Name: ポータブルFRETアナライザを使用して高感度かつ迅速な蛍光検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学ぶポータブルFRETアナライザを用いた飲料中の糖含量の高感度定量法。マルトース特異的蛍光バイオセンサーとE. coliを利用し、高価な蛍光光度計不要で迅速な検出を実現する食品科学の革新的手法です。

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この研究は、グローバルフロンティアプロジェクト（2011から0031944）とKRIBB研究イニシアティブプログラムのインテリジェント合成生物学センターからの助成金によってサポートされていました。

バイオセンサーの作製<ol><li>以前に確立されたプロトコル2に従うことにより、CFP-MBP-YFP-のHis6 -プラスミドpET21a（+）を構築します。 </li><li> 大腸菌 DE3株の単一コロニーをルリアブロス（LB）の5ミリリットルを接種し、振盪しながら16時間37℃でインキュベートします。 </li><li>転送100 mlのLBを含有し、600 nmで（OD 600）での光学密度が0.5（約3時間）に達するまで振盪インキュベーター中、37℃でインキュベートした500mlフラスコ中にO / N培養物を1ml。 </li><li> 4℃で20分間1000×gでの遠心分離によって50mlのコニカルチューブ中で細胞を収穫。 </li><li> 4℃で20分間、1,000×gで50ミリリットルの氷冷蒸留水（DW）と遠心で各チューブに迅速にペレットを再懸濁。 </li><li>溶液（エレクトロ細胞）OD 600に達するまで穏やかに旋回することにより、10％（v / v）のグリセロールを氷冷DW50μlにペレットを再懸濁</sub&gt;の100の。 </li><li>エレクトロポレーション装置およびエレクトロポレーションで氷冷エレクトロポレーションキュベットにCFP-MBP-YFP-のHis6 -エレクトロ細胞（OD 100の600の細胞を50μl）の混合物を配置し、プラスミドpET21a（+）の10 ngの混合物（18キロボルト/ cmで、25μF）。 </li><li>迅速にキュベットに1ミリリットルSOC培地を加え、穏やかに15ミリリットル丸底チューブ中で振盪しながら1時間37℃での回復が続く、穏やかに細胞を再懸濁。 </li><li> 100μg/ mlのアンピシリンを含むLBプレート上に細胞を広げ、12時間37℃でインキュベートします。 </li><li>ループを使用して、単一のコロニーを単離し、12時間振とう機で37℃で100μg/ mlのアンピシリンを含むLB 10mlのコロニーを接種します。 </li><li> 100μg/ mlのアンピシリンを含むLBの500ミリリットルに種培養の5ミリリットルを加え、37℃の振盪インキュベーター中で培養をインキュベートします。 </li><li> 0.5mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトシド（IPTG）ときOD 600に達するを追加0.5と24時間37℃で振盪インキュベーターでの培養をインキュベートします。 </li><li>遠心分離機20分（4℃）のために4500×gで細胞と穏やかに上清を除去します。 </li><li> 5mLの結合緩衝液（20mMのトリス-HCl、pH8.0の、1mMのPMSF、0.5mMのEDTA、および1mM DTT）中でペレットを再懸濁します。 </li><li>各冷却の10秒でバースト以下、200-300 Wで6 10秒バーストで氷上で細胞を超音波処理します。 </li><li> 10,000×で溶解液を遠心 細胞破片をペレット化し、4℃で30分間、G。新しいコレクションチューブに上清（可溶性タンパク質）を転送します。 </li><li> Ni-NTAアフィニティーカラム（5mlの容量）にFRETセンサータンパク質のアフィニティー精製、負荷クリア細胞溶解物を4mlを達成し、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）18を使用して、クロマトグラフィーアッセイを行います。 </li><li>洗浄緩衝液I（50mMリン酸緩衝液、300mMの塩化ナトリウム、10mMイミダゾール、pH7.0）での5カラム容量で一度カラムを洗浄します。 </li><li>洗浄バッファーIIの5カラム容量の（50mMリン酸緩衝液、300mMの塩化ナトリウム、20mMイミダゾール、pH7.0）で洗浄ステップを繰り返し。 </li><li>溶出緩衝液の5カラム容量の（50mMリン酸緩衝液、300mMの塩化ナトリウム、500mMイミダゾール、pH7.0）でセンサータンパク質を溶出させます。 </li><li>溶出された試料を濃縮し、脱塩するために、3000×gで10分間のサンプルと遠心機の最大20 mlの濃縮器（10,000 MWの膜サイズ）を記入してください。 0.8％リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて濃縮器を補充。最初のサンプル20mlでコンセントレータを充填し、その後、PBSで再充填、二回、この手順を繰り返します。 </li><li>濃縮し、脱塩漬けセンサータンパク質を回収し、-80℃で保管してください。 </li></ol> FRET Analyzerを使用して、糖度の2.測定注：FRETアナライザ構成の詳細は、私たちの前の仕事7で説明しました。 <ol><li> 0.2を含有する0.8％PBSの検出溶液を調製センサータンパク質のμM。 </li><li> FRET分析装置の電源をオンにします。最適な温度を校正するために2秒間「UP」ボタンを押してください。 &quot;UP&quot;と &quot;DOWN&quot;ボタンを使用して53℃に温度を設定し、「SET」ボタンを押してください。 </li><li>キャリブレーションのために、プレスおよび2秒間同時に「UP」と「DOWN」ボタンを押し続けます。 LEDパネルディスプレイ「CALIB」とは、「SET」ボタンを押していることを確認します。 </li><li>アナライザのキュベットホルダーにバッファリングし、「SET」ボタンを押すだけで、PBSを含む12.5×12.5×45ミリメートル（高さ×幅×長さ）の直方体容器（キュベット）を配置します。 </li><li>砂糖なしのみ検出溶液（2.1を参照）（マルトース/スクロース）を含むものとキュベットを交換し、ベースラインを較正するための「SET」ボタンを押してください。 </li><li> 10mMの砂糖を検出溶液を含むものとキュベットを交換し、「SET」を押してくださいボタン。 </li><li>飲料サンプルの糖度を測定するために、1分間16,000×gで1.5 mlのマイクロ遠心チューブと遠心分離機に1 mlの飲料サンプルを置きます。 注：FRETセンサーベースの蛍光測定は、サンプルのわずか1％（V / V）が全容量に含まれているので、サンプルの特別な前処理を必要としないという利点を有します。しかし、我々は、蛍光測定（ 例えば、細胞、不溶性粒子、脂質、脂肪、または自家蛍光を持つ任意の材料）に影響を与える可能性のある物質を除去することをお勧めします。強酸、強塩基、剤（界面活性剤）を洗浄、又は乳化剤（乳化剤）が高濃度で存在し、FRET生体センサの特性に影響を与える可能性がある場合に加えて、それは、有機溶媒または使用して除去されるべきです中和剤。乳脂肪および乳化剤を凍結スナックから除去されたとき、例えば、試料を16,000×30分間、G、および液体betweeで微量遠心管中で遠心分離しますnは底質や乳製品脂肪のトップ層が抽出されます。ヘキサンの等量は、その後脂質を除去するために30分間、15,000×gで遠心分離し、続いて添加されます。 </li><li> 1-mlシリンジで上清を除去し、シリンジフィルター（孔径0.2μm）を通してそれをフィルタリングします。 </li><li>静かに0.9ミリリットルのPBSと渦を含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに飲料サンプルフィルタリング0.1ミリリットルを置きます。 注：それは正しく飲料サンプルを希釈することが重要です。糖濃度は、装置のダイナミックレンジ内に入るであろうように、この場合には、1000倍希釈を行いました。私たちは、飲料のラベルで糖度を参照することにより、事前に対象の糖濃度を推定することをお勧めします。 </li><li>検出溶液の0.495ミリリットルを含むキュベットに希釈飲料サンプル（1％、v / v）での5μlを添加します。 </li><li> FRET分析器のキュベットホルダーにキュベットを置き、53℃に試料溶液を予熱。 </li><li>糖度を測定するための「SET」ボタンを押してください。 535分の488ナノメートル7,8割合を読み取ることによって、温度制御用のペルチェ素子を備えたマルチラベルプレートリーダーまたは蛍光分光光度計を使用して、FRET測定を評価することが可能であることに注意。ショ糖検出のために、CSY-LHセンサ2で1.1から2.12への手順に従ってください。 </li></ol>

