Name: 細菌胞子の発芽中に皮質断片を検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 学ぶ細菌胞子発芽中の皮質断片と還元糖の比色定量法。Clostridium difficileを用いた標準的な実験プロトコルで、発芽動態を定量的に解析する手法を解説します。

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説明プロジェクトは、アレルギーと国立感染症研究所から賞数5R01AI116895でサポートされています。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立アレルギー感染症研究所や国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

1.生成のサンプル<ol><li>熱はCを活性化させます氷上で30分間、店舗65℃でディフィシレ胞子。 注：C.以前7,9,10説明したようにディフィシレ胞子は生産、精製することができます。 </li><li> Xは、サンプル数がアッセイ中に撮影されるX + 1 mlの発芽溶液を調製します。 注：発芽液が細菌の種に固有のもので検討されて胞子。 C.をアッセイするためのディフィシレ胞子発芽、我々は、10mMトリス（pH7.5）を、150mMのNaCl、脱イオン水中の100 mMグリシンおよび10mMタウロコール酸の溶液を用います。 </li><li>アッセイを開始する前に、皮質の断片を検出するためのブランクとして機能するように胞子をせずに発芽溶液1.0mlサンプルを描きます。 </li><li>すぐに発芽液と渦に〜3.0のOD 600に胞子を追加します。 注：Bの私たちの発芽試験のために枯草菌 、我々は同じODを使用6C.用として00胞子ディフィシル 。 注：胞子のこの量は、Cの間に皮質断片の放出をモニターするためによく働きましたディフィシレ胞子の発芽。このアッセイで使用される胞子の量は、それぞれ細菌または株について実験的に決定されるべきです。 </li><li> 14,000×gで1分間室温で胞子および遠心分離機を追加した直後に1.2ミリリットルのサンプルを削除してください。これは、ゼロ時点です。 </li><li>その後の皮質断片分析のために新しいチューブに遠心分離し、試料からの上清の1.0ミリリットルを転送します。 注：DPAを ​​監視する必要がある場合、テルビウム蛍光9,18,19に基づくアッセイを用いて、溶液中にDPAの検出のための別々の100μlのサンプルを削除します。 </li><li> -80℃で採取した試料を凍結します。 </li><li>全ての時点が完了するまで繰り返して、定期的に1.4と1.5を繰り返します。 ために遠心分離し、サンプリングに必要な時間を、時間点は以下番目注2分は離れて私たちの手順の間には不可能だったので、私たちのサンプリング間隔は、一回14分ごとに2分でした。 </li><li> 0、12.5、25、50、100、250、500、および5000：砂糖の検出および定量化を減少させるためのポジティブコントロールとして、N個の -acetylglucosamine（ナノモル）以下の量が含まれています。皮質サンプルと同時にこれらのサンプルを調製し、標準曲線は、胞子を発芽によって生成されたデータに関連しているように、皮質サンプルと一緒に実行します。 </li><li>すべての時点のサンプルを収集した後、サンプルを凍結乾燥。 注：私たちは、2ミリリットルのスクリューキャップチューブ中で私たちのサンプルを凍結乾燥しました。 </li></ol> 2.皮質断片を測定<ol><li> 1％のフェノール及び0.5％のβメルカプトエタノールを補充した3 N HClを120μlの凍結乾燥試料を再懸濁します。 </li><li> 2 mlのスクリューキャップチューブに再懸濁したサンプルを転送します。 注：再現性のために、すべての凍結乾燥した試料は再懸濁し、転送されていることを確認。 </li> &lt;LI&gt; 4時間95℃で再循環水浴中でサンプルをインキュベートします。 </li><li>彼らはクールになるまでインキュベートした後、氷上にサンプルを置きます。 </li><li> 3 M NaOHを120μlのサンプルを中和します。 </li><li>飽和重炭酸ナトリウム溶液の80μlを、各サンプルと渦に5％無水酢酸溶液の80μLを加えます。 </li><li> 10分間、室温でサンプルをインキュベートします。 </li><li>丁度3分のために戻って95℃の水浴にサンプルを転送します。 注：このステップは敏感で、より長い時間が下り信号の発達に影響を与えることができる時間です。 </li><li>水浴からサンプルを取り出して、氷上で冷却します。 </li><li>各チューブとボルテックスに6.54パーセントのK 2 B 4 O 7・4H 2 Oの400μlのを追加します。 </li><li>丁度7分間95℃の循環水浴中でサンプルをインキュベートします。 注：このステップは敏感で、より長い時間が下り信号の発達に影響を与えることができる時間です。 </li><li>削除します氷上で5分間のサンプルと場所。 </li></ol> 3.色試薬<ol><li>サンプルは氷（ステップ2.12）であるが、発色試薬を準備します。氷酢酸1.9ミリリットルであり、pの -dimethylaminobenzaldehyde（エールリッヒ試薬DMAB）の0.320グラムを溶解させます。 注意：試薬は、時間、温度と光に敏感であり、事前に行われるべきではありません。 </li><li> DMABが完全に溶解した後、10 N HCl及び渦の100μlを添加します。 </li><li>氷酢酸と渦の5ミリリットルを追加します。 </li></ol> 4.比色反応<ol><li>各100μlのを転送新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに皮質のサンプルを冷却しました。 </li><li>各サンプルに新たに調製した色溶液700μLを加えます。 </li><li>直ちに37℃の水浴にサンプルを転送し、正確に20分間インキュベートします。 </li><li>透明な96ウェルプレートに200μlの各サンプルを転送します。 </li><li>プレート上の585 nmでのサンプルを定量リーダー。サンプルは黄色で開始すべきであると陽性反応が紫にシフトします。より多くの皮質の存在、深い紫色。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

