Name: ペプチドを結合蛍光タンパク質のDNAを用いた表面係留大型DNA分子の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 学ぶ ペプチド結合蛍光タンパク質を用いた大型DNA分子の可視化手法。PEGアビジン被覆ガラス表面への係留とマイクロ流体シア流による伸張で、単一DNA分子の動的解析を可能にする。

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この作業は、201410036の西江大学研究助成金によって支援されました。

1. DNAビオチン化<ol><li> ターミナルトランスフェラーゼを使用して平滑末端DNAのビオチン化酵素（TdT） 注：平滑末端DNAで使用T4 DNA（166 kbpの）を、。 <ol><li> 2.5mmののCoCl 2、10×反応緩衝液5μl、10mMのビオチン-11-dUTPを0.5μlの、ターミナルトランスフェラーゼの0.5μlの（10単位）、およびT4 DNA0.5μlの（0.5μgの/μl）を5μLを追加反応混合物。水38.5μLを添加することによって50μlの最終容積にしてください。 </li><li> 1時間37℃で反応混合物をインキュベートします。 注：延長反応時間、 すなわち 、二重係留DNAを得ることができ、ビオチンが両端にタグ付けされていることが可能です。 </li><li> 0.5 M EDTA、pHが8の5μLを加えて反応を停止します。 </li><li> 4℃でチューブを保管してください。 </li></ol></li><li> DNAリガーゼを用いて粘着性のエンドDNAのビオチン化 注意：使用λDNA（48.5 kbpの）、粘着末端のDNAです。 &lt;オール&gt; <li> T4 DNAリガーゼを1μl、10×ライゲーションバッファー5μlの、25 ngの/μlのλファージDNAを1μlを追加し、50μlの最終容量を作るために水の43μlを添加します。 </li><li> 4℃でチューブを保管してください。 </li></ol></li></ol> 2.官能の表面誘導体化注： 図1に示すように、ガラス表面上のDNA分子の末端をつなぐためには、第1級アミン基をビオチンPEGコーティングに続いてカバースリップ上にシラン化され、このPEG化プロセスがあるため、単一分子DNAの画像化のために重要です。著しく表面上の望ましくない分子の結合によって作成されたランダムノイズを低減することができます。 <ol><li> ピラニアクリーニング 注：ピラニア・ソリューションは、したがって、それは適切な安全ガイドラインに従って、取り扱いに注意する必要があり、有機物質と激しく反応します。 <ol><li>場所は、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）ラックにカバースリップ、およびbはそれらを保持しますyのPTFE長手方向シールテープ、ラックの表面のエッジと半分に半分。ラッピングした後、洗浄手順の間にラックを処理するためのテープの長い一片（〜5センチ）のままにします。 </li><li> SO H 2 O 2の4および150mlをヒュームフード内でピラニア溶液を作製するためにH 2 350 mlを1 Lのガラスビーカーを埋めます。 2時間ピラニア溶液中でラックを配置します。 </li><li>ビーカー内の水のpHになるまで脱イオン水で完全に空のビーカーからのピラニア溶液およびリンスカバースリップを中性に達します。 pH試験紙ストリップを使用してください。 </li><li> 30分間、水を含有するビーカーにカバースリップのラックを超音波処理。ビーカーからわずかアミノシラン化の前に空の水。ガラス基板をきれいにし、誘導体化するために超音波処理電力の75 Wを使用してください。 </li></ol></li><li> ガラス表面にAminosilanization <ol><li> N 2 mlを加え- [3-（トリメトキシシリル）プロピル]エチレンジアミン及び200mlまで氷酢酸10mlaminosilanization溶液を調製するための清浄なポリプロピレン容器中でメチルアルコール。 </li><li>ポリプロピレン容器中で洗浄カバースリップを置きます。 30分間100rpmで、室温でそれらを振ります。 </li><li> W.は、少なくとも30分間、100rpmで、室温でそれらを振る75で15分間、誘導体化されたカバースリップを入れたビーカーを超音波処理します。 </li><li>エチルアルコールで二回ビーカーからの溶液を空にし、メチルアルコールで一回、慎重にカバースリップをすすぎ、と。ストアエチルアルコール中のカバースリップとは、2週間以内にそれらを使用しています。 </li></ol></li><li> カバーガラスのPEG化 <ol><li> 0.1 M炭酸水素ナトリウム（NaHCO 3）の10ミリリットルを加えます。 0.22μmのシリンジフィルターで溶液をフィルタリングします。 </li><li>ビオチンPEGスクシンイミジルカーボネート（ビオチン-PEG-SC）およびNaHCO 3の350μlの中のPEGスクシンイミジル吉草酸80mgの（MPEG-SVG）の2ミリグラムを溶かします。光保護管を使用してください。 </li><li> 1激しくチューブをボルテックス0秒、および気泡を除去するために1分間10,000×gで、それを遠心します。 </li><li>エチルアルコールですすぎ、続いてアセトンでスライドガラスを、洗浄します。完全に空気乾燥にスライドを許可します。 </li><li>きれいなガラススライド上のPEG溶液の滴（50μl）を配置します。任意の気泡を発生させることなく、アミノシラン化カバースリップで軽く滴をカバーしています。 </li><li> 3時間のための場所のスライドは一晩暗所で、室温で湿潤チャンバーを十分に平らにします。底に水で、チャンバとして空のピペットチップホルダーを使用します。チューブ内の残留PEG溶液を密封し、4℃で保管してください。 </li><li>脱イオン水で十分にペグ化されたカバースリップを洗い流します。使用するまで暗く乾燥した場所に保管してください。 </li></ol></li></ol> 3.フローチャンバーの組み立て<ol><li> 図2のように、パンチアクリルホルダーを製作。チューブインサートの直径は0.762ミリメートルであることを確認し、一つの孔を指定すると、入口であり、他方はであり、アウトレット（ 図2）。 </li><li>任意のチャンネル穴を摂動ない、入口と出口の穴に垂直に整列させ、アクリルホルダー（ 図2）に両面粘着テープ片（幅5〜6ミリメートル）を配置します。チャンバーを作るために、マルチチャネル壁としてこれらのテープストリップを使用してください。ピペットチップを使用してテープをスクラブ。 </li><li>フェイスダウンPEG化側で、フローチャンバーを作るために上にPEG化されたカバースリップを置きます。 </li><li>漏れる任意の溶液を防ぐために、両面テープが配置されている領域の上にカバーガラスの上部を押します。上部にある、ボトム（ 図2の黄色）でチャンバのエッジを閉じるには速乾エポキシ接着剤を追加します。 </li><li>ガスタイトシリンジにチューブ（外径、OD、0.042 &quot;）の短い断片（2.5センチ）を接続し、エポキシ接着剤で接合部をシールします。 </li><li>注射器にリンクされているチューブに、エポキシ接着剤で接合部をシールする：長いフレキシブルチューブ（0.03 &quot;OD）を接続します。 </li><li> TUBI塗りつぶしngのDI水で注射器にリンクされています。空気の泡がないことを確認してください。 </li><li>エポキシ接着剤で封止しフローチャンバーの穴にチューブを挿入します。 </li><li>貯水池などの他の穴に黄色の先端部（200μlの先端）を配置します。 </li></ol>フローチャンバー内に4.サンプルのロード注：ニュートラアビジンは、ストレプトアビジンのような他のアビジンのタンパク質で置き換えることができます。それは言及されない限り、全ての反応は、室温で行うことができます。黄色の先端に試料液を取り、アクリルホルダーの穴（ 図2b）上に溶液で先端をインストールします。 <ol><li> 50μl/分でシリンジポンプの流量を設定します。負荷アビジンタンパク質の20μlの（T50溶液中の25μgの/ mlで、10mMトリス、50mMのNaClを、pHを8）は、10分間それを維持します。 </li><li>負荷ビオチン化オリゴデオキシヌクレオチド（1×TE中100μM）を20μl、10分間それを維持します。ターミナルトランスフェラーゼを使用する場合は、ロードをスキップオリゴデオキシヌクレオチドの。 </li><li> 10μl/分の流速でフローチャンバーへのステップ1からの負荷のDNA溶液20μlを、30分間それを維持します。 </li><li> 1×TEとフローチャンバーを洗浄し、FP-DBP 10（〜80 nM）を40μlのをロードします。 </li><li> 60X対物レンズに1×TEで染色する分子の連続的な流れと蛍光顕微鏡下でDNAを観察します。 FP（EGFP）-dbpの励起に488nmの固体レーザーを使用してください。 DNA分子の完全なストレッチのために、使用されるDNAの長さに応じて異なる流量を適用します。例えば、T4 DNAの166 kbpのためのλDNAの48.5 kbpの、そして100μl/分を50μl/分を適用します。 <ol><li>アクリルホルダーのリサイクルのため、家庭用洗剤溶液12で組み立てフローチャンバーを浸します。かみそりの刃でテープとエポキシを削除し、それらを完全にオフに取るために手でこすります。注射針で穴を邪魔を除きます。さらに使用するまで脱イオン水にホルダーを保管してください。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Mechanical+Measurements+of+the+Elasticity+of+Single+DNA-Molecules+by+Using+Magnetic+Beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads.</a> Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).</li>
<li>Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+reveals+mechanisms+of+protein+disruption+by+a+DNA+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase.</a> Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).</li>
<li>Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+a+tethered+polymer+in+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamics of a tethered polymer in shear flow.</a> Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).</li>
<li>Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+a+Single+DNA+Molecule+Observed+by+Optical+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy.</a> Science. 264 (5160), 822-826 (1994).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+restriction+endonuclease+maps+of+yeast+artificial+chromosomes+created+by+optical+mapping+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).</li>
<li>Kim, Y., Jo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutravidin+coated+surfaces+for+single+DNA+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis.</a> Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+confinement%3A+DNA+stretch+approaching+full+contour+length%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li>
<li>Glazer, A. N., Rye, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+dye-DNA+intercalation+complexes+as+reagents+for+high-sensitivity+fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection.</a> Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).</li>
<li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+binding+fluorescent+proteins+for+the+direct+visualization+of+large+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J. Vis. Exp. (86), e50549(2014).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、表面上に固定するためにビオチン化長いDNA分子を可視化するためのプラットフォームを提示します。私たちは、ビオチン化ウシ血清アルブミンとアビジンタンパク質コーティングされた表面上の係留DNA分子のためのアプローチを報告している。6以前のアプローチでは、我々は上の係留DNA分子を染色ビス-インターカレーション染料によって引き起こされるDNAの光開裂の重要な問題を発見しました表面。これらの連続的励起フルオロフォアは、DNAリン酸骨格を攻撃する高い確率を有するように、9励起光のパワーは、光開裂を避けるために最小化されなければなりませんでした。 この不便さを克服するために、我々は、光開裂することなく、DNAを染色するためのDNA結合能（FP-DBP）で遺伝子操作された蛍光タンパク質を開発しました。10我々は、アビジン被覆タンパク質表面上の信頼性のDNA染色を観察しました。それにもかかわらず、このプラットフォームは、上の蛍光タンパク質の望ましくない凝集の別の問題がありました増加したバックグラウンドノイズを生じる​​タン...

