Name: 心筋パフォーマンスと酸素消費量の研究のための齧歯類のワーキングハートモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 学ぶ齧歯類の分離左ワーキングハートモデルによる心筋パフォーマンスと酸素消費量の制御された研究法。この手法は薬剤効果や収縮性の解析に有用です。

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ここに記載された装置および実験は、循環器科、ボストン小児病院によっておよびHaseotesファミリーからの慈善寄付によって賄われました。我々は、博士に感謝しています。フランク・マッゴーワンと華美彼のアートワークの支援のために、このモデルでは、とリンゼイ・トムソンに早期の経験を私たちに提供します。

<ol><li>Langendorff, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+am+uberlebenden+saugethierherzen+%5Binvestigations+on+the+surviving+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ges+Physiol%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen am uberlebenden saugethierherzen [investigations on the surviving mammalian heart.</a> Arch Ges Physiol. 61, 291-332 (1895).</li>
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<li>Aoyagi, T., Higa, J. K., Aoyagi, H., Yorichika, N., Shimada, B. K., Matsui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mTOR+rescues+the+detrimental+effects+of+diet-induced+obesity+in+the+heart+after+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physio.+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac mTOR rescues the detrimental effects of diet-induced obesity in the heart after ischemia-reperfusion.</a> Am J Physio. Heart Circ Physiol. 308 (12), H1530-H1539 (2015).</li>
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<li>Broadley, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+coronary+vascular+responses+to+catecholamines%2C+using+a+modified+Langendorff+heart+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">An analysis of the coronary vascular responses to catecholamines, using a modified Langendorff heart preparation.</a> Br J Pharmacol. 40 (4), 617-629 (1970).</li>
<li>Schmidt, H. D., Hoppe, H., Heidenreich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+effects+of+dopamine%2C+orciprenaline+and+norepinephrine+on+the+right+and+left+ventricle+of+isolated+canine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiol%22%5BJournal%5D)">Direct effects of dopamine, orciprenaline and norepinephrine on the right and left ventricle of isolated canine hearts.</a> Cardiol. 64 (3), 133-148 (1979).</li>
<li>Fawaz, G., Tutunjini, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+adrenaline+and+noradrenaline+on+the+metabolism+and+performance+of+the+isolated+dog+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharm+Chemother%22%5BJournal%5D)">The effect of adrenaline and noradrenaline on the metabolism and performance of the isolated dog heart.</a> Br J Pharm Chemother. 15, 389-395 (1960).</li>
<li>Allen, L. A., Fonarow, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hospital+variation+in+intravenous+inotrope+use+for+patients+hospitalized+with+heart+failure%3A+insights+from+Get+With+The+Guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Heart+Fail%22%5BJournal%5D)">Hospital variation in intravenous inotrope use for patients hospitalized with heart failure: insights from Get With The Guidelines.</a> Circ Heart Fail. 7 (2), 251-260 (2014).</li>
<li>Furnival, C. M., Linden, R. J., Snow, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inotropic+and+chronotropic+effects+of+catecholamines+on+the+dog+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The inotropic and chronotropic effects of catecholamines on the dog heart.</a> J Physiol. 214 (1), 15-28 (1971).</li>
<li>Li, J., Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+effects+of+dopamine+on+systemic+hemodynamic+status+and+oxygen+transport+in+neonates+after+the+Norwood+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Adverse effects of dopamine on systemic hemodynamic status and oxygen transport in neonates after the Norwood procedure.</a> J Am Coll Cardiol. 48 (9), 1859-1864 (2006).</li>
<li>Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+electrophysiological+variables+in+blood-perfused+and+buffer-perfused%2C+isolated%2C+working+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart.</a> Am J Physiol. 271 (2 Pt 2), H784-H789 (1996).</li>
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<li>Demmy, T. L., Magovern, G. J., Kao, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+biventricular+working+rat+heart+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Thor+Surg%22%5BJournal%5D)">Isolated biventricular working rat heart preparation.</a> Ann Thor Surg. 54 (5), 915-920 (1992).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

