ポータブルFRETアナライザを使用して高感度かつ迅速な蛍光検出

このプロトコルの全体的な目的は、市販飲料の糖分量を定量することで、最適条件下におけるFRETアナライザーの汎用性を実証することです。この手法は、糖のような低分子化合物のセンシングおよびモニタリング分野における重要な課題の解決に寄与します。本技術の主な利点は、高価で高性能なフルオロメーターを使用せずに、低分子化合物に対する新鮮な信号応答を効率的にモニタリングできる点にあります。

本手順のデモンストレーションを行うのは、当研究室のHan博士です。まず、マルトースまたはスクロース特異的なシアンおよびイエロー蛍光バイオセンサープラスミドを準備します。次に、5 mLのLuria brothにDE3 E.Coliのシングルコロニーを接種し、振盪インキュベーターを用いて37 °Cで16時間培養します。

次に、1 mLの培養液を100 mLのLBを含むフラスコに入れます。600 nmにおける光学密度（OD₆₀₀）が約0.5になるまで、振盪インキュベーターを用いて37 °Cで培養します。培養液を4 °Cで20分間遠心分離します。ペレットを50 mLの氷冷蒸留水に速やかに再懸濁し、再度20分間遠心分離します。

ペレットを、グリセロール10 vol%と氷冷蒸留水の混合液 50 µLで再懸濁します。600 nmにおける光学密度（OD600）が100に達するまで、混合液を静かにスワールさせます。氷冷したエレクトロポレーションキュベット内で、この混合液と 10 ngのCMYプラスミドを混合します。

混合物をエレクトロポレーションします。キュベット内で細胞を1 mLのSOC培地で再懸濁し、その後15 mLの丸底チューブに転送します。37 °Cで1時間静かに振盪して細胞を回復させます。

100 µg/mLのアンピシリンを含むLB寒天プレートに細胞を塗布します。37 °Cで12時間インキュベートします。ループを用いて、単一のコロニーを100 µg/mLのアンピシリンを含む10 mLのLB培地に移植します。

混合物を37°Cで12時間振盪培養し、シードカルチャーを作成する。シードカルチャーから5 mLを、アンピシリン添加LB培地500 mLに移し、振盪インキュベーターを用いて37°Cで細胞を培養する。600 nmにおける吸光度（OD600）が0.5に達したら、最終濃度が0.5 mMとなるようにIPTGを添加する。

培養物を24時間インキュベートした後、細胞を20分間遠心分離します。上清を慎重に取り除き、ペレットを5 mLの結合バッファーで再懸濁します。氷上で細胞を10秒間ソニケーションし、その後、細胞を10秒間冷却します。

超音波処理と冷却をさらに5回繰り返します。ライセートを30分間遠心分離します。上清を別の回収チューブに移します。

ニッケルNTAアフィニティーカラムを用いて上清を精製します。10,000 milliwattの濃縮器に、精製したサンプルを20 milliliters分満たします。サンプルを10分間遠心分離し、その後、濃縮器に0.8% phosphate buffered salineを補充します。

同様の手順で、サンプルの残りを20 millilitersずつ処理し、すべてのタンパク質の濃縮および脱塩が完了するまで繰り返します。精製したFRETバイオセンサーは-80 °Cで保存してください。検出溶液として、0.2 micromolarのCMYバイオセンサータンパク質溶液と0.8% PBSを調製します。

携帯型FRETアナライザーの電源を入れます。分析温度を53°Cに設定します。次に、装置をキャリブレーションモードに設定します。

背景として0.8%PBSをキュベットに満たします。アナライザー内でサンプルを53 degrees Celsiusに予熱し、その後、背景設定を行います。次に、キュベットに検出液を満たします。

キュベットをアナライザーに設置し、ベースラインを設定します。キュベットを、検出液と1 mMの糖を含むものに交換します。飽和時の強度を設定し、キャリブレーションを完了させます。

糖含有量分析のための飲料サンプルの調製を開始するには、1.5 mLマイクロ遠心チューブを用い、飲料1 mLを遠心分離します。1 mLシリンジで上清を回収し、0.2 µmシリンジフィルターで上清をろ過します。ろ液0.1 mLと0.8% PBS 0.9 mLを、1.5 mLマイクロ遠心チューブ内で混合します。

混合物を穏やかにボルテックスし、完全に希釈させます。希釈した飲料サンプルの5 µLと検出液495 µLをキュベットに入れます。キュベットをアナライザーにセットし、サンプルを53 °Cに予熱します。

セットボタンを押して、サンプルの糖含有量を測定します。この方法では、バイオセンサーにおける黄色蛍光タンパク質とシアン蛍光タンパク質の放出強度の比によってFRET効率を測定します。これらのCMYバイオセンサーの最適な測定温度は50〜55 °Cの間であり、この温度域でコントロール溶液とマルトース飽和溶液の放出強度比の差が最大となります。

CMY-BIIバイオセンサーを用いて、53°Cにおける3種類の飲料のマルトース含量を評価しました。特定の温度において、さまざまなマルトース濃度でこの比率を取得することにより、用量反応曲線が作成されます。校正中に得られた値を用いて、発光比とマルトース濃度との関連付けが行われます。

測定されたマルトース含量を、飲料メーカーによって報告された全糖含量とともに示します。飲料Aには、米や大麦などのマルトース源が含まれていました。それに伴い、観測されたマルトース量は、報告された全糖含量の約半分に相当します。

スポーツ飲料である飲料Cのマルトース含有量は非常に低い値でした。この手順を実施する際は、装置およびFRETセンサーを50～55°Cの間で動作させることを忘れないでください。このビデオを視聴することで、特製の携帯型FRETアナライザーを用いて、このような低分子を定量する方法について十分に理解できるはずです。