老化のヒトの疾患に関与する遺伝子を研究するために使用される遺伝子改変マウス用表現型レジメン

このテストレジメンの全体的な目標は、行動表現型と組織の構造と機能に関するその後の詳細な調査を指示するための最初の表現型パイプラインとして使用できる一連の簡単なテストを確立することです。ヒト疾患の行動表現型と細胞表現型がマウスモデルで再現されているかどうか。この手法の主な利点は、そのような実験の経験がない実験室で、多額の投資をせずにテストを実行でき、さらに詳細な研究に情報を提供できることです。

生後4日目から10日目まで毎日後肢テストを実施して、近位後肢の筋力、衰弱、疲労を評価します。まず、マウスをテストエリアに30分間順応させます。その間、70%エタノールで洗い流し、次に1つまたは2つの綿球をチューブの底に押し込んで、新しい500ミリリットルの円錐管を準備します。

このチューブをテストのために垂直位置に固定します。テストを受けていないときは、子犬をダムと一緒に保ち、体温を維持してください。30分順応した後、子犬をケージから取り出し、その体重を記録します。

次に、新生児の後肢をチューブの縁にそっと吊り下げて、子犬が綿に面するようにします。次に、子犬がプルを試みた回数を数え、落下までの待ち時間を測定します。30秒待ってから、テストを繰り返します。

2回目のテストの後、子犬にマーカーでラベルを付けます。次に、ホームケージの寝具で子犬を優しくこすり、ダムに戻します。古いP8の子犬はマークできないため、つま先の切り取りで識別します。

次の子犬に進む前に、試験管を70%エタノールで拭き取ります。離乳観察テストをP19からP21まで毎日実施して、運動と一般的な活動レベルを採点します。マウスをテストエリアに30分間順応させることから始めます。

子犬が順応している間に、アリーナを準備します。プレキシガラスのテストボックスに、2インチ四方の6×6のグリッドをマークします。ボックスを使用する前に、70%エタノールで清掃してください。

次に、ボックス全体の側面図が視野を埋めるようにビデオ カメラを配置します。目新しさを取り入れないように、周囲の外観を標準化します。テストの前に、離乳を清潔な保持カップに移し、その重量を記録します。

その後、ビデオ録画を開始しました。まず、マウスの識別番号、その年齢、現在の日付が記載されたテストIDカードを撮影します。次に、マウスをホールディングカップから中央の正方形に移します。

3分間、両前足が交差する線の数を数えます。3分後、マウスを清潔なケージに戻し、ビデオ録画を終了します。すべてのテストの間に、70%エタノールで箱を清掃します。

ビデオから、マウスが両前足を支えずに立っているときの飼育イベントを数えます。また、両方の前足が掃除をしているときに発生するグルーミングイベントもカウントします。P22とP26の間の隔日で握力テストを実施して、神経筋強度を評価します。

いつものように、マウスがテストエリアに適応するまで30分待ちます。試験装置は、メッシュグリッド付きのプレキシガラスボックスです。70%エタノールで両方を洗浄します。

次に、箱の底にパッド用のプチプチを敷き詰め、プチプチを紙で覆って排泄物を吸収します。テストマウスを分離し、個々のカップにロードします。次に、最初のマウスを金網の中央に置き、メッシュをボックスの柔らかい表面から10〜20センチメートル上にゆっくりと反転させます。

落下までの遅延を測定するか、マウスが落下しない場合は 60 秒後にテストを終了します。次に、最初のマウスを保持カップに戻します。テストの合間に、メッシュを70%エタノールで拭き、プチプチの上に紙を交換します。

次に、グループ内の他の2匹のマウスでテストを行います。各マウスを 1 回テストした後、このプロセスをさらに 2 回繰り返し、マウスごとに 3 回の試行を行います。グループ内のマウスが3匹未満の場合は、少なくとも5分の試行間回復時間があることを確認してください。

NADHジアホラーゼ染色剤の場合、作りたてのNADH溶液と作りたてのNBT溶液を等量組み合わせます。次に、各スライドに1ミリリットルの染色溶液を加え、スライドを摂氏37度の加湿チャンバーで30分間インキュベートします。コハク酸ヒドロゲナーゼ染色剤として、0.1モルのコハク酸ナトリウム、1.25モルのNBT、および0.2モルのリン酸緩衝液の溶液を調製します。

次に、各スライドに1ミリリットルを追加します。スライドを加湿チャンバーに詰め、スライドを摂氏37度で1時間インキュベートします。いずれかの染色液とインキュベートした後、染色液を吸引し、スライドを蒸留水で3回洗浄します。

次に、濃度が増減する一連のアセトン浴でスライドを洗います。アセトンの各濃度で、洗浄ごとに2分間、3回の洗浄を行います。最後に、スライドを蒸留水で3回すすぎます。

次に、スライドを水性媒体に取り付けます。HTRA2発現のないマウスを、記載された一連の試験を用いて検討し、同腹仔対照と比較した。P4 と P6 の間で、プルの数や落下までの待ち時間に変化は見られませんでした。P7とP10の間では、神経筋強度の低下が認められました。

活性試験では、HTRA2ノックアウトマウスの活性が低下しました。HTRA2ノックアウトマウスも、金網グリップ試験で強度の低下を示しました。H染色とE染色は、HTRA2ノックアウトマウスは、P35の対照と比較して網膜構造に明らかな変化がなかったことを示しています。

最後に、電子伝達鎖複合体の活性に対する組織化学的染色を用いて、呼吸酵素機能の変化を同定した。HTRA2ノックアウトマウスでは、対照と比較して染色が減少しました。これは小脳と線条体に認められましたが、皮質には認められませんでした。

このビデオを見れば、遺伝子改変マウスの活動と神経筋強度を評価する方法、およびこれらの研究を細胞軸と組み合わせる方法についてよく理解できるはずです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。