ガラスまたはビーズ表面に係留大きなDNA分子の可視化DNA基質、1,2および高分子物理学上のDNAタンパク質相互作用、タンパク質の動力学を調査するために利用されてきた。3,4-単一係留大型DNA分子のためのプラットフォームは、いくつかの異なるを有します他のDNA固定化方法に比べて利点が5まず、表面につなが大きいDNA分子は、その結合部位を認識するDNA結合タンパク質のための非常に重要であるせん断流れずに自然なランダムコイルコンフォメーションを有します。第二に、フローチャンバー内の一連の酵素反応のためのDNA分子の周りの化学的環境を変更することは非常に簡単です。第三に、マイクロ流体せん断流がDNA分子、このような表面固定化6及びナノチャネルの狭窄などの代替的なDNA伸長手法を用いて達成することは非常に困難である完全な輪郭の長さの100％にまで延伸を誘発する。7 A完全stretcheDのDNA分子は、ゲノムマップ上の酵素の動きを監視するために有用であることができる位置情報を提供します。 それにもかかわらず、DNAテザリングアプローチは、YOYO-1のような挿入色素は、一般的に容易に蛍光励起光によって破壊される係留DNA分子を引き起こすという重大な欠点を有しています。一般的に、大規模なDNA分子は蛍光顕微鏡下で可視化のための蛍光色素で染色されなければなりません。これらの色素は、それらが二本鎖DNAにインターカレートしたときにのみ蛍光を発するので、この目的のために、YOYO-1または他のTOTO系色素が主に使用されている。8しかし、ビス-インターカレート色素があるため、光誘導されるDNA光切断を引き起こすことがよく知られています蛍光体のインターカレーション。9更に、表面につなが蛍光染色されたDNA分子は、剪断流れが自由にDNA分子の移動の力を壊す発揮することができるため、より脆弱です。したがって、我々は新たなDとFP-DBPを開発しました表面に係留大型DNA分子を画像化するためのNA-染色タンパク質色素。 FP-DBPを使用する利点は、それが結合するDNA分子の光開裂を起こさないことである。加えて、10のビス-インターカレート色素は輪郭長さを増加しながら、FP-DBPは、DNAの輪郭の長さを増加させません約33％です。 このビデオ方式は、PEG-ビオチン表面に大きなDNA分子を係留するための実験的アプローチを紹介する。 図1は、平滑末端および付着末端を有するDNAを係留の異なるアプローチを示しています。したがって、この染色方法は、DNA分子の任意のタイプに適用することができる。 図2は、DNA分子を伸長するだけでなく、化学的および酵素をロードするためにせん断流を生成するために、シリンジポンプによって制御することができるフローチャンバアセンブリの概略図を示していますソリューション。 図3は、PEGylatにつなが完全に伸張したDNA分子の顕微鏡写真を示していますエド面11とFP-DBPで染色しました。

