Name: 老化のヒトの疾患に関与する遺伝子を研究するために使用される遺伝子改変マウス用表現型レジメン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学ぶ遺伝子改変マウスの表現型評価法。HtrA2遺伝子欠損マウスを用いた後肢筋力テストと行動観察により、パーキンソン病関連の神経学的欠陥を評価します。初心者でも実施可能な初期スクリーニング手法です。

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この研究のための資金は、シャクナゲ医療財団とイェール大学医学部ディーンの研究基金（JH）から来ました。私たちは行動実験のヘルプは博士クレアケーニッヒに感謝します。遺伝子操作したマウス系統はOzgene（パース、オーストラリア）で生成されました。

倫理文：動物に関わる研究は、実験動物の管理と使用に関するガイドとイェール大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）における衛生勧告の国立研究所に準拠して実施しました。 遺伝子改変マウスの1行動試験注：すべてのマウスは取り扱いに慣れの違いを制限するために、同じ試験レジメンに供されるべきです。試験日の同じ時間に毎回実行されるべきです。 <ol><li>新生児後肢テスト 注：後肢試験は、近位後肢の筋肉の強さ、弱さや疲労を評価するために、P10に生後日（P）4から毎日行われています。 <ol><li>交通マウステストエリアへと試験前に30分間休ませることができます。 </li><li> Tの底部に2つ（P4-P8）または1（P9-P10）、コットンボールを押し込み、70％エタノールを用いて50mlコニカルチューブを洗浄することにより、試験装置を準備宇部および垂直位置に固定します。 </li><li>ケージから1子犬を削除し、重量を記録します。テストが行​​われていないときはいつでも熱パッドの上にトレイを保持するの子犬を保管してください。 </li><li>そっとそれはコットンボールに向かって下向きにされるように、円錐管の縁の上に新生児の後肢を一時停止します。作られたプル試行回数をカウントし、ストップウォッチを使用して落下するレイテンシを測定します。 </li><li>マーカーで子犬にラベルを付け、その後もう一度繰り返します。その後、つま先のクリッピングによってP6仔を識別します。交換する前に、ホームケージから寝具で穏やかに子犬をこします。 </li><li> 70％エタノールでコニカルチューブを拭きます。 </li><li>全体のゴミがテストされるまで、次の子犬でのテストを繰り返します。 </li><li>コットンボールと円錐管で廃棄してください。 70％エタノールですべての機器を清掃してください。 </li></ol></li><li>離乳観察試験 注：離乳観察試験は、運動と一般的な活動のレベルを獲得するためにP19からP21に毎日投与されます。 <ol><li>検査領域Aに搬送マウスndは試験前に30分間休ませることができます。 </li><li> 70％エタノールで洗浄することにより、基材上に2インチの正方形の6x6のグリッドでマークされたプレキシグラスのテストボックスを用意します。全体ボックス視野にあるような側に映像機器を設定します。セットアップと新規性を導入することを避けるために、毎日同じことを周囲に保ちます。 </li><li>清潔保持カップにケージや場所から1離乳を削除してください。レコードの重み。 </li><li>マウスの識別番号、年齢およびテストの日付で、テスト識別カードを撮影して、ビデオ録画を開始します。中央広場にカップを保持してから、マウスを転送します。 3分間の時間は、試験中、マウスの両方の前足が横断する行数をカウントします。 </li><li>きれいなケージとエンドビデオ録画にマウスを返します。 </li><li> 70％エタノールで試験装置を清掃してください。 </li><li>すべてのゴミがテストされるまで、その後ホームケージにすべての仔を返す繰り返します。 </li><li> 70％エタノールですべての検査機器を清掃してください。 </li><li&gt;ビデオを使用して、マウスがサポートを明確に両方の前足で略で、目視観察した後に集計し、両前足をクリーニングに従事しているイベントを、グルーミングてイベントを飼育数を定量します。 </li></ol></li><li>ワイヤメッシュグリップ強度試験 注：握力試験はP22とP26との間の交互の日に行われ、神経筋の​​強度を評価します。 <ol><li>テストエリアへの交通マウスとは、試験前に30分間のホームケージで休むことができます。 </li><li> 70％エタノールでプレキシガラスボックスとメッシュグリッドを洗浄することにより、装置を準備します。箱の底にプチプチを置き、紙でカバーしています。 </li><li>個々の保持カップに入れる3のグループに別々のマウス、。 </li><li>ワイヤーメッシュの中央に最初のマウスを置き、ゆっくりとプレキシガラス箱の底に柔らかい表面上に10〜20センチメートルを反転。ストップウォッチを使用して落下するレイテンシを測定します。マウスがない場合は60秒が経過した後にテストを終了秋。 </li><li>カップを保持するマウスを返し、70％エタノールでメッシュを拭くとプチプチの上に紙を交換してください。最初に戻る前にグループ内の残りの2匹のマウスに試験を行います。各マウスは、合計3回テストが完了するまで繰り返します。 </li><li>きれいなケージにグループを戻し、残りの基に進みます。どのグループでも、3匹のマウスよりも少ない場合、5分間トライアル回復間隔が許可されていることを確認。 </li><li>ホームケージにすべてのマウスを返し、70％エタノールで紙ときれいな検査機器を処分。 </li></ol></li></ol>網膜構造の2.検討<ol><li>腹腔内ケタミン注射（100mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）により、P30-35に動物Anaesthetize。フットパッドをつまんで麻酔の深さを評価し、IACUCガイドラインに沿って、応答の不存在下でのみ進行します。 4％PFA / PBS 48で灌流します。 </li><li>目を削除するには、切開SIで肌をきれいに頭蓋底の皮膚を切断する前に、70％エタノールでTE。 70％エタノールで頭蓋骨とクリーンを露出する肌をバックピール。きれいな楽器を使用して、慎重に眼窩に到達し、目を露出するように頭蓋骨を切断。優しくソケットから目を削除し、PBSですすぎ、視神経を切断。 </li><li>室温で10分間、4％PFA / PBS中で目を修正しました。 </li><li> PBSを含む小さなペトリ皿に目を置きます。ステッチ除去はさみを使用して角膜の中央に小さな切開を行います。角膜と強膜の間のエッジを切断することにより、角膜を削除します。アイリスを削除するには、ピンセットを使用します。最後に、所定の位置に網膜無傷でレンズを残して、RPE層をはがします。 注意：4％PFA / PBSの固定がRPEを簡単に網膜の外側から剥離することを可能にするRPEの剥離の原因となります。 </li><li>再修正室温で15分間、4％PFA / 30％スクロース/ PBSでPBSを含むペトリ皿に目を返す前に。 lenは引き出しそれとともに硝子体をもたらし、鉗子を使用してね。 </li><li>一晩4℃で30％スクロースでCryoprotect。 </li><li>最適切削温度化合物（OCT）と新鮮な10月を含む埋め込む金型への転送でコート目。矢状面は、できるだけ少ない動きを用いて気泡の導入を避ける、すくい面と平行になるように目を向けます。ドライアイス/エタノール浴中で金型を浸漬することにより、フラッシュ凍結。 -80℃で保存をブロックします。 </li><li>クライオスタットを用いて、20μmの矢状切片をカットし、前洗浄スライド上に集めます。 </li><li>標準的なプロトコル49に従ってヘマトキシリンおよびエオシンで染色切片。明視野顕微鏡のために装備光学顕微鏡を用いた画像。 </li></ol> 3.組織化学染色<ol><li>試料調製<ol><li>オープンドロップ吸入イソフルラン過剰摂取（プロピレングリコール中30％）を使用して、P30-35で動物を安楽死させます。停止によって安楽死を評価します呼吸、心拍およびフットパッドをつまんに対する応答の欠如。 IACUCのガイドラインに沿って、頸椎脱臼および臓器摘出により死亡を確認。 </li><li>頭蓋底の皮膚を切開する前に、70％エタノールで切開部位の皮膚をきれいに、脳を削除します。 