この作業心臓モデルは、心室プリロードおよび後負荷、灌流液の酸素張力、ならびに心拍数の完全な制御を持つ心室性能の評価を可能にします。他の要因の中でも、in vivoモデルを使用して可能ではない方法で後負荷と前負荷の独立変力薬の本質的な心筋の効果の評価を可能にします。このモデルは、晶質灌流液を利用するので、例えば、心筋のエネルギー状態の分光分析を単純化する、ヘモグロビンからの干渉なしに評価心筋を許可ことが可能であるが、このモデルでは、図14に示すように 、右心房は、我々の器具の一部としてカニューレを挿入されていませんそうするために。我々は意図的に心筋酸素消費量の評価のための冠状静脈洞の流れのサンプリングを容易にするためにそうしないことを選びました。それは共同ポンプとして重要なことは、しかし、右心はまだこのモデルでは、圧力と体積の作業を行い、ronary洞は、肺動脈カニューレに流れ込みます。いくつかの右心室プリロードを提供することは、心室中隔のポジショニングを改善し、左心室のパフォーマンスを向上させ、そしてこのモデルの重要な要素である。15 言及するには、いくつかの実験的な落とし穴があります。最初は、虚血の期間を最小にするために（2分未満で、 すなわち ）好都合に実行されるべき最初の逆行カニュレーションです。マスターへの最も重要なスキルは、上行大動脈の効率的な単離、調製及​​び取扱いです。大動脈断端が大動脈弁上記のカニュレーションのための不十分な余地を残して、過度に短くカットされないことが重要です。しかし、大動脈断端がカニューレの周りの大動脈のトルク締めが発生する可能性があり、長すぎるではないことも重要です。大動脈カニューレと大動脈根が適切にサイズを一致させたことも重要です。小さなカニューレ上の過大​​な大動脈こともできますカニューレ上の大動脈基部のトルク締めにつながります。右鎖骨下動脈は、典型的には、約7ミリメートル大動脈弁上に上行大動脈から離陸します。解剖時に腕頭容器（直径約1ミリメートル）を識別し、大動脈のトリミングは、横方向の大動脈切開用として重要なランドマークを果たします。ちょうど最初の腕頭動脈の離陸の下に大動脈をトリミングすることをお勧めします。トリミングされた大動脈基部で、この容器を含めることは、一般的に取り組んで心臓モードに移行する際に、大動脈根圧力のKHBの漏洩、損失につながります。 挿管のもう一つの技術的に困難な側面は、左心房のカニューレ挿入です。それは左心耳にカニューレを挿入することが可能であるが、我々は、カニューレが頻繁に心耳内で立ち往生し、左心房の体内に容易に通過しないことがわかりました。したがって、我々は、ほぼ、左心房の身体に切開を作ることを好みます房室溝に優れた2ミリメートル。カニューレを固定するとき薄肉アトリウムを引き裂く回避するために挿入する前に、適切な平面内の左心房のカニューレを配置することが重要です。 私たちは、左心房切開の理想的な大きさは約3mmであることがわかりました。切開の小さすぎ作成すると、左心房のカニューレの配置がより困難になる場合があり、および左心房の裂けにつながる可能性があります。私たちは、左心房ブロック上の酸素不透過性チューブ（内径2.9ミリメートル）のストレート、8ミリメートル、面取り部分を使用してください。我々は、傾斜エッジでこれではなく、カニューレを使用して、最も安定した心房カニューレ挿入を導き、左心房ブロックを確保する処理を容易にすることを見出しました。かかわらず使用するチューブの、上に示したように、チューブの端が（心房中隔または僧帽弁によって閉塞されていないことを確認することが重要である、我々は左心房圧のトレースがこのREGAに役立つことがわかりました心房カニューレのようであっても微妙な動きRD）は、大幅に左心室プリロードし、得られた血行動態測定値を変更することができます。同じ理由から、左心房、左心房ブロックを開いた後、次漏れないことを確実にするために重要です。それは関係なく、このシステム内のチューブは心臓への十分な酸素供給を確保するために、酸素不透過性であることを確実にするために使用されるチューブの種類の重要です。 手順の他の技術的に困難な側面は、圧力 - 容積（PV）カテーテルの配置でした。私たちは、最初は大動脈ブロックを通してカテーテルの逆行配置を支持しました。技術的に可能なものの、我々は尖穿刺を介してPVカテーテルを配置するためにはるかに簡単であり、好都合であることが判明しました。時間にカテーテル内または左心室の外に移動することができるようにケアは、実験期間を通してカテーテルの位置を監視するために注意しなければなりません。これはpressuを監視することによって行うことができます時間をかけて再とボリューム追跡。 最後に、注意がKHB溶液を各実験のために新鮮に作成されることを保証するために注意すべきです。 KHBの成分を秤量し、前もって粉末形態でコニカルチューブに保存することが可能です。実験の日に、これらは、滅菌濾過し、水、二酸化炭素/酸素との混合物に添加し、カルシウムと混合することができます。このようなTergazyme（または類似）などの酵素アクティブ粉末洗剤を使用してシステムを洗浄し、定期的に灌流液フィルタを交換することも重要です。 この実験準備のいくつかの制限が注意すべきです。まず、すべて晶質灌流ランゲンドルフ調製物と同様に、KHBおよびその他のasanguinous灌流液は血液に、容量の相対を運ぶ大幅に減少した酸素を持っています。これは部分的冠動脈血管拡張および超生理学的冠動脈の流れを介して補償されるが、準備が完全にphysiologiではありませんこのような理由のために、C。この機器で使用されるウインドケッセル室のほぼ無限のコンプライアンス、収縮期および拡張期の圧力が最小限にしか分離されているため、2番目、（ 図2Aを参照）、したがって、冠動脈灌流圧は、非生理的です。これは、後負荷ブロックにエラスタンス成分を組み込むことにより、将来のモデルで克服することができます。心筋傷害または機能不全を作成する可能性がある温虚血の - （3分2）第三に、すべての単離心臓標本のように、心が定義された期間を受けます。技術の実践を通して、この損傷を最小化することは代表的な結果に最も重要です。心がKHBで再灌流されるように、この効果はすぐに廃止されることが期待されるが、さらに、動物福祉のために必要なものの、吸入麻酔薬は、早期の再灌流過程における心筋抑制剤として機能することができます。 説明ワーキングハートシステムはphysiolの多種多様なことができます患者ケア、研究と教育に関連するogic調査。いくつかの付加的な変更を加えて、システムは、肺高血圧症および単心室生理機能を含む先天性心疾患に関連する重要な生理機能をシミュレートするために使用することができます。制限は、心臓の代わりに、より高い酸素含有血液のバッファによって灌流されていることをエクスビボ製剤であることが挙げられます。