<table><tbody><tr><td colspan="4">1.DNA Biotinylation</td></tr><tr><td colspan="4">1.1) Terminal Transferase (TdT)</td></tr><tr><td>Terminal Transferase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0315S</td><td>10x 反応バッファー、2.5 mM 塩化コバルト</td></tr><tr><td>Biotin-11-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>R0081</td><td>Biotin-ddNTP も利用可能</td></tr><tr><td>T4GT7 Phage DNA</td><td>Nippon Gene</td><td>318-03971</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>EDTA</td></tr><tr><td colspan="4">1.2) DNAリガーゼT4 DNAリガーゼを使用した粘着末端DNAのビオチン化</td></tr> <tr><td></td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0202S</td><td>10x反応バッファーラム</td></tr><tr><td>ダファージDNA</td><td>バイオニア</td><td>D-2510</td>も<td>入手可能 ニューイングランドバイオラボ</td></tr><tr><td colspan="4"でも入手可能><強い>2。機能化された表面誘導体化</td></tr><tr><td colspan="4">2.1) Piranha Cleaning</strong</td></tr><tr><td>>Coverslip</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0101050</td><td>22 mm x 22 mm, No. 1</td></tr><tr><td>厚さ テフロンラック</td><td></td><td></td><td>カスタムファブリケーション</td></tr><tr><td>PTFE スレッドシールテープ</td><td>Han Yang Chemical Co. Ltd.</td><td>3032292</td><td>テフロン&テープ</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>ジンケミカル株式会社</td><td>S280823</td><td>H2SO4、純度95%</td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>ジンケミカル株式会社</td><td>H290423</td><td>H2O2、水中35%</td></tr> 超音波<tr><td>処理装置</td><td>大韓科学(株)</td><td>WUC-A02H</td><td>卓上超音波洗浄</td></tr><tr>機<td colspan="4">2.2) ガラス表面のアミノシラン化</td></tr><tr><td>N-[3-(トリメトキシシリル)プロピル] エチレンジアミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>104884</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>Duksan Chemicals</td><td>414</td><td>99% 純度</td></tr><tr><td>メチルアルコール</td><td>Jin Chemical Co., Ltd.</td><td>M300318</td><td>99.9%純度</td></tr><tr><td>ポリプロピレン容器</td><td>Qorpak</td><td>PLC-04907</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール</td><td>ジンケミカル株式会社</td><td>A300202</td><td>99.9% 純度</td></tr><tr><td colspan="4">2.3) カバーガラスのPEG化</td></tr> <tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ フィルター</td><td>ザルトリウス</td><td>16534----------K</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン-PEG-SC</td><td>レイサン バイオ</td><td>ビオチン-PEG-SC-5000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVG</td><td>レイサン バイオ</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>アセトンジン</td><td>ケミカル(株)</td><td>A300129</td><td>純度99%</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>マリエンフェルト・スペリオル</td><td>1000612</td><td>~76 mm x 26 mm x 1&nbsp;mm</td></tr><tr><td colspan="4">3.フローチャンバーの組み立て</strong</td></tr><tr><td>>アクリルサポート</td><td></td><td></td><td>カスタム加工</td></tr><tr><td>両面テープ</td><td>3M</td><td></td><td>透明タイプ</td></tr><tr><td>速乾性エポキシ</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブ</td><td>コールパーマー</td><td>06417-11, 06417-21</td><td></td></tr><tr><td>ガスタイト 250 & マイクロ;lシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>81165</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>新時代ポンプシステム株式会社</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4.フローチャンバーへのサンプルローディング</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Trisベース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-5KG</td><td>Trizmaベース</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Olympus</td><td>IX70</td><td></td></tr><tr><td>EMCCDカメラ</td><td>Q Imaging</td><td>Rolera EM-C2</td><td></td></tr><tr><td>固体レーザー (488&nbsp;nm)</td><td>Oxxius</td><td>LBX488</td><td></td></tr><tr><td>アルコノックス</td><td>アルコノックス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ペプチドを結合蛍光タンパク質のdnaを用いた表面係留大型dna分子の可視化