70％エタノールで頭蓋骨とクリーンを露出する肌をバックピール。きれいな楽器を使用して、慎重に頭蓋骨を切断し、脳を露出するように除去します。膜を外し、静かに頭蓋骨の空洞から脳を削除します。 PBSですすいでください。 </li><li>新鮮な10月を含む埋め込む金型に10月中の脳と転送コート。矢状面は、できるだけ少ない動きを用いて気泡の導入を避ける、すくい面と平行になるように脳を方向付けます。 -80℃のドライアイス/エタノール浴とストア内の金型を浸漬することにより、フラッシュ凍結。 </li><li>クライオスタットを用いて、10μmの矢状切片をカットし、前洗浄スライド上に集めます。 </li></ol></li> &lt;LI&gt; NADHジアホラーゼ染色<ol><li> 1Lの脱イオン水に5.72グラムのTris-HClおよび1.66グラムのトリス塩基を溶解することにより、0.05 Mトリス緩衝液、pH 7.6を準備します。 6週間まで4℃で保管してください。 </li><li> NADH溶液（0.05 Mトリス緩衝液中で2.25 mMのNADH）を準備します。 -20℃で小分けし、店舗。 </li><li> NBT溶液（0.05 Mトリス緩衝液中の2.5mMのニトロブルーテトラゾリウム）を準備します。ガラス瓶に6週間まで4℃で保管してください。 </li><li>染色溶液を作製し、各スライドに1ミリリットルを追加するために、NADH溶液およびNBT液を等量を兼ね備えています。 30分間加湿チャンバー中、37℃でインキュベートします。 </li><li>吸引染色液との dH 2 Oで3回洗浄し</li><li>昇順と降順のアセトン濃度で3回ずつ洗浄/のdH 2 0（30％、60％、90％、60％、30％）を、室温で2分間。 </li><li> dH 2 Oで3回すすぎ、水性媒体とのセクションをマウントします。明るいFのために装備光学顕微鏡を用いた画像ield顕微鏡。ブルー染色は、酵素活性に相当します。 </li></ol></li><li>コハク酸脱水素酵素組織化学染色<ol><li> 0.2 Mナトリウム一塩基性リン酸/のdH 2 Oおよび0.2 Mナトリウム二塩基性リン酸/のdH 2 Oを準備</li><li> 20部のナトリウム二塩基性リン酸3部の一塩基性リン酸を組み合わせることにより、0.2 Mリン酸緩衝液、pH 7.6にします。 </li><li>染色溶液（0.1 Mコハク酸ナトリウム、0.2 Mリン酸緩衝液中の1.25 M NBT）を準備し、各スライドに1ミリリットルを追加します。 60分間加湿チャンバー中、37℃でインキュベートします。 </li><li>吸引染色液とのdH 2 Oで3回洗浄</li><li>昇順で3回ずつ洗浄し、アセトンの濃度を下降/のdH 2 O（30％、60％、90％、60％、30％）を、室温で2分間。 </li><li> dH 2 Oで3回すすぎ、水性媒体とのセクションをマウントします。明視野顕微鏡のために装備光学顕微鏡を用いた画像。ブルー染色はアンに対応しますzymatic活動。 </li></ol></li></ol>

著者には開示すべき競合する利益はありません。

堅牢な治療法は、ヒトの老化に関連した条件を衰弱させるの影響を制限するために必要な、しかし、彼らは多くの条件のためにとらえどころのないままにされています。潜在的な治療標的を識別し、介入のための戦略を開発するには、加齢に伴う疾患の原因や病態を最初に理解しなければなりません。ていないこれらの遺伝子は、以前にヒトでの研究で条件にリンクされている場合でも、興味の疾患に関連する明確な表現型を有するすぐに存在するすべての遺伝的に改変マウス。したがって、より体系的な研究が必要とされ、遺伝的に改変されたマウスは、ヒトでの関連疾患に関連する可能性の表現型を識別するために、適切な実験に供されるべきです。 無数の行動試験は、マウス50,51における神経学的機能をアッセイするために存在します。本明細書で概説行動試験は、ヒトの調査結果と実際の表現型に基づいて仮説を立てた表現型に適しているOBSEマウスでrved。また、これらのテストは、行動実験を行うにはほとんど、あるいは経験のない研究室で実行するのが簡単です。そこに洗練された機器のための要件はありませんが、適切に収集されたときの結果は有...