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<li>Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sweetened+beverage+consumption+is+associated+with+increased+risk+of+stroke+in+women+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men.</a> J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).</li>
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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルは、FRETセンサーのための最適な温度でカスタムメイドのFRET解析装置7を使用して、飲料試料中の糖含量の迅速かつ効率的な定量化を可能にします。分析器は、光源とシリコンフォトダイオードと2つの光検出器として最近開発された、安価な405-nm帯の紫外LEDで設計されました。このデバイスは、より費用対効果の他の同等の蛍光光度計よりなります。デバイスは、特にFRETセンサーのための最適な温度範囲で2つの発光波長帯域の比（530 nmおよび480 nm）を測定する場合、高い検出感度を示しました。種々の糖の検出感度と強度を蛍光分光器7のものよりも優れていました。 このプロトコルの主な目的は、カスタムメイドのFRET分析器でFRETベースのセンサの幅広い適用性をサポートすることです。アナライザは、間接的に私は、FRETセンサーを経由して糖度を測定しながら、tは、デバイスが広く伸縮遺伝子操作されたリガンド特異性、モジュラー設計、センサー濃度に依存した信号、及び細胞内小分子の正確なターゲティングを含むFRETセンサーの多くの利点を組み込むこ...

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）が広く、糖、カルシウムイオン、およびアミノ酸1-4のような小分子を検出するための生体センサとして使用されてきました。 FRETバイオセンサーは、ペリプラズム結合タンパク質（のPBP）の両末端に融合される蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質（CFPS）、および黄色蛍光タンパク質（YFPs）を含みます。糖は、その後のPBPの両端にある2つの蛍光タンパク質の距離と遷移双極子の向きを変化させるセンサに構造変化を引き起こし、FRETセンサーの中央に位置するのPBPに結合します。この変更は、EYFP（530 nm）をECFP（480 nm）での発光波長の比を測定することにより、糖度の定量分析を可能にします。高い感度、特異性、リアルタイムの監視能力、及びFRETバイオセンサーの速い応答時間のために、これらのセンサが広く、環境産業、および医療用途5で使用されています。また、ratiomセンサー濃度を容易に制御することができず、バックグラウンド蛍光が常に存在する複雑な生物学的試料中の成分を測定するために使用することができるようにFRETバイオセンサーを用いてetric測定は、重要な実用上の利点を有しています。 定量的な可視化のためのFRETベースのセンサのこれらの利点にもかかわらず、蛍光タンパク質の不完全なドメイン動き転送に小さな構造的変化は、本質的に弱い信号強度を生成します。この弱い信号は、 インビトロまたはインビボ分析 6 に FRETベースのセンサの適用を制限します。その結果、ほとんどのFRETバイオセンサーは高価で高感度な装置の使用を必要とします。以前、我々は、既存の蛍光分析装置7と同様の機能を備えた安価なポータブルFRET分析装置を開発しました。この装置では、安価な405 nmの帯域紫外発光ダイオード（LED）は、目の励振を引き起こすために、光源として使用されました電子蛍光シグナル、高価なランプまたはレーザーを置き換えます。分析装置の検出システムは、効率的にシリコンフォトダイオードを有する2つの光検出器上に放熱蛍光信号を集束させます。 55°C大幅レシオメトリックFRETシグナル8を拡大できた-より最近の研究では、50の検出温度の最適化があることを示しました。この温度固有のシグナル増強は、カスタムメイドのFRETアナライザと一緒に、迅速かつ高感度で、より一般的な診断用途でのFRETセンサーの使用を可能にします。 このプロトコルでは、我々は、商業的に入手可能な飲料の糖含有量を定量することにより、最適なFRET温度条件下FRET解析の一般的な適用可能性を実証しました。このプロトコルは、FRETデバイス動作の詳細、ならびにセンサーおよび試料調製の簡単な説明を提供します。我々は、この報告書は、ポータブルの潜在的な適用を促進することを期待します小規模な実験室環境でのアナライザとFRETベースのバイオセンサーと安価なオンサイト診断装置のさらなる発展のための基盤を提供します。