刺激を受けると、発芽の過程を経て胞子は巨大分子の合成を必要とせずに、それらの抵抗特性を失います。胞子の発芽がトリガされると、胞子コアは水2と引き換えにDPAを ​​解放します。休眠胞子の高いDPA内容に、胞子コアは、拡張2に対するバリアとして、おそらく、作用することにより、膨潤コアを防ぐことができます強烈な浸透圧や専門ペプチドグリカン、皮質下にあります。 上述の方法は、紫の色合いの測定シフトと還元糖の存在を検出するためにエールリッヒ試薬（黄色溶液）を使用します。皮質の加水分解の間、NAGとNAM糖が遊離する（加水分解酵素の程度に応じて、糖は、二糖類または多糖類として遊離させることができます）。塩酸（ステップ2.1）によるグリコシド結合の加水分解は、自由還元末端7で単糖を生成します。 neutraliz後水酸化ナトリウム（ステップ2.5）の等量酸る、NAGとNAM単糖類を囲むアルコールは無水酢酸（ステップ2.6）13によりアシル化されます。その後、未反応の無水酢酸を試料（ステップ2.8）を加熱して...

内生胞子は、細菌が不利な環境で存続することを可能にする細菌の代謝的に休止状態の形態です。多くの胞子形成細菌は、胞子形成は、栄養欠乏によって誘導されるが、このプロセスは、pH、酸素への曝露または他のストレス1に変更することによって制御することができます。それらの代謝休眠胞子の形で、一方、細菌は、UV照射、乾燥、高温、および2の凍結に耐えます。胞子形成過程に関する知識のほとんどは、モデル生物での研究、 枯草菌（Bacillus subtilis）から来ています。胞子形成のプロセスは、DNA複製および軸方向フィラメント3,4の形成から始まります。非対称隔壁は、2つの不均等サイズの区画にセルを分割します。大きなコンパートメントは、母細胞は、小さな区画、前胞子を飲み込みます。母細胞とドーマンを解放し、胞子、最終的に溶解する母細胞を成熟するために遺伝子発現を調整する前胞子の両方周囲の環境1へのT胞子。 胞子の構造と組成は、多くの細菌種間で保存されています。胞子コアは栄養細胞よりも低い含水量を有しており、ジピコリン酸（DPA）1,2と豊富です。胞子形成中、DPAは、水と引き換えに胞子コアに圧送されます。コアを囲むことは、ほとんどの芽胞形成菌で、発芽を刺激する小分子を認識する受容体（germinants）が2に位置している、内側の胞子膜です。ちょうど胞子の内膜の外側に位置する細胞壁ペプチドグリカンの層です。特殊なペプチドグリカン層（皮質）は、細胞壁のペプチドグリカンを囲み、[N-アセチルグルコサミン（NAG）およびN-アセチルムラミン酸（NAM）交互】細胞壁ペプチドグリカンと同じ構成要素の多くで構成されています。しかし、皮質におけるNAM残基の約​​50％は、ムラミン-δラクタム5,6に変換されています</s&gt;アップ。胞子発芽時には、これらのムラミン-δラクタム残基は、このように皮質はなく、細胞壁（発芽を完了するのに必須のプロセス）を分解することができるように、胞子皮質溶​​解酵素（SCLEs）によって認識されます。皮質の周囲には外膜とコートタンパク質2のいくつかの層です。 発芽のプロセスを制御することは芽胞形成菌のために非常に重要です。発芽受容体は、それぞれのgerminants 2を操作する際に発芽が開始されます。多くの胞子形成細菌では、これらのgerminants 2そのアミノ酸、糖、ヌクレオチド、イオンまたはこれらの組み合わせである。C.ディフィシレ胞子の発芽は、特定の胆汁酸[ 例えば 、タウロコール酸（TA）]およびアミノ酸（ 例えば 、グリシン）7-10の組み合わせによって開始されます。 Cの相違はありますがディフィシル発芽経路および他の胞子形成に研究経路このようなB.などの細菌、 枯草菌は、すべてに共通の栄養細胞が発芽胞子2,8から成長できるようにするために胞子皮質を分解するための絶対条件です。 （多くのクロストリジウムに見られるような）皮質の劣化がSCLEs CwlJ / SleB（ 枯草菌に見られるような）またはSLECによって達成することができます。皮質の加水分解は、細胞壁と胞子上の制約を軽減します。これは完全なコアの再水和、細胞代謝2のために必要なタンパク質の多くを再活性化に必要なステップを可能にします。 胞子が発芽したときに、位相暗状態と、このプロセスのフェーズ明状態から休眠胞子の変更は600での光学密度（OD）の変化によって測定することができます。 11 nmの。前回のレポートでは、ODの変化の多くは胞子12からのDPAのリリースによるものであることを示唆しています。我々の最近の研究の間、我々はCのタイミングを比較しようとしましたディフィシレ胞子の発芽・監視DPAおよび皮質の断片9のリリース。彼らは胞子を発芽によって解放されるようになったように、この研究のためには、皮質の断片の放出を監視するために重要でした。 ここで使用される比色アッセイはGhuysen らが開発した還元末端を有する糖を検出するための方法に基づいていた。13。他の人が還元糖14の検出のためのプロトコルを記述しているか、それらのプロトコル15を変更したので、このテーマに関する文献は混乱することができます。ここでは、詳細C.発芽から遊離した還元糖の比色検出のためのステップバイステップ方法ディフィシレ胞子。この研究では、Cを使用しますがディフィシレ胞子は、他の芽胞形成菌からの胞子の発芽中に放出された還元糖は、このプロトコル9,16,17で検出することができます。

