野が選択されました。チャネルシグナルのバックグラウンド補正および細胞解析のROIは、実験開始時の閾値付きアクセプター発光画像を使用して指定しました。また、ここに示すように、十分なプローブを発現する細胞を選抜しました。ピクセルあたりのQEおよび増感放出FRET比とセルあたりの平均FRET比を計算しました。SE比の逆数を計算し、両方の比率を正規化しました。フォルスコリン刺激下では、QEおよびSEベースのFret比の両方が、軟骨細胞のサイクリックAMP活性の増加を検出します。物理的に架橋されたゲルと化学的に架橋されたゲルの両方で、時間の経過とともにQE FRET比が増加し、フォルスコリンの添加に対するサイクリックAMPシグナル伝達応答の増加が示されました。この手順は、FRAP、フリムフレット、フレットおよび異方性測定などの他の顕微鏡技術と併用して、異なる微小組織タイプ間の透過性と細胞シングルリングの違いは何かなどの質問に答えることができます。架橋はPDMSの近くで消光されるため、光架橋ハイドロゲルの型は、ハイドロゲル自体よりも直径がわずかに大きいように設計することを覚えておくことが重要です。

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Research

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Biology

生物学

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リファレンスフリートラクションフォース顕微鏡プラットフォームの製造と実装

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ライブ顕微鏡イメージング下での3Dヒドロゲルの制御株

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神経堤細胞の機械的信号を研究するための最適化されたO9-1/ヒドロゲルシステム

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牽引力顕微鏡における応用のためのハイドロゲルパターン法を用いた細胞接着制御

我々は、軟質ヒドロゲル上の細胞外マトリックスタンパク質のドットアレイの単一の減法パターニングステップによるマイクロコンタクト印刷に基づく、細胞牽引力を測定するための標準的な方法の改善を説明する。この方法は、細胞クラスター形状を制御するために不可欠な島パターンのより簡単でより一貫した作製を可能にする。...

マイクロパターントラクション顕微鏡のパターン生成

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学ぶ三次元ハイドロゲル内細胞のFRETイメージング法。蛍光共鳴エネルギー移動を用いて細胞内シグナル伝達をリアルタイムで観察し、再生医療や創薬スクリーニングの研究に応用できます。

三次元ハイドロゲルでイメージングをFRET

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