<table><tbody><tr><td>LB</td><td>BD</td><td>#244620</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル &beta;-D-チオガラクトシド (IPTG)</td><td>Σ</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>Σ</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Tri-HCl</td><td>バイオニア</td><td>C-9006-1</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>シグマ</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>バイオニア</td><td>C-9007</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>シグマ</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>純正</td><td>19015-0350</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4</td></tr><tr><td>SOC</td><td></td><td></td><td>2% トリプトン, 0.5% 酵母抽出物, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose</td></tr><tr><td>Resource Q</td><td>Amersham Biosciences</td><td>17-1177-01</td><td>6 &times; 30 mm 陰イオン交換クロマトグラフィーカラム&nbsp;</td></tr><tr><td>HisTrap HP1</td><td>Amersham Biosciences</td><td>29-0510-21</td><td></td></tr><tr><td>石英キュベット</td><td>Sigma</td><td>Z802875</td><td></td></tr><tr><td>AK&Auml;KTAFPLC</td><td>Amersham Biosciences</td><td>18-1900-26</td><td>高速タンパク質液体クロマトグラフィー (FPLC)</td></tr><tr><td>Cary Eclipse</td><td>VarianInc</td><td></td><td>蛍光分光光度計</td></tr><tr><td>VICTOR&nbsp;&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0050</td><td>a multilabel plate reader</td></tr><tr><td>E. coli JM109 (DE3)</td><td>Promega</td><td></td><td>Electrocompetent cells</td></tr><tr><td>A (Beverage)</td><td>Korea Yakult Co. (Korea)</td><td>Birak</td><td>Fermented</td></tr><tr><td>drinks B (Beverage)</td><td>Lotte Foods (Korea)Epro</td><td></td> <td>Soft drink</td></tr><tr><td>C (Beverage)</td><td>Lotte Foods (Korea)</td><td>Getoray</td><td>Sports drink</td></tr></tbody></table>

ポータブルfretアナライザを使用して高感度かつ迅速な蛍光検出

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）センサにおける最近の改善は、イオンおよびアミノ酸を含む種々の小分子を検出するためのそれらの使用を有効にしています。しかしながら、FRETセンサーの生来の弱い信号強度を様々な分野での応用を防止し、高価な、ハイエンドの使用が必要な蛍光光度計になり大きな課題です。以前、我々は、特に、高い検出感度を達成するために、2つの発光波長帯域（530および480 nm）との比を測定することができる費用対効果の高い、高性能なFRET分析器を内蔵しました。 55゜C - 最近では、それは、細菌ペリプラズム結合タンパク質とのFRETセンサー50の臨界温度範囲で最大感度を有するリガンドを検出することが発見されました。このレポートは、温度固有のFRETセンサーと当社のポータブルFRET分析装置を用いて、市販の飲料試料中の糖含量を評価するためのプロトコルについて説明します。我々の結果は、追加予熱することを示しましたFRETセンサーのプロセスが大幅糖含有量のより正確な測定を可能にするために、FRET比の信号を増大させます。カスタムメイドのFRET分析器及びセンサが正常に商業飲料3種類の糖含有量を定量化するために適用しました。我々はさらに小型化や機器の性能向上は、ハイエンドの機器が利用できない環境で手持ち分析装置の使用を容易にするであろうことを期待しています。

FRET分析器を用いて糖度の定量分析を行うためには、観察されたFRET比から標的糖濃度を推定する近似曲線を構築することが必要です。 rは、480 nmでのCFPの発光強度の比とYFPの発光強度は、530nmで生成された定義でき（式1）。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54144/54144equation1.jpg" /> FRETバイオセンサー（53℃、CMY-BII）の用量反応曲線は、異なる糖濃度で、R、FRET比を観察することによって生成することができます。次のように、曲線は、その後、S字状、S字状曲線として表すことができます。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

このプロトコルは、カスタムメイドのポータブルFRET分析器を用いて蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）センサデータの迅速かつ高感度定量を記載しています。デバイスは、糖度の実用的かつ効率的な評価を可能にする、検出感度を最大臨界温度範囲にマルトースを検出するために使用しました。