分離された臓器の研究は、 生体内で可能であるものを超えた生理学的条件の制御を可能にする。 エクスビボ心臓製剤は、最初の逆行性灌流で分離されたモデルを説明したオットー・ランゲンドルフ、1によって説明されました。その後、他の人が心筋が両方の圧力と体積の作業を実行するには「働く心」モデルを、説明した。2そのような調製物は、心筋の作用メカニズム、3心筋代謝、4-6と強心薬の効果を解明に尽力してきています。7- 9 心筋の収縮性を高める薬物の使用は、重症患者では一般的です。しかし、いくつかのデータは、術後の設定での心不全の臨床徴候を有する患者のケアに有用である可能性が収縮し、心筋酸素消費量、データに対するこれらの薬剤の相対的効果を比較ご利用いただけます。10しかし、ほとんどの強心薬だけでなく、心筋だけでなく、動脈抵抗、静脈容量11、および患者の代謝率、12 ex vivoで単離された心臓モデルは上のような薬剤の効果を研究することにより、最適な手段のままに影響を与えるので、心筋適切。 私たちは、心筋機能と酸素消費量に強心薬の負荷に依存しない研究のためのex vivoモデルの使用を記載しています。 SDラットから心臓を心臓モデルを作業左心室を使用してカニューレを挿入し、変更されたクレブスヘンゼライト灌流液を用いて灌流しました。大動脈と左心房の圧力を制御しました。圧 - 容積インピーダンスカテーテルは、収縮期および拡張期機能を連続的に監視するための頂端穿刺を介して左心室に入れました。酸素消費量を連続的に左心房perfus間の酸素含有量でインデックス付きの差として測定しました。食べたと肺動脈流出液。試験される薬物は、左心房のブロックに注入し、心臓の性能および酸素代謝の変化を測定し、直前のベースラインと比較しました。

