2016年6月23日
ポリエチレングリコール(PEG)とアビジンコーティングされたガラス表面につながれ、マイクロ流体のせん断流で引き伸ばされた蛍光タンパク質DNA結合ペプチド(FP-DBP)で染色された大きなDNA分子を視覚化するアプローチを提示します。
この手順の全体的な目標は、エピ蛍光顕微鏡用の便利なDNA分析システムを作成し、改質ガラス表面上の単一分子DNAを操作することです。この方法は、DNA可視化分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。DNA自己、DNA結合タンパク質、その他の小分子を調べるとき。
この技術の主な利点は、移動するDNAを簡単に観察および分析できることです。まず、ガラスのカバースリップをPTFEラックに置き、PTFEスレッドシールテープを使用して所定の位置に固定します。カバースリップを包んだ後、クリーニング手順中にラックの取り扱いに使用する長さ5センチのテープを残しておきます。
ドラフトで、350ミリリットルの硫酸と150ミリリットルの過酸化水素を1リットルのガラスビーカーに混ぜ合わせて、ピラニアエッチング溶液を作ります。次に、カバースリップのラックを溶液に入れます。2時間後、ビーカーを空にし、カバーガラスを脱イオン水で十分にすすいでください。
ビーカー内の水のPHが中性のPHに達するまで、カバーガラスをすすぎ続けます。次に、カバースリップのラックをビーカーで30分間超音波処理し、ガラス基板を洗浄して誘導体化します。アミノシラン化の直前に、ビーカーから空の水。まず、清潔なポリプロピレン容器に2ミリリットルのアルコキシシランと10ミリリットルの氷酢酸を200ミリリットルのメチルアルコールに加えて、アミノシラン化溶液を調製します。
続いて、きれいなカバースリップを溶液に入れます。次に、洗浄したカバースリップを調製した溶液に入れ、室温で100rpmで30分間振とうします。次に、誘導体化されたカバースリップで容器を75ワットで15分間超音波処理します。
その後、室温で100rpm以上再度振とうします。終了したら、ビーカーから溶液を空にし、カバースリップを3回注意深くすすぎます。1回はメチルアルコール、2回はエチルアルコールです。
最終すすぎ後、カバーガラスをエチルアルコールで保管し、2週間以内に使用してください。まず、0.1モルの重曹溶液を10ミリリットル作り、0.22ミクロンのシリンジフィルターでろ過します。次に、2ミリグラムのビオチンPEGスクシンイミジルカーボネートと80ミリグラムのPEGスクシンイミジル吉草酸エステルを350マイクロリットルのろ過重炭酸ナトリウム溶液に溶解します。
光保護チューブを使用して溶液を光から保護します。チューブを10秒間激しく渦巻き、次に10、000 x gで1分間遠心分離して気泡を取り除きます。次に、スライドガラスをアセトンですすぎ、続いてエチルアルコールですすいでください。
すすぎたら、スライドを完全に風乾させます。50マイクロリットルのPEG溶液を清潔なスライドガラスの上に置きます。アミノシラン化カバースリップをわずかな角度で液滴上にゆっくりと下げて、カバースリップの下に気泡が発生しないようにします。
次に、スライドを室温で少なくとも3時間から一晩、水平で暗く加湿されたチャンバーに入れます。終了したら、残留PEG溶液を光保護チューブに密封し、摂氏4度に保ちます。インキュベーション後、PEG化カバースリップを脱イオン水で十分にすすぎ、使用するまで暗く乾燥した場所に保管します。
フローチャンバーを作成するには、アクリルホルダーに両面粘着テープストリップを置き、入口と出口の穴に対して垂直に位置合わせされ、チャネル穴を乱さないようにします。次に、ピペットチップを使用してテープをこすり、チャネルをシールします。次に、PEG化した面を下にして、PEG化カバースリップをテープの上部に置き、フローチャンバーを作成します。
溶液が漏れないように、両面テープが貼られている領域にカバースリップの上部を押し付けます。次に、速乾性のエポキシ接着剤をチャンバーの端に追加して、所定の位置に固定します。次に、長さ2.5センチメートルのチューブを気密シリンジに接続し、ジョイントをエポキシ接着剤でシールします。
次に、長くて柔軟なチューブをシリンジからのチューブに接続します。そして再び、エポキシ接着剤でジョイントをシールします。シリンジにつながれているチューブに脱イオン水を入れ、気泡がないことを確認します。
次に、エポキシ接着剤で密封されているフローチャンバーの穴にチューブを挿入します。そして、200マイクロリットルのピペットチップをもう一方の穴に置き、リザーバーとして使用します。シリンジポンプの流量を毎分50マイクロリットルに設定します。
次に、20マイクロリットルのアビジンタンパク質溶液をチャンバーに流し、10分間そのままにします。次に、20マイクロリットルのビオチン化オリゴデオキシヌクレオチドをシリンジにロードします。それをチャンバーに流し込み、10分間そのままにしておきます。
末端トランスフェラーゼを使用する場合は、オリゴデオキシヌクレオチドのローディングをスキップしてください。次に、20マイクロリットルのDNA溶液を注射器にロードし、毎分10マイクロリットルの速度でチャンバーに流し込み、30分間そこに保持します。30分間のインキュベーション後、フローチャンバーを40マイクロリットルの1X TEバッファーで毎分50マイクロリットルで洗浄します。
洗浄したら、同じFP-DBPを80ナノモルの濃度で40マイクロリットルをチャンバーにロードし、1X TE.To でDNA分子の全ストレッチ範囲を確認し、使用するDNAの長さに応じて異なる流量を適用します。蛍光顕微鏡を使用して、60倍の対物レンズの下でDNAを観察します。これは、表面につながれたバクテリオファージのラムダDNA分子が、ビオチン化相補型オリゴヌクレオチドによるライゲーション後の流れによって引き伸ばされる様子を撮影した蛍光顕微鏡ビデオです。
フロー下では、完全に細長いDNA分子の長さは16.5ミクロンです。対照的に、バクテリオファージT4 DNAモムレキュールは、フロー下で56.4ミクロンの長さに伸びています。この伸長は可逆的であり、DNAは複数回伸ばしたり弛緩させたりすることができます。
このビデオを見れば、FP-DBPを大規模DNA解析で使用する方法や、DNAポリマーの伸縮性と緩和性を実証する方法を十分に理解できるはずです。
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この記事では、蛍光タンパク質DNA結合ペプチド(FP-DBP)で染色した大きなDNA分子を可視化する方法を紹介します。この技術は、これらの分子をポリエチレングリコール(PEG)とアビジンでコーティングされたガラス表面に固定し、マイクロ流体シアー流によってそれらを伸ばすことを含みます。
Direct visualization of surface-tethered large DNA molecules using fluorescent protein DNA binding peptides (FP-DBP) enables precise interrogation of DNA-protein interactions at the single-molecule level. This capability supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in biopharma discovery pipelines. The method enhances predictive confidence for downstream assay development and screening workflows.
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to assay development and preclinical research, supporting lead identification and target validation.