ペプチドを結合蛍光タンパク質のDNAを用いた表面係留大型DNA分子の可視化

本手順の全体的な目的は、エピ蛍光顕微鏡用の便利なDNA解析システムを構築し、修飾ガラス表面上で単一分子DNAを操作することです。本手法は、DNA自体の観察に加え、DNA結合タンパク質やその他の低分子を調べることで、DNA可視化分野における重要な疑問への回答に寄与します。

この手法の主な利点は、移動するDNAを容易に観察および分析できることです。まず、ガラスカバースリップをPTFEラックに配置し、PTFE製シールテープを用いて固定します。カバースリップを巻いた後、洗浄手順中にラックを扱うために使用するテープを5 cmほど残しておきます。

ドラフトチャンバー内で、1Lのガラスビーカーに350 mLの硫酸と150 mLの過酸化水素を混ぜ合わせ、ピラニアエッチング溶液を調製します。次に、カバーグラスをセットしたラックをこの溶液に入れます。2時間後、ビーカーの中身を捨て、カバーグラスを脱イオン水で十分に洗浄します。

ビーカー内の水のpHが中性になるまで、カバーガラスの洗浄を続けます。次に、ガラス基板を洗浄し脱脂するため、水を入れたビーカーの中でカバーガラスをセットしたラックを30分間超音波洗浄します。アミノシラン化の直前に、ビーカーから水を捨てます。まず、清潔なポリプロピレン製容器の中で、200 mLのメタノールに2 mLのアルコキシシランと10 mLの氷酢酸を加えて、アミノシラン化溶液を調製します。

続いて、洗浄済みのカバーガラスを溶液に入れます。次いで、洗浄済みのカバーガラスを調製した溶液に入れ、室温、100 rpmで30分間振とうします。次に、誘導体化されたカバーガラスが入った容器を、75 Wで15分間超音波処理します。

次に、室温、100 rpmで少なくとも30分間、再び振盪させます。終了後、ビーカーから溶液を捨て、カバーガラスを慎重に3回洗浄します。1回はメチルアルコールで、残り2回はエチルアルコールで行ってください。

最終すすぎの後、カバーガラスをエタノール中に保存し、2週間以内に使用してください。まず、0.1 molarsの重炭酸ナトリウム溶液を10 milliliters調製し、0.22 micronのシリンジフィルターでろ過します。次に、2 milligramsのbiotin PEG succinimidyl carbonateと80 milligramsのPEG succinimidyl valerateを、ろ過した重炭酸ナトリウム溶液350 micro litersに溶解させます。

遮光チューブを用いて、溶液を光から保護します。チューブを10秒間激しくボルテックスした後、10,000 x gで1分間遠心分離し、気泡を除去します。次に、ガラススライドをアセトンで洗浄し、続いてエタノールで洗浄します。

洗浄後、スライドガラスを完全に風乾させます。きれいなガラススライド上にPEG溶液を50 µL滴下します。カバーガラスの下に気泡が入らないよう、アミノシラン処理したカバーガラスをわずかに角度をつけて、液滴の上にゆっくりと下ろします。

次に、スライドを水平に置き、遮光された加湿チャンバー内で、室温にて少なくとも3時間から一晩静置します。終了後、残ったPEG溶液を遮光チューブに封入し、4 °Cで保存してください。インキュベーション後、PEG化したカバーガラスを脱イオン水で十分に洗浄し、使用時まで遮光した乾燥した場所に保管します。

フローチャンバーを作成するために、アクリルホルダーの上に両面テープを貼り付けます。この際、テープが入口および出口の穴に対して垂直に並び、各チャネル穴を妨げないように配置してください。次に、ピペットチップを用いてテープを擦り、チャネルを密封します。続いて、PEG化カバーガラスのPEG化面を下にしてテープの上に配置し、フローチャンバーを作成します。

溶液の漏出を防ぐため、両面テープを貼付した領域の上にカバーガラスの上端を押し付けます。次に、チャンバーの縁に速乾性エポキシ接着剤を塗布し、固定します。続いて、長さ2.5 centimeterのチューブを気密シリンジに接続し、接合部をエポキシ接着剤で密封します。

次に、シリンジから伸びているチューブに、長く柔軟なチューブを接続します。ここでも、接合部をエポキシ接着剤で密封します。シリンジに接続されたチューブ内に、気泡が入らないように注意しながら脱イオン水を満たします。

次に、エポキシ樹脂で密封されたフローチャンバーの穴にチューブを挿入します。そして、もう一方の穴に200 µLピペットチップを配置し、リザーバーとして使用します。シリンジポンプの流量を50 µL/minに設定します。

次に、アビジンタンパク質溶液 20 µLをチャンバーに流し、10分間静置します。続いて、ビオチン化オリゴデオキシヌクレオチド 20 µLをシリンジに充填します。これをチャンバーに流し、10分間静置します。

ターミナル・トランスフェラーゼを使用する場合は、オリゴデオキシヌクレオチドのロードを省略します。次に、DNA溶液 20 µLをシリンジに充填し、10 µL/minの流速でチャンバー内に流し、30分間保持します。30分間のインキュベーション後、1X TEバッファー 40 µLを50 µL/minで流してフローチャンバーを洗浄します。

洗浄後、1X TEで調製した濃度80 nMの同一のFP-DBPを40 µL、チャンバーに注入します。DNA分子の完全な伸長範囲を確認するため、使用するDNAの長さに応じて異なる流速を適用してください。蛍光顕微鏡を用い、60倍の対物レンズでDNAを観察します。以下は、ビオチン化相補オリゴヌクレオチドでライゲーションし、表面に係留させたバクテリオファージλ DNA分子が、流れによって伸長される様子を示す蛍光顕微鏡ビデオです。

流れの下で、完全に伸長したDNA分子の長さは16.5 micronsです。対照的に、バクテリオファージT4のDNA分子は、流れの下で56.4 micronsの長さまで伸長します。この伸長は可逆的であり、DNAは繰り返し伸長と緩和させることが可能です。

このビデオを視聴することで、大規模なDNA解析におけるFP-DBPの使用方法を十分に理解し、DNAポリマーの伸長および弛緩を実証できるようになります。