加齢関連疾患は、現代社会でますます普及してきています。医学が向上し、平均余命が増加すると、人口は年齢に続き、これらの疾患の負担が大きくなります。有効な治療法は衰弱させる条件の影響を軽減するために必要であるが、多くの場合、とらえどころのないまま。唯一の加齢に伴う疾患の原因と病態を理解することによって、科学者たちは、潜在的な治療標的を同定し、介入のための戦略を開発するために始めることができます。一般的な加齢関連状態は、パーキンソン病（PD）及び加齢性黄斑変性症（AMD）などの神経変性疾患が挙げられます。 PDは、ヒトにおいて神経変性によって引き起こされる最も一般的な運動障害です。ほとんどのPD患者は、年齢の50年後振戦、動作緩慢、剛性を休んなどの症状を示しています。早期発症はまた、症例の約10％において観察されています。 AMDは失明の主要な原因であります目の中の高齢者、漸進的にダメージを与える光受容体および網膜色素上皮（RPE）。中心視力が損なわが、周辺視野は、一般的に影響を受けません。 AMDの2つの形式があります。 「ドライ」の形式では、RPEとブルッフ膜（BM）との間のドルーゼンの形として知られている細胞外タンパク質の沈着は、地理的萎縮につながると中心視力のぼやけ。より深刻な「ウェット」フォームRPEと感光層へのBM全体の脈絡膜から新生血管形成の結果とは、網膜組織に永久的な損傷を引き起こす網膜の下にhamorrhagingにつながることができます。染色体1および10q26座、加齢性黄斑変性症の感受性2（ARMS2）との補体因子H（CFH）：ゲノムワイド関連研究では、以前にこの疾患に感受性の増加に関連付けられており、関心の2つの領域を同定された遺伝子座を同定しました高温要件因子A1（HTRA1）遺伝子が1-5位置しています</sup&gt;。これらの対立遺伝子の組み合わせは、用量依存的にAMDの可能性を増加させ、特定のSNPを優先AMD 3-6の湿潤または乾燥形態のいずれかに関連付けることができます。 CFHはC3の活性化を阻害することによって補体系の代替経路（AP）の負の調節因子として作用します。一塩基多型（SNP）が原因でC置換1〜Tにヒスチジンとエクソン9におけるチロシン402の交換を引き起こし、AMDのリスクの増加に関連しています。 AMDでは、APが原因CFHの機能の喪失が、SNPは因果的役割は不明である果たしているかどうかを誤調節されると考えられています。 1つの仮説は、正に荷電したヒスチジンは、タンパク質C反応性タンパク質、およびヘパリン硫酸1,7相互作用に結合するCFHの能力を無効にすると考えられることである。CFH Y402Hのインビトロ研究は、変異体間の機能の違い上矛盾する結果を提供し、 中in vivoでの作業&lt;EM&gt; CFH - / -ヒトCFHを発現するマウスは、8進行中です。遺伝子は、マウスには存在しないもののARMS2は、霊長類ゲノムにおけるHTRA1の上流に位置します。 HTRA1は、セリンプロテアーゼであるが、ARMS2が不十分に特徴付けられます。 AMD関連遺伝子座におけるSNPの間の連鎖不均衡は、それが困難なこの地域の遺伝子の個々の突然変異のリスクへの寄与を決定するために作られましたが、最近の研究は、それが血管新生につながるというARMS2よりHTRA1の過剰発現があることが示唆されていると網膜下のタンパク質沈着9-11。しかし、この遺伝子座における遺伝子の近接は、ランダムに挿入された導入遺伝子を用いて研究することができないの相互作用を可能にすることができます。 AMDに加えて、セリンプロテアーゼのhtrAのファミリーは、多くのヒトの疾患に関連しています。すべてhtrAのタンパク質は、少なくとも1つのC末端PDZドメインに続くセリンプロテアーゼドメインを含みます。 HTRA1、HtrA3とHtrA4はグラムを共有しますシグナルペプチド、インスリン様成長因子結合ドメイン、カザールプロテアーゼインヒビタードメイン、セリンプロテアーゼドメインおよびPDZドメインからなるeatest相同性。 HtrA2は異なるミトコンドリア局在配列からなるN末端 ​​、膜貫通ドメインおよびプロテアーゼおよびPDZドメイン12-16に続いてアポトーシス結合ドメインの阻害剤を持っています。哺乳類HTRA1は、そのプロテアーゼドメイン17-20の活性部位における基質誘導性のリモデリングによって調節され、HtrA2はまた、プロテアーゼ活性21を抑制するセリンプロテアーゼとPDZドメインの相互作用によって調節することができます。興味深いことに、PDZドメインはHtrA3 16と同様の規制を付与することが表示されません。 htrAのプロテアーゼはまた、外因性因子によって調節することができる。それは、最近HTRA1およびプロトポルフィリン22とHtrA2の間の調節的相互作用は、p38 MAPキナーゼの活性化によってリン酸化によって調節することができるが存在することが実証されましたPINK1依存的23で経路。マウスでのhtrAのファミリーの個々のメンバーの削除は、しかし、機械的な影響はほとんどが部分的に目に見える表現型の欠如に不明確である、文書化されています。 