三次元ハイドロゲルでイメージングをFRET
2016年8月1日
蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）画像化は、リアルタイム細胞生物学研究のための強力なツールです。ここで、従来の落射蛍光顕微鏡を用いて生理学的3次元（3D）ヒドロゲル微小環境におけるFRETイメージング細胞のための方法が提示されます。活性範囲にわたって線形比率をもたらすレシオメトリックFRETプローブの分析が記載されています。
この実験方法の全体的な目標は、自然組織を模倣した三次元ハイドロゲル内に埋め込まれた細胞のFRETイメージングを使用して、細胞内シグナル伝達のリアルタイム研究を可能にすることです。この方法は、最適な生体材料の開発や人工3D微小組織におけるハイスループット薬物スクリーニングなど、発生生物学、薬理学、再生医療の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、FRETを従来の広視野顕微鏡システムを使用して、多数のヒドロゲルタイプの多数の細胞に使用できることです。
ハイドロゲルキャスティング用の型を作製し、テキストプロトコルに従って培養細胞をヒドロゲル溶液に懸濁した後、組織培養フード内で、無菌技術を使用して前駆体を含む細胞をキャスティング型に加えます。架橋する前に、ヒドロゲル前駆体に懸濁した細胞をセンターフュージして、細胞を単一の焦点面に閉じ込め、面外シグナルを最小限に抑えることでイメージングを最適化します。次に、PCハイドロゲルを架橋するために、UVA光源を厚さ1ミリメートルあたり1ミリメートルの2乗で3.2ジュール/センチメートルの2乗に等しい露光時間で使用し、前駆体を含む細胞を照射します。
あるいは、より安価なハンドヘルド歯科用ランプを使用してください。ハイドロゲルを過度に露出させると、細胞の生存率が低下するため、避けてください。代わりに、物理的に架橋されたハイドロゲルは摂氏37度に配置されます。
架橋後、PDMSハイドロゲル鋳造型を取り外し、以前に準備したPDMSディッシュと交換します。滅菌ヘラを使用してPDMSをガラスに押し下げ、接着します。PDMSディッシュに作成したウェルに、フェノールフリーの無血清培地または化学的に定義された培地を、ハイドロゲルを浸漬しておくためのカバースリップで加えます。
皿を摂氏37度で30分間インキュベートします。ハイドロゲルを塗布したPDMSディッシュを顕微鏡ステージに固定し、オイルを対物レンズに塗布したら、透過光を使用してイメージング用の細胞を少なくとも15個見つけ、蛍光イメージングによるトランスフェクションを確認します。顕微鏡ソフトウェアで、視野の中心付近にあるいくつかのセルから選択してFRET画像チャンネルのカメラ設定を行い、テキストプロトコルに従って画像チャンネルごとの露出とゲインを最適化します。
ハイドロゲルの中心に近く、比較的平坦な照明フィールド内で、明るすぎず暗すぎず、FRET比が00〜1.0のセルを選択します。次に、複数の視野を選択して、少なくとも15個のトランスフェクション細胞の画像を取得します。露出を制限するために、終了したらライトをオフにしてください。
タイムラプス画像取得のキャプチャレートを設定するには、キャプチャの周期を入力します。ベースライン信号の捕捉には、視野あたり 5 秒ごとなど、速い速度を使用し、その後の長期的な信号伝達速度論には低速の速度を使用します。[今すぐ実行] を選択して画像取得を開始し、5 分間画像をキャプチャして、指定した視野でのプローブ応答のベースラインを確立します。
画像取得の5分後、目的のアゴニストまたはアンタゴニストをピペットでピペットで移動し、ピペッティングで混合し、イメージングを続けます。テキストプロトコルに従ってFRETキャリブレーションを実施した後、顕微鏡ソフトウェアで背景の関心領域アイコンの矢印を選択し、楕円形の背景の関心領域の描画を選択します。セルの近くの視野ごとに 1 つの関心領域 (ROI) を描画して指定し、背景レベルを定義します。
「背景オフセットの更新を保持」が選択されていることを確認し、「背景関心領域」アイコンをクリックして、背景関心領域の表示をアクティブにします。または、関心領域アイコンを選択し、関心領域のプロパティを [背景の関心領域として使用] に設定し、関心領域は各マルチポイントで異なります。関心領域の背景アイコンを使用して、「関心領域を使用して背景を減算」を選択します。
ポップアップ ウィンドウの [Subtract Background Region of Interest] で [Every Image] を選択し、[Apply To] で [All Frames] を選択します。各視野で、アクセプター放出チャネルとバイナリ マスクを使用してセルの周囲の関心領域を定義するには、メニューの [バイナリ]、[しきい値の定義] を使用し、[現在のフレームに適用] を選択します。次に、下限しきい値を調整してセルを選択します。
次に、必要に応じて、Binary Close 関数を使用してバイナリ マスクの穴を埋めます。次に、[Region of Interest] アイコンを使用して [Copy Binary to Region of Interest] を選択し、バイナリ マスクを関心領域として保存します。後続の視野の関心領域を、既存の関心領域のプールに追加します。
誤った関心領域をすべて削除します。次に、関心領域を右クリックし、そのプロパティが標準関心領域として使用されており、関心領域が各マルチポイントで異なることを確認します。関心のある細胞領域は手描きにすることができますが、偽の値を取り除くように注意する必要があります。
このプロトコルには、フラット照明フィールドの外側にある細胞とフラットフィールドを持たない顕微鏡の手順が含まれています。ゲル化前にヒドロゲル前駆体を遠心分離すると、カバーガラス近くの1つの焦点面にある細胞の数が最大化されました。これにより、バックグラウンドノイズが最小限に抑えられ、イメージングスループットが向上しました。
このFRET実験では、クエンチエミッション(QE)のFRET比の計算に、1本鎖バイナリICUE1プローブに必要な画像は、励起と発光のQEとCFP CFPと、励起と発光のアクセプターエミッションとYFP YFPの2つの画像のみでした。ここに示すように、いくつかの細胞が均一な照明領域内に存在する複数の視野が選択されました。チャネルシグナルのバックグラウンド補正および細胞解析のROIは、実験開始時の閾値付きアクセプター発光画像を使用して指定しました。
また、ここに示すように、十分なプローブを発現する細胞を選抜しました。ピクセルあたりのQEおよび増感放出FRET比とセルあたりの平均FRET比を計算しました。SE比の逆数を計算し、両方の比率を正規化しました。
フォルスコリン刺激下では、QEおよびSEベースのFret比の両方が、軟骨細胞のサイクリックAMP活性の増加を検出します。物理的に架橋されたゲルと化学的に架橋されたゲルの両方で、時間の経過とともにQE FRET比が増加し、フォルスコリンの添加に対するサイクリックAMPシグナル伝達応答の増加が示されました。この手順は、FRAP、フリムフレット、フレットおよび異方性測定などの他の顕微鏡技術と併用して、異なる微小組織タイプ間の透過性と細胞シングルリングの違いは何かなどの質問に答えることができます。
架橋はPDMSの近くで消光されるため、光架橋ハイドロゲルの型は、ハイドロゲル自体よりも直径がわずかに大きいように設計することを覚えておくことが重要です。
概要
この記事では、三次元ヒドロゲル微小環境における細胞のFörster共鳴エネルギー移動（FRET）イメージングの方法を紹介します。この技術は、細胞内シグナリングのリアルタイム研究を可能にし、従来のエピフルオレスセンス顕微鏡法を用いて適用できます。