ポータブルFRETアナライザを使用して高感度かつ迅速な蛍光検出

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

このプロトコルの全体的な目的は、市販飲料の糖分量を定量することで、最適条件下におけるFRETアナライザーの汎用性を実証することです。この手法は、糖のような低分子化合物のセンシングおよびモニタリング分野における重要な課題の解決に寄与します。本技術の主な利点は、高価で高性能なフルオロメーターを使用せずに、低分子化合物に対する新鮮な信号応答を効率的にモニタリングできる点にあります。本手順のデモンストレーションを行うのは、当研究室のHan博士です。まず、マルトースまたはスクロース特異的なシアンおよびイエロー蛍光バイオセンサープラスミドを準備します。次に、5 mLのLuria brothにDE3 E.Coliのシングルコロニーを接種し、振盪インキュベーターを用いて37 °Cで16時間培養します。次に、1 mLの培養液を100 mLのLBを含むフラスコに入れます。600 nmにおける光学密度（OD₆₀₀）が約0.5になるまで、振盪インキュベーターを用いて37 °Cで培養します。培養液を4 °Cで20分間遠心分離します。ペレットを50 mLの氷冷蒸留水に速やかに再懸濁し、再度20分間遠心分離します。ペレットを、グリセロール10 vol%と氷冷蒸留水の混合液 50 µLで再懸濁します。600 nmにおける光学密度（OD600）が100に達するまで、混合液を静かにスワールさせます。氷冷したエレクトロポレーションキュベット内で、この混合液と 10 ngのCMYプラスミドを混合します。混合物をエレクトロポレーションします。キュベット内で細胞を1 mLのSOC培地で再懸濁し、その後15 mLの丸底チューブに転送します。37 °Cで1時間静かに振盪して細胞を回復させます。100 µg/mLのアンピシリンを含むLB寒天プレートに細胞を塗布します。37 °Cで12時間インキュベートします。ループを用いて、単一のコロニーを100 µg/mLのアンピシリンを含む10 mLのLB培地に移植します。混合物を37°Cで12時間振盪培養し、シードカルチャーを作成する。シードカルチャーから5 mLを、アンピシリン添加LB培地500 mLに移し、振盪インキュベーターを用いて37°Cで細胞を培養する。600 nmにおける吸光度（OD600）が0.5に達したら、最終濃度が0.5 mMとなるようにIPTGを添加する。培養物を24時間インキュベートした後、細胞を20分間遠心分離します。上清を慎重に取り除き、ペレットを5 mLの結合バッファーで再懸濁します。氷上で細胞を10秒間ソニケーションし、その後、細胞を10秒間冷却します。超音波処理と冷却をさらに5回繰り返します。ライセートを30分間遠心分離します。上清を別の回収チューブに移します。ニッケルNTAアフィニティーカラムを用いて上清を精製します。10,000 milliwattの濃縮器に、精製したサンプルを20 milliliters分満たします。サンプルを10分間遠心分離し、その後、濃縮器に0.8% phosphate buffered salineを補充します。同様の手順で、サンプルの残りを20 millilitersずつ処理し、すべてのタンパク質の濃縮および脱塩が完了するまで繰り返します。精製したFRETバイオセンサーは-80 °Cで保存してください。検出溶液として、0.2 micromolarのCMYバイオセンサータンパク質溶液と0.8% PBSを調製します。携帯型FRETアナライザーの電源を入れます。分析温度を53°Cに設定します。次に、装置をキャリブレーションモードに設定します。背景として0.8%PBSをキュベットに満たします。アナライザー内でサンプルを53 degrees Celsiusに予熱し、その後、背景設定を行います。次に、キュベットに検出液を満たします。キュベットをアナライザーに設置し、ベースラインを設定します。キュベットを、検出液と1 mMの糖を含むものに交換します。飽和時の強度を設定し、キャリブレーションを完了させます。糖含有量分析のための飲料サンプルの調製を開始するには、1.5 mLマイクロ遠心チューブを用い、飲料1 mLを遠心分離します。1 mLシリンジで上清を回収し、0.2 µmシリンジフィルターで上清をろ過します。ろ液0.1 mLと0.8% PBS 0.9 mLを、1.5 mLマイクロ遠心チューブ内で混合します。混合物を穏やかにボルテックスし、完全に希釈させます。希釈した飲料サンプルの5 µLと検出液495 µLをキュベットに入れます。キュベットをアナライザーにセットし、サンプルを53 °Cに予熱します。セットボタンを押して、サンプルの糖含有量を測定します。この方法では、バイオセンサーにおける黄色蛍光タンパク質とシアン蛍光タンパク質の放出強度の比によってFRET効率を測定します。これらのCMYバイオセンサーの最適な測定温度は50〜55 °Cの間であり、この温度域でコントロール溶液とマルトース飽和溶液の放出強度比の差が最大となります。CMY-BIIバイオセンサーを用いて、53°Cにおける3種類の飲料のマルトース含量を評価しました。特定の温度において、さまざまなマルトース濃度でこの比率を取得することにより、用量反応曲線が作成されます。校正中に得られた値を用いて、発光比とマルトース濃度との関連付けが行われます。測定されたマルトース含量を、飲料メーカーによって報告された全糖含量とともに示します。飲料Aには、米や大麦などのマルトース源が含まれていました。それに伴い、観測されたマルトース量は、報告された全糖含量の約半分に相当します。スポーツ飲料である飲料Cのマルトース含有量は非常に低い値でした。この手順を実施する際は、装置およびFRETセンサーを50～55°Cの間で動作させることを忘れないでください。このビデオを視聴することで、特製の携帯型FRETアナライザーを用いて、このような低分子を定量する方法について十分に理解できるはずです。

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