HTRA1は、タンパク質品質管理において重要な機能を果たしており、その制御ミスまたは変異は、関節炎、癌およびAMD 3,4,24-32のリスクの増加など、さまざまなヒト疾患と関連しています。加速中の非神経組織の結果から、その損失は33-37老化しつつ神経組織におけるHtrA2機能の喪失は、ヒトおよびマウスにおけるPDの表現型と関連しています。 HtrA3の調節不全は、子癇前症および癌38,39の特定の種類を含む、疾患に関連しています。アップレギュレーションHtrA4のは、子癇前症患者の胎盤で観察されているが、ノックアウトマウスは明白な表現型40,41は表示されません。いくつかのノックアウトマウスで観察された表現型の欠如がありましたhtrAのファミリーメンバー間の補償の結果であると仮定：それはHtrA4とHTRA1両方がHtrA4 41の削除時にHTRA1により補償を可能にする、タンパク質のTGF-Bファミリーと相互作用すると考えられています。同様に、HTRA1とHtrA3がドメイン相同性の高い学位を持っているので、それらが相補機能42を持っているかもしれないと考えられています。しかし、一般的なターゲット43を調節するために競合する、htrAのタンパク質は、部分的に拮抗的役割を有し得ることが示唆されています。 さらに、これらのリスクを調査するためには、3つのヒト化ノックインマウス系統が生成された要因。 CFH TM1（CFH * 9）jhohとCFH TM2（CFH * 9）jhohは 、CFH遺伝子のエキソン9はヒト相同体のエクソン9で置換されている。CFHのTM1（CFH * 9）jhohは、非疾患関連チロシンをコード化するにはY402H、リスク関連SNPを運ぶjhoh CFH TM2（CFH * 9）に対し、402位の残基、。に人間ARMS2シーケンスtm1jhoh ARMS2は HTRA1の上流領域を標的としました。以前34に記載されているように loxP隣接STOP配列遺伝子配列の上流に配置されなく含まUBICプロモーターの下流には、Rosa26遺伝子プロモーターの制御下でCreリコンビナーゼを発現する、OzCreマウスと交配することによって切除しました。加えて、これらのノックインライン、CFHおよびHTRA1（CFH tm1jhohとHTRA1のtm1jhoh）、ならびに他の既知のhtrAのファミリーメンバーの条件付きノックアウト対立遺伝子が生成されました：HtrA2（HtrA2のtm1jhoh）、HtrA3（HtrA3 のtm1jhoh）とHtrA4（ HtrA4のtm1jhoh）。エクソン3、HTRA1;生殖ノックアウトは、欠失は、フレームシフトおよび/ ​​または活性ドメイン（CFHの削除を引き起こすように、loxP部位で特定のエキソンに隣接するように設計された動物にOzCreマウスを交配することによって作成されたエクソン2-3、HtrA2：エクソン2-4、HtrA3。エクソン3、HtrA4。エクソン4-6）34,41。また、34に記載されている、;ガラス転移温度（Tg（NES-CRE）1Kln / J HtrA2 FLOX）HtrA2の神経削除は、 ネスチンのプロモーターの制御下でCreリコンビナーゼを使用して削除しました。 HtrA2を欠くマウスのみ、いずれかの全身または神経組織では、パーキンソン病の表現型を呈する、明確な表現型を示しました。 関心のこれらの遺伝子のいくつかは、ミトコンドリア11,44-47に局在することが仮定されており、HtrA2の削除はパーキンソン表現型を生成し、ミトコンドリアと神経学を中心とした表現型の計画はここに記載されており、関心の試験からの代表的な結果が提供されているので、 。初期の表現型のスケジュールが2メインに関連する一連のテストからなる、設立された徹底的かつ系統的、加齢関連疾患の人間を調査するために製造し、遺伝的に改変マウスを調べるために興味のある疾患：AMDおよびパーキンソン。

<table><tbody><tr><td>エタノール</td><td>デコン(フィッシャーサイエンティフィック)</td><td>435541</td><td></td></tr><tr><td>50mlコニカルチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>1443222</td><td></td></tr><tr><td>コットンボールウォル</td><td>マート</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒートマット</td>サン<td>ビーム</td><td>0000756-500-000</td><td></td></tr>ホール<tr><td>ディングトレイ(アイスキューブトレイ)</td><td>ウォルマート</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電子ストップウォッチ</td><td>GOGO</td><td>PC396</td><td></td></tr><tr>ワークショップ<td></td><td>で構築された</td><td>プレキシガラスの箱</td><td>12" by 