ポータブルFRETアナライザを使用して高感度かつ迅速な蛍光検出

このプロトコルの全体的な目標は、市販の飲料の糖分を定量化することにより、最適な条件下でのFRET分析装置の一般的な適用性を実証することです。この方法は、糖などの低分子のセンシングおよびモニタリング分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、高価なハイエンドの蛍光光度計を使用せずに、小分子に対応する新しいシグナルを効率的に監視できることです。

その手順を実演していただくのは、当研究室のハン先生です。まず、マルトースまたはスクロース特異的なシアンおよび黄色の蛍光バイオセンサープラスミドを調製します。次に、5ミリリットルのルリアブロスにDE3 E.Coliの単一コロニーを接種し、振とうインキュベーターで摂氏37度で培養物を16時間インキュベートします。

次に、1ミリリットルの培養物を100ミリリットルのLBが入ったフラスコに入れます。フラスコを37°Cの振とうインキュベーターでインキュベートし、600ナノメートルの光学密度が約0.5になるまでインキュベートします。培養物を摂氏4度で20分間遠心分離します。ペレットを50ミリリットルの氷冷蒸留水にすばやく再懸濁し、再び20分間遠心分離します。

ペレットを50マイクロリットルの10容量パーセントのグリセロール溶液と氷冷蒸留水に再懸濁します。600ナノメートルの光学密度が100に達するまで、混合物を静かに渦巻かせます。氷冷エレクトロポレーションキュベットで、混合物を10ナノグラムのCMYプラスミドと組み合わせます。

混合物をエレクトロポレートします。キュベットで、細胞を1ミリリットルのSOC培地に再懸濁し、15ミリリットルの丸底チューブに移します。37度で1時間静かに振とうして細胞を回復させます。

1ミリリットルのアンピシリンあたり100マイクログラムのLB寒天プレートに細胞を広げます。細胞を37度で12時間インキュベートします。ループを使用して、1つのコロニーを100マイクログラム/ミリリットルのアンピシリンを含む10ミリリットルのLBに移します。

混合物を37度でインキュベートし、12時間振とうして種子培養物を作成します。5ミリリットルの種子培養物をアンピシリンを含む500ミリリットルのLBに移し、振とうインキュベーターで細胞を37度でインキュベートします。600ナノメートルの光学濃度が0.5に達したら、IPTGを添加して最終濃度を0.5ミリモルにします。

培養物を24時間インキュベートした後、細胞を20分間遠心分離します。上清を慎重に取り除き、ペレットを5ミリリットルの結合緩衝液に再懸濁します。氷上で細胞を10秒間超音波処理し、次に細胞を10秒間冷却します。

超音波処理と冷却をさらに5回繰り返します。ライセートを30分間遠心分離します。上清を別の収集チューブに移します。.

上清をニッケルNTAアフィニティーカラムで精製します。10, 000ミリワットの濃縮器に20ミリリットルの精製サンプルを充填します。サンプルを10分間遠心分離し、濃縮器に0.8%リン酸緩衝生理食塩水を補充します。

このプロセスを残りのサンプルで一度に20ミリリットルずつ繰り返し、すべてのタンパク質が濃縮されて脱塩されるまで繰り返します。精製したFRETバイオセンサーは摂氏80度で保存してください。検出溶液としてCMYバイオセンサータンパク質と0.8%PBSの0.2マイクロモル溶液を調製します。

ハンドヘルドFRETアナライザーの電源を入れます。解析温度を53°Cに設定します。次に、機器をキャリブレーションモードに設定します。

キュベットに0.8%PBSを背景として充填します。分析装置でサンプルを摂氏53度に予熱し、背景を設定します。次に、キュベットに検出溶液を充填します。

キュベットをアナライザーにセットし、ベースラインを設定します。キュベットを検出溶液と1ミリモルシュガーを含むものと交換します。強度を飽和値に設定して、キャリブレーションを終了します。

糖分分析用の飲料サンプルの調製を開始するには、1.5 ミリリットルの微量遠心チューブを使用して、飲料の 1 ミリリットルを遠心分離します。1ミリリットルのシリンジで上清を取り除き、0.2マイクロメートルのシリンジフィルターで上清をろ過します。0.1ミリリットルの濾液と0.9ミリリットルの0.8%PBSを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに組み合わせます。

混合物を穏やかにボルテックスして、完全に希釈します。希釈した飲料サンプル5マイクロリットルと検出溶液495マイクロリットルをキュベットに入れます。キュベットを分析装置に置き、サンプルを摂氏53度に予熱します。

設定ボタンを押して、サンプルの糖度を測定します。この方法では、バイオセンサー内の黄色蛍光タンパク質とシアン蛍光タンパク質の発光強度の比によってFRET効率を測定します。これらのCMYバイオセンサーの最適な測定温度は摂氏50度から55度で、制御溶液とマルトースの飽和溶液との間の放出強度比の差が最も大きくなります。

CMY-BIIバイオセンサーを使用して、3種類の飲料のマルトース含有量を53°Cで評価しました。用量反応曲線は、所与の温度でさまざまなマルトース濃度でこの比率を取得することから生成されます。排出比は、キャリブレーション中に得られた値を使用してマルトース濃度に関連しています。

測定されたマルトース含有量は、飲料メーカーによって報告された総糖含有量とともに示されています。飲料Aには、米や大麦などのマルトース源が含まれていました。これに対応して、観察されたマルトースの量は、報告された総糖含有量の約半分を占めています。

スポーツドリンクであるビバレッジCは、マルトース含有量が非常に少なかった。この手順を試みるときは、デバイスとFRETセンサーを摂氏50度から55度の間で操作することを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、カスタムメイドのハンドヘルドFRETアナライザーでこのような低分子を定量する方法を十分に理解できるはずです。