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

大きなDNA分子は、特にDNAとその結合タンパク質との間の相互作用を調査するために、高分子物理学や生化学で利用されてきました。ここでは、表面につながれた大きなDNA分子を蛍光顕微鏡で可視化する方法について報告します。まず、ガラスカバースリップは、ビオチン化ポリエチレングリコールでコーティングすることによりビオチン化および不動態化され、アビジンタンパク質リンカーを介してビオチン化DNAに特異的に結合し、表面上のタンパク質またはDNA分子の非特異的相互作用による望ましくない結合を大幅に減少させます。次に、DNA分子は、その末端に応じて2つの異なる方法でビオチン化されます。平滑末端DNAは、末端トランスフェラーゼによって3'水酸基末端にビオチン化dUTPでタグ付けされ、粘着末端DNAはDNAリガーゼによってビオチン化相補型オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションされます。最後に、マイクロ流体せん断流は、蛍光タンパク質-DNA結合ペプチド(FP-DBP)で染色された後、単一のDNA分子をその輪郭全体の長さまで伸張させます。

図1は、DNA分子の末端構造に応じて2つの異なるDNAテザリング方法を示している。 図1aは、スティッキーエンドのDNA分子は、アビジン被覆PEG表面上に固定化された補完的なビオチン化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされている様子を示す。 図1bは、の追加を示していますビオチン化のddNTPまたはターミナルトランスフェラーゼによって平滑末端DNAの3 &#39;水酸基へのdNTP。我々は、DNA分子とビオチン間の柔軟なリンカーを追加しました。これは、反応に十分なスペースを提供するために、連結およびアビジン-ビオチン結合効率を増加させた。 図1cはアビジンコートPEG表面上のDNAテザリングのための全体的な概略図を示しています。 図2は、アクリルホルダーと一緒にフローチャンバのアセ...

ポリエチレングリコール(PEG)とアビジンコーティングされたガラス表面につながれ、マイクロ流体のせん断流で引き伸ばされた蛍光タンパク質DNA結合ペプチド(FP-DBP)で染色された大きなDNA分子を視覚化するアプローチを提示します。