12"&nbsp;</td></tr><tr><td>Vixia HF R400 ビデオカメラ</td><td>キヤノン</td><td>8155B004</td><td></td></tr><tr><td>9 オンス クリア カップ</td><td>ウォルマート</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/4 インチ ワイヤー メッシュ</td><td>ホーム デポ</td><td>204331884 (オンライン) / 554219 (店舗内)</td><td>12" by 12"&nbsp;</td></tr><tr><td>プチプチ</td><td>VWR</td><td>470092-416</td><td></td></tr><tr><td>ストレート試料鉗子</td><td>VWR</td><td>82027-438</td><td></td></tr><tr><td>細先端解剖鉗子</td><td>VWR</td><td>82027-408</td><td></td></tr><tr><td>細かいはさみ</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド 16% 溶液</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x リン酸緩衝生理食塩水 pH 7.4</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072-04000</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>JT Baker</td><td>4072-01</td><td></td></tr><tr><td>superfrost slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin Stain Solution</td><td>Fisher Scientific (Ricca)</td><td>353016</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y Stain Solution</td><td>Fisher Scientific (Ricca)</td><td>2845-32</td><td></td></tr><tr><td>Tris 塩酸塩</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02000-01000</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型二ナトリウム塩水和物</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>ニトロテトラゾリウム青色塩化</td>物 <td>Sigma</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>JT Baker</td><td>9006-05</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性一水和物</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性七水和物</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>コハク酸ナトリウム二塩基性六水和物</td><td>Σ</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount水性封入媒体</td><td>Vector Labs</td><td>H-5501-60</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-545-M</td><td>60 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>AxioImager A1 顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビデオカメラ三脚</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (OCT)</td><td>Fischer Scientific</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat Sectioning&nbsp;マシン</td><td>ライカ&nbsp;</td><td>CM1900</td><td>製造中止になりましたが、CM1950 に置き換えられました</td></tr></tbody></table>

老化のヒトの疾患に関与する遺伝子を研究するために使用される遺伝子改変マウス用表現型レジメン