<table><tbody><tr><td>2.0 mlスクリューキャップチューブ</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1420-3700</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Eppendorfピペット</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 Eppendorfピペット</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p20 Eppendorfピペット</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 - 1,250 &#956;lピペットチップ</td><td>VWR</td><td>89079-486</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &#956;llピペットチップ</td><td>VWR</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチル-D-グルコサミン</td><td>シグマ</td><td>A3286-25G</td><td></td></tr><tr><td>塩酸-10 N</td><td>BDH-Aristar</td><td>BDH3032-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>無水酢酸</td><td>Alfa Aesar</td><td>L04295</td><td></td></tr>重<tr><td>炭酸ナトリウム</td><td>BDH</td><td>BDH0280-500G</td><td></td></tr>カリウム<tr><td>四ホウ酸塩四水和物</td><td>Alfa Aesar</td><td>39435</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>BDH</td><td>BDH8019-500G</td><td></td></tr><tr><td>4- (ジメチルアミノ) ベンズアルデヒド</td><td>Σ</td><td>156477-100G</td><td></td></tr><tr><td>飽和フェノール</td><td>フィッシャー</td><td>BP1750-400</td><td></td></tr><tr><td>2- メルカプトエタノール</td><td>Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M3</td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酢酸、氷</td>河<td>BDH</td><td>BDH3098-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>加熱、循環水浴</td><td>VWR科学</td><td>モデル1136</td><td></td></tr><tr><td>マイクロテスト96</td><td>ファルコン</td><td>353072</td><td>96ウェルクリア組織培養</td></tr><tr><td>プレート培養チューブ</td><td></td><td>VWR89000-506</td><td></td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒートブロック</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスマシン</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