ペプチドを結合蛍光タンパク質のDNAを用いた表面係留大型DNA分子の可視化

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

本手順の全体的な目的は、エピ蛍光顕微鏡用の便利なDNA解析システムを構築し、修飾ガラス表面上で単一分子DNAを操作することです。本手法は、DNA自体の観察に加え、DNA結合タンパク質やその他の低分子を調べることで、DNA可視化分野における重要な疑問への回答に寄与します。この手法の主な利点は、移動するDNAを容易に観察および分析できることです。まず、ガラスカバースリップをPTFEラックに配置し、PTFE製シールテープを用いて固定します。カバースリップを巻いた後、洗浄手順中にラックを扱うために使用するテープを5 cmほど残しておきます。ドラフトチャンバー内で、1Lのガラスビーカーに350 mLの硫酸と150 mLの過酸化水素を混ぜ合わせ、ピラニアエッチング溶液を調製します。次に、カバーグラスをセットしたラックをこの溶液に入れます。2時間後、ビーカーの中身を捨て、カバーグラスを脱イオン水で十分に洗浄します。ビーカー内の水のpHが中性になるまで、カバーガラスの洗浄を続けます。次に、ガラス基板を洗浄し脱脂するため、水を入れたビーカーの中でカバーガラスをセットしたラックを30分間超音波洗浄します。アミノシラン化の直前に、ビーカーから水を捨てます。まず、清潔なポリプロピレン製容器の中で、200 mLのメタノールに2 mLのアルコキシシランと10 mLの氷酢酸を加えて、アミノシラン化溶液を調製します。続いて、洗浄済みのカバーガラスを溶液に入れます。次いで、洗浄済みのカバーガラスを調製した溶液に入れ、室温、100 rpmで30分間振とうします。次に、誘導体化されたカバーガラスが入った容器を、75 Wで15分間超音波処理します。次に、室温、100 rpmで少なくとも30分間、再び振盪させます。終了後、ビーカーから溶液を捨て、カバーガラスを慎重に3回洗浄します。1回はメチルアルコールで、残り2回はエチルアルコールで行ってください。最終すすぎの後、カバーガラスをエタノール中に保存し、2週間以内に使用してください。まず、0.1 molarsの重炭酸ナトリウム溶液を10 milliliters調製し、0.22 micronのシリンジフィルターでろ過します。次に、2 milligramsのbiotin PEG succinimidyl carbonateと80 milligramsのPEG succinimidyl valerateを、ろ過した重炭酸ナトリウム溶液350 micro litersに溶解させます。遮光チューブを用いて、溶液を光から保護します。チューブを10秒間激しくボルテックスした後、10,000 x gで1分間遠心分離し、気泡を除去します。次に、ガラススライドをアセトンで洗浄し、続いてエタノールで洗浄します。洗浄後、スライドガラスを完全に風乾させます。きれいなガラススライド上にPEG溶液を50 µL滴下します。カバーガラスの下に気泡が入らないよう、アミノシラン処理したカバーガラスをわずかに角度をつけて、液滴の上にゆっくりと下ろします。次に、スライドを水平に置き、遮光された加湿チャンバー内で、室温にて少なくとも3時間から一晩静置します。終了後、残ったPEG溶液を遮光チューブに封入し、4 °Cで保存してください。インキュベーション後、PEG化したカバーガラスを脱イオン水で十分に洗浄し、使用時まで遮光した乾燥した場所に保管します。フローチャンバーを作成するために、アクリルホルダーの上に両面テープを貼り付けます。この際、テープが入口および出口の穴に対して垂直に並び、各チャネル穴を妨げないように配置してください。次に、ピペットチップを用いてテープを擦り、チャネルを密封します。続いて、PEG化カバーガラスのPEG化面を下にしてテープの上に配置し、フローチャンバーを作成します。溶液の漏出を防ぐため、両面テープを貼付した領域の上にカバーガラスの上端を押し付けます。次に、チャンバーの縁に速乾性エポキシ接着剤を塗布し、固定します。続いて、長さ2.5 centimeterのチューブを気密シリンジに接続し、接合部をエポキシ接着剤で密封します。次に、シリンジから伸びているチューブに、長く柔軟なチューブを接続します。ここでも、接合部をエポキシ接着剤で密封します。シリンジに接続されたチューブ内に、気泡が入らないように注意しながら脱イオン水を満たします。次に、エポキシ樹脂で密封されたフローチャンバーの穴にチューブを挿入します。そして、もう一方の穴に200 µLピペットチップを配置し、リザーバーとして使用します。シリンジポンプの流量を50 µL/minに設定します。次に、アビジンタンパク質溶液 20 µLをチャンバーに流し、10分間静置します。続いて、ビオチン化オリゴデオキシヌクレオチド 20 µLをシリンジに充填します。これをチャンバーに流し、10分間静置します。ターミナル・トランスフェラーゼを使用する場合は、オリゴデオキシヌクレオチドのロードを省略します。次に、DNA溶液 20 µLをシリンジに充填し、10 µL/minの流速でチャンバー内に流し、30分間保持します。30分間のインキュベーション後、1X TEバッファー 40 µLを50 µL/minで流してフローチャンバーを洗浄します。洗浄後、1X TEで調製した濃度80 nMの同一のFP-DBPを40 µL、チャンバーに注入します。DNA分子の完全な伸長範囲を確認するため、使用するDNAの長さに応じて異なる流速を適用してください。蛍光顕微鏡を用い、60倍の対物レンズでDNAを観察します。以下は、ビオチン化相補オリゴヌクレオチドでライゲーションし、表面に係留させたバクテリオファージλ DNA分子が、流れによって伸長される様子を示す蛍光顕微鏡ビデオです。流れの下で、完全に伸長したDNA分子の長さは16.5 micronsです。対照的に、バクテリオファージT4のDNA分子は、流れの下で56.4 micronsの長さまで伸長します。この伸長は可逆的であり、DNAは繰り返し伸長と緩和させることが可能です。このビデオを視聴することで、大規模なDNA解析におけるFP-DBPの使用方法を十分に理解し、DNAポリマーの伸長および弛緩を実証できるようになります。

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生物学

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