主要な研究要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 発生生物学
- 薬理学
背景
- FRETイメージングは細胞プロセスを研究する上で貴重なツールです。
- 三次元ヒドロゲルは自然な組織環境を模倣できます。
- この方法は複数の細胞のハイスループット解析を可能にします。
- 従来の顕微鏡技術をこのアプローチに利用できます。
研究の目的
- 細胞内シグナリングのリアルタイム観察を可能にすること。
- 再生医療用のバイオマテリアルの開発を促進すること。
- エンジニアリングされたマイクロティシューでの薬物スクリーニングプロセスを改善すること。
使用した方法
- ヒドロゲル鋳造用のモールドの製作。
- 培養細胞のヒドロゲル溶液への懸濁。
- UVA光またはデンタルランプを用いたヒドロゲルの架橋。
- FRETイメージングのための顕微鏡設定の構成。
主な結果
- ヒドロゲルに埋め込まれた細胞のイメージングの成功。
- バックグラウンドノイズを最小限に抑えるためのイメージング条件の最適化。
- FRET分析のためのベースライン信号の確立。
- バックグラウンド補正のための関心領域の効果的な使用。
結論
- この方法は3D環境での細胞シグナリング研究能力を向上させます。
- 様々な生物学分野における将来の研究の枠組みを提供します。
- ヒドロゲルにおけるFRETイメージングは薬物発見の進歩につながる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
FRET imaging in three-dimensional hydrogels enables real-time quantification of intracellular signaling within physiologically relevant microenvironments, directly addressing the limitations of traditional 2D assays. This capability enhances predictive confidence in early discovery and supports mechanistic de-risking for drug screening and biomaterial development. The method's compatibility with standard widefield microscopy and high-throughput workflows positions it as a scalable asset for enterprise R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of intracellular signaling pathways in 3D, supporting functional target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by modeling tissue-like environments for hypothesis testing.
- Improves predictive confidence by capturing context-dependent cellular responses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 3D biological systems for downstream compound screening workflows.
- Supports assay standardization and reproducibility through ratiometric FRET quantification.
- Enables high-throughput imaging and analysis of multiple cells across hydrogel types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro signaling measurements with disease-relevant 3D microenvironments.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by modeling tissue-specific responses.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by revealing material-dependent signaling differences.
Pipeline & Workflow Integration
This FRET imaging method integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, bridging the gap between in vitro assays and physiologically relevant models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in 3D cellular contexts.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound evaluation in engineered microtissues.
- Analytics: Provides ratiometric FRET measurements and background-corrected outputs for robust data comparison.
- Translational Research: Enables alignment of in vitro findings with in vivo-like tissue responses.
- Enterprise Reuse: Adaptable to various hydrogel systems and compatible with multiple microscopy platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by modeling relevant biology early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in FRET probe design and quantitative imaging analysis.
- Needs access to widefield epifluorescence microscopy and compatible hydrogel fabrication tools.
- Demands cross-team standardization of imaging parameters and data processing workflows.
- Adaptable across different hydrogel chemistries and cell types with protocol optimization.
- Throughput and imaging depth may be limited by hydrogel opacity and microscope configuration.