細菌胞子の発芽中に皮質断片を検出

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

クロストリジウム・ディフィシルや他のクロストリジウムにおける内胞子の発芽過程は、モデル胞子形成細菌である枯草菌とは異なることがますます明らかになっています。発芽は低分子の発芽物によって引き起こされ、高分子合成を必要とせずに起こります。バチルスとクロストリジウムの種では胞子発芽のメカニズムに違いがありますが、共通の要件は、胞子コアが膨潤して再水和することを可能にするペプチドグリカン様皮質の加水分解です。水分補給後、代謝が始まり、最終的には栄養細胞の成長につながります。胞子発芽中の加水分解皮質断片の検出は困難であり、前述のアッセイに対する変更が混乱を招いたり、再現が困難になったりする可能性があります。したがって、このアッセイを使用した最近のレポートに基づいて、細菌胞子の発芽中に皮質断片を比色的に検出するための段階的なプロトコルについて詳しく説明します。

表1は、NAG標準を使用した典型的な結果を示しています。データは、標準曲線を生成するために使用される。 表2は、100 mMグリシン及び10 mMのTA（発芽促進条件）、または100mMのグリシンのみ（未発芽状態）を補充した発芽バッファにおける発芽アッセイの代表的な結果を示しています。 TA、Cの非存在下ではディフィシレ胞子は発芽せず、溶液中の皮質の断片の存在はほとんど変化しません。しかし、C.、TAお ​​よびグリシンの両方の存在下で、 ディフィシレ胞子は発芽し溶液中に皮質の断片を放出します。これは、反応した試料の経時的なOD 585の増加として観察されます。このアッセイの間に放出さ皮質断片（ナノモル）の合計量は、 図1Bと同様の標準曲線を用いて計算しました。このアッセイでは、皮質の大部分が加水分解される（または解放）15分後により発芽暴露、胞子の大部分はこの時間枠（ <st...