A Phenotyping Regimen for Genetically Modified Mice Used to Study Genes Implicated in Human Diseases of Aging

加齢に伴う病気はますます蔓延しており、人口の高齢化に伴いその負担は増え続けています。衰弱性疾患の影響を軽減するためには効果的な治療法が必要ですが、多くの場合、とらえどころのないままです。老化に伴う疾患の原因と病理を理解することによってのみ、科学者は潜在的な治療標的を特定し、介入のための戦略を立て始めることができます。最も一般的な加齢性疾患は、パーキンソン病や失明などの神経変性疾患です。加齢性黄斑変性症(AMD)は、高齢者の失明の主な原因です。ゲノムワイド関連解析により、この疾患に対する感受性の増加に関連する遺伝子座がこれまでに同定され、補体因子H(CFH)と加齢性黄斑症感受性2(ARMS2)および高温必要因子A1(HtrA1)遺伝子が位置する10q26遺伝子座の2つの関心領域が同定されています。CFHは補体系の代替経路(AP)の負の調節因子として作用し、HtrA1は細胞外セリンプロテアーゼです。ARMS2は霊長類ゲノムのHtrA1の上流に位置していますが、マウスにはこの遺伝子は存在しません。これらの遺伝子の影響を研究するために、CfhおよびARMS2のヒト化ノックインマウス系統、Cfh、HtrA1、HtrA2、HtrA3およびHtrA4のノックアウト、ならびにHtrA2の条件付き神経欠失を作製しました。 遺伝子改変マウスのうち、HtrA2を欠損したマウスのみが全身または神経組織で明確な表現型を示した。これらのマウスを徹底的かつ体系的に調べるために、AMDとパーキンソン病という2つの主要な疾患に関連する一連のテストからなる初期の表現型スケジュールが確立されました。遺伝子改変マウスは、ヒトの関連疾患に関連する可能性のある表現型を特定するために、適切な実験を行うことができます。ここでは、ミトコンドリアに焦点を当てた表現型レジメンを、関心のあるテストの代表的な結果とともに紹介します。

このセクションでは、これらの方法を用いて得られる結果の例を説明します。後肢試験では、プル試行回数が行われ、待ち時間は、毎日のための2つの連続した​​試験にわたって合計される落下します。この試験は、減少筋強度を有するマウスを区別するために、遺伝的に異なる群を比較するために使用することができ、図1AのHtrA2のtm1jhoh（HTRA2 KO）マウス- B還元しP4-6から落下するプルし、待ち時間の数の変化を示しません同腹子（HTRA2 WT）と比較して、P7-10での神経筋強度、インチ加齢に伴う強度の予想増加は、野生型動物でも観察可能です。離乳観察試験では、総活性は、テストの3日連続にわたって平均（線が飼育やイベントをグルーミング、トラバース）すべてのイベントを合計することによって評価することができます。また、イベントの各特定のタイプとすることができるindividuallyは分析しました。ここでは代表的な結果は、WT同腹仔と比較して、HTRA2 KOマウスの減少し...

マウスをモデルシステムとして使用して、ヒトの疾患に関連する遺伝子ファミリーを理解するための逆遺伝学的なアプローチが提示され、その後のマウス表現型スケジュールが記述されています。目的の遺伝子であるHtrA2に欠損のあるマウスはパーキンソン病の症状を発現したため、表現型判定レジメンは神経学的欠陥の特定に焦点を当てています。

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to ...

この試験レジメンの全体的な目的は、行動表現型や組織の構造および機能に関するその後の詳細な調査へと導くための、初期フェノタイピングパイプラインとして利用可能な一連の簡易試験を確立することです。これにより、ヒト疾患の行動的および細胞的表現型がマウスモデルで再現されているかを確認します。本手法の主な利点は、このような実験の経験がない研究室であっても、多額の投資をすることなく試験を実施でき、かつ詳細な後続研究に向けた知見を得られる点にあります。後肢の近位筋の筋力、筋力低下、および疲労を評価するため、生後4日から10日まで毎日後肢テストを実施します。まず、マウスをテストエリアに30分間慣らします。その間に、新しい500 milliliterコニカルチューブを70%ethanolで洗浄し、チューブの底にコットンボールを1〜2個押し入れて準備します。試験中は、このチューブを垂直に固定してください。試験を行っていない間は、仔マウスの体温を維持するため、母親と一緒に飼育してください。30分間の順化後、仔マウスをケージから取り出し、体重を記録します。次に、新生仔マウスの後肢をチューブの縁に軽く吊るし、仔マウスが綿の方を向くようにします。そして、仔マウスが行った引っ張り動作の回数を数え、落下するまでの潜時を測定します。30秒間待機した後、テストを繰り返します。2回目のテストの後、マーカーで幼仔にラベルを付けます。次に、ホームケージの床材で幼仔を軽くこすり、母仔に戻します。