ここでは、細菌の胞子発芽中に還元糖の存在を検出するための比色分析法について説明します。

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

このステップバイステッププロトコルの全体的な目的は、細菌胞子の発芽過程における皮質断片または還元糖の量を定量化することです。本手法では、胞子発芽中の皮質断片または還元糖の存在を検出するために必要な手順を詳しく説明します。この手法の主な利点は、ほとんどの研究室で本プロトコルを完遂するために必要な試薬と装置を備えていることです。まず、Clostridium difficile 胞子の入ったチューブをヒーティングブロックに入れ、65 °Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを氷上に置きます。発芽溶液は、研究対象となる細菌胞子の種によって異なります。C.difficile胞子の発芽を測定するために、pH 7.5の10 millimolar Trisに、150 millimolarの塩化ナトリウム、100 millimolarのグリシン、および10 millimolarのタウロコール酸を脱イオン水に溶解させた溶液を使用します。サンプル1つあたり1 milliliterの発芽溶液に、さらに1 milliliterを加えた量を用意してください。アッセイを開始する前に、発芽溶液1 milliliterをマイクロ遠心チューブに移して置いておきます。これを皮質断片検出のブランクとして使用します。次に、発芽溶液に、OD600が約3.0になるまで胞子を加え、短時間ボルテックスします。この量の胞子は、C.difficile胞子の発芽時における皮質断片の放出量を調整するのに適しています。胞子を添加した直後、1.2 mLのサンプルを新しいマイクロ遠心チューブに分取し、遠心機にかけます。室温で14,000 ×gで1分間遠心分離します。これが0時間目の時点となります。遠心後、上清を1 mL分、新しい2 mLスクリューキャップチューブに移し、-80 °Cで凍結保存します。各タイムポイントのサンプル収集が完了するまで、分注、遠心分離、および凍結の工程を一定の間隔で繰り返します。遠心分離とサンプリングに時間を要するため、本手順では2分未満のタイムポイントでの収集は不可能です。したがって、これらのサンプルは14分間、2分ごとに1回ずつ採取します。皮質サンプルの調製中にジピコリン酸のモニタリングが必要な場合は、別途100 µLのサンプルを採取し、氷上のマイクロ遠心チューブに分注してください。また、以下の量のN-acetylglucosamineを含む発芽溶液を用いて、標準曲線作成用のサンプルを準備します。0、12.5、25、50、100、250、500、および5,000 nanomolesです。各タイムポイントでサンプルを回収した後、それらのサンプルをフリーザーから取り出し、ブランクおよび標準曲線用サンプルとともに凍結乾燥させます。その後、すべてのサンプルを使用時まで-80°Cで保存します。アッセイ当日に、コントロールおよび標準曲線用サンプルを含む凍結乾燥サンプルを、フェノールおよびβ-メルカプトエタノール含有塩酸120 µLで再懸濁します。次に、再懸濁したすべてのサンプルを新しい2 mLスクリューキャップチューブに移します。次に、それらを95 °Cの循環水槽で4時間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルが冷めるまで氷上に置きます。その後、3 M 水酸化ナトリウムを120 µL加えて中和します。次に、各サンプルに飽和重曹溶液 80 µL と 5% 無水酢酸溶液 80 µL を加え、ボルテックスで混合します。その後、サンプルを室温で 10 分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを 95 °C の恒温水槽に戻し、正確に 3 分間保持します。このステップは時間に依存し、時間が長すぎるとその後のシグナル発生に影響を及ぼす可能性があることに注意してください。サンプルをウォーターバスから取り出し、氷上で冷却します。各チューブに6.54% tetraborate tetrahydrateを400 µL加え、ボルテックスします。サンプルを循環水槽に入れ、95 °Cで正確に7分間インキュベートします。このステップも時間に注意が必要です。サンプルを取り出し、氷上に5分間置きます。サンプルを氷上に置いている間に、呈色試薬を調製します。0.320 gのDMABを1.9 mLの氷酢酸に溶解させます。この試薬は時間、温度、および光に敏感であるため、事前に調製しないでください。DMABが完全に溶解した後、10 N 塩酸を100 µL加え、サンプルをボルテックスします。次に、氷酢酸を5 mL加え、再度ボルテックスします。比色反応を行うため、冷却した各皮質サンプルまたはコントロールサンプルを100 µLずつ、新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。調製直後の呈色溶液を各サンプルに700 µLずつ加えます。直ちにサンプルを37 °Cの恒温水槽に移し、正確に20分間インキュベートします。インキュベーション後、各サンプルから200 µLを透明な96ウェルプレートに移します。サンプルは当初は黄色であるはずですが、皮層の存在を示す還元糖が存在する場合、紫色に変化します。ここでは、多くのサンプルで目に見える紫色が見られません。しかし、250、500、および5,000 nanomoleのサンプルは、陰性対照である0 nanomoleとは視覚的に異なって見えます。プレートリーダーを用いて、585ナノメートルにおける吸光度を測定します。OD 585ナノメートルで測定した場合、標準サンプルのシグナルは線形回帰に最もよく適合します。この表は、N-アセチルグルコサミン標準品を用いた代表的な結果を示しています。これらのデータを使用して、ここに示す標準曲線を作成しました。発芽促進条件下での発芽アッセイは、100 millimolar glycineおよび10 millimolar taurocholic acidを添加した発芽バッファーを用いて行いました。非発芽条件下では、100 millimolar glycineのみを使用しました。タウロコール酸が存在しない場合、C.difficile胞子は発芽せず、溶液中のコルテックス断片の量にほとんど変化は見られません。しかし、タウロコール酸とグリシンの両方が存在すると、C.difficile胞子が発芽し、コルテックス断片が溶液中に放出されます。これは、反応サンプルのOD585が時間の経過とともに上昇することとして吸収・検出されます。本アッセイで放出された皮質断片の量は、標準曲線を用いて算出しました。このアッセイの結果に見られるように、皮質の大部分は発芽誘導剤への曝露から15分後までに加水分解または放出されました。このことは、大半の胞子がこの時間枠内で発芽したことを示唆しています。このビデオを視聴することで、細菌胞子の発芽過程における発芽液中の皮層断片または還元糖の検出方法について十分に理解できるはずです。この手順を行う際は、アッセイを正しく進行させるために、反応時間に細心の注意を払うことが重要です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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学ぶ細菌胞子発芽中の皮質断片と還元糖の比色定量法。Clostridium difficileを用いた標準的な実験プロトコルで、発芽動態を定量的に解析する手法を解説します。

細菌胞子の発芽中に皮質断片を検出

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