P8の高齢の幼仔はマーキングできないため、趾切除（toe clipping）で識別してください。次の幼獣に進む前に、試験管を70% ethanolで拭き取ります。P19からP21まで、離乳期観察テスト（Weanling Observation Test）を毎日実施し、運動能および全般的な活動レベルをスコア化します。まず、マウスをテストエリアに30分間置いて順応させます。仔マウスを順化させている間に、アリーナを準備します。プレキシガラス製のテストボックスに、2インチ四方の正方形による6×6のグリッドを書き込みます。ボックスを使用する前に、70% ethanolで清掃してください。次に、ボックス全体の側面図が視野いっぱいに収まるようにビデオカメラを配置します。新規性を導入することを避けるため、周囲の外観を標準化してください。テストの前に、離乳した個体を清潔な保持カップに移し、体重を記録します。その後、ビデオ録画を開始した。まず、マウスの個体識別番号、週齢、および現在の日付を記載したテスト用識別カードを撮影する。次に、マウスを保持カップから中央の正方形エリアへ移動させる。3分間、両前肢で通過したラインの数をカウントします。3分後、マウスを清潔なケージに戻し、ビデオ録画を終了します。テストごとに、ボックスを70% ethanolで清掃してください。ビデオから、マウスが両前肢を支持面から離して直立した「 rearing」イベントの回数をカウントします。また、両前肢で体を掃除している「 grooming」イベントの回数もカウントします。神経筋肉系の強度を評価するため、P22からP26の間、一日おきに握力テスト（Grip Strength Test）を実施します。通常通り、マウスを試験エリアに30分間慣らします。試験装置はメッシュグリッド付きのプレキシガラス製ボックスです。両方を70% ethanolで洗浄してください。次に、緩衝材としてボックスの底に気泡緩衝材（バブルラップ）を敷き、排泄物を吸収させるためにその上を紙で覆います。続いて、試験用マウスを分離し、個別のカップに入れます。そして、1匹目のマウスを金網の中央に置き、ボックスの柔らかい表面から10〜20 cm上の高さまで、金網をゆっくりと反転させます。マウスが落下するまでの潜時を測定するか、60秒経過しても落下しない場合はテストを終了します。その後、1匹目のマウスを保持カップに戻します。テストの間は、メッシュを70% ethanolで拭き、緩衝材（バブルラップ）上のペーパーを交換してください。その後、グループ内の他の2匹のマウスに対してもテストを行います。各マウスのテストが1回ずつ完了したら、このプロセスをさらに2回繰り返し、マウス1匹あたり計3回の試行を行います。1グループに3匹未満のマウスしかいない場合は、試行間に少なくとも5分間の回復時間を設けてください。NADHジアフォラーゼ染色を行うには、調製したばかりのNADH溶液とNBT溶液を等量ずつ混合します。次に、各スライドに染色液を1 mL加え、加湿チャンバー内で37 °Cで30分間インキュベートします。コハク酸脱水素酵素染色を行うには、0.1 Mコハク酸ナトリウム、1.25 M NBT、および0.2 Mリン酸緩衝液の溶液を調製します。その後、各スライドに1 mLずつ加えます。スライドを加湿チャンバーに入れ、37 °Cで1時間インキュベートします。いずれかの染色剤でインキュベートした後、染色液を吸引し、蒸留水でスライドを3回洗浄します。次に、濃度を段階的に上げ、その後下げる一連のアセトン浴でスライドを洗浄します。各濃度のアセトンを用いて、1回2分間の洗浄を3回ずつ行います。最後に、蒸留水でスライドを3回すすぎます。その後、水溶性封入剤を用いてスライドを封入します。HTRA2の発現を欠損したマウスを、上述の一連のテストを用いて検討し、同リターの対照群と比較しました。P4からP6の間では、プル回数や落下までの潜伏期間に変化は見られませんでした。P7からP10の間では、神経筋肉強度の低下が認められました。活性試験において、HTRA2ノックアウトマウスの活性低下が認められました。また、ワイヤーメッシュグリップ試験では、HTRA2ノックアウトマウスの筋力低下が示されました。H&amp;E染色では、P35において、HTRA2ノックアウトマウスの網膜構造にコントロール群と比較して明らかな変化は見られませんでした。最後に、呼吸酵素機能の変化を特定するため、電子伝達系複合体活性の組織化学染色を行いました。コントロール群と比較して、HTRA2ノックアウトマウスでは染色の低下が認められました。これは小脳および線条体で確認されましたが、皮質では認められませんでした。このビデオを視聴することで、遺伝子組み換えマウスの活動性と神経筋肉強度の評価方法、およびこれらの研究を細胞レベルの解析と組み合わせる方法について十分に理解できるはずです。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験の成功をお祈りしています。

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