<table><tbody><tr><td>重曹</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>8.401 g/4 L</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>0.744 g/4 L</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>1.580 g/4 L</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>0.578 g/4 L</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>0.220 g/ 4 L</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>27.584 g/4 L</td></tr><tr><td>デキストロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9434</td><td>7.208 g/4 L</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>1.470 g/4 L</td></tr><tr><td>両心室ワーキングハートモデル</td><td>ハーバード装置</td><td>IH-51</td><td></td></tr><tr><td>圧力量カテーテル</td><td>Millar, Inc</td><td>SPR-944-1</td><td>6mm間隔のカテーテルを使用</td></tr><tr><td>LabChart Pro 8</td><td>ADインスツルメンツ</td><td>バージョン8.1</td><td></td></tr></tbody></table>

心筋パフォーマンスと酸素消費量の研究のための齧歯類のワーキングハートモデル

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

分離された作業心臓モデルは、生体内では達成できない方法で、負荷条件、心拍数、および投薬が心筋のパフォーマンスに及ぼす影響を理解するために使用されてきました。 例えば、変力薬は一般的にプリロードとアフターロードにも影響を与えるため、in vivoでの心筋への影響を負荷に依存しない評価ができません。 さらに、このモデルでは、全身性静脈還流による汚染なしに冠状静脈洞の流出物をサンプリングできるため、心筋の酸素消費量の評価が可能になります。 さらに、小型化された圧力容量カテーテルの出現により、収縮期と拡張期の両方のパフォーマンスのマーカーの正確な定量化が可能になりました。制御された条件下で体積と圧力の両方の作業を行いながら左心室を研究できるモデルについて説明します。
この技術では、Sprague-Dawleyラット(体重300-500g)の心臓と肺を全身麻酔下で一括して除去します。 大動脈は解剖され、酸素化されたクレブス緩衝液による逆行性灌流のためにカニューレ挿入されます。 肺動脈と静脈は結紮され、肺は製剤から取り除かれます。 次に、左心房を切開し、プリロードブロックに取り付けられた別の静脈カニューレを使用してカニューレを挿入します。 これが漏れがないと判断されると、左心臓に負荷がかかり、逆行性灌流が停止され、機能する心臓モデルが作成されます。 肺動脈は、冠状動脈の収集と心筋酸素消費量の測定のために切開され、カニューレ挿入されます。圧力容量カテーテルは、逆行性または頂端穿刺によって左心室に留置されます。 必要に応じて、心房ペーシングワイヤーを配置して、心拍数をより正確に制御できます。 このモデルでは、プリロード(左心房圧ブロックを使用)、アフターロード(アフターロードブロックを使用)、心拍数(ペーシングワイヤーを使用)、および酸素張力(灌流液内の酸素混合物を使用)を正確に制御できます。

逆行性灌流（ 図1A）で、左心室の作業心臓（ 図1B）で完全に計装心の概略図。典型的な拡張末期圧は約3であるD - - 。典型的な大動脈、左心房と左心室圧と容積トレーシングは 、 図2Aに示されているこのモデルでは5 mmHgで、ピーク収縮期圧は約100 mmHgである。図2Eは、変化を示しています。 LAカニューレは、カニューレの配置および位置決め中に離れて心房中隔から移動したときに、左心房でトレース。これらの実験では、大動脈圧が90 mmHgのに設定し、LA圧が10 mmHgのに設定しました。 カテコールアミンの効果をテストするには、（圧力 - 容積カテーテルおよび関連ソフトウェアから主に由来する）各生理学的パラメータは、直前と比較しました<html>ベースライン期間。図示の例では、ドーパミンは、左心房のブロックには15μg/ kg /分で注入しました。拡張末期圧（このモデルでは、固定心房圧与えられた）二つの条件が同一であるが、左心室拡張末期容積は2.5％減少し、左心室収縮末期容積が増加し、ストローク量を得、4.9％減少します（ 図3A）。プラセボ点滴、左心室ストロークワーク、圧力-容積曲線内の領域として同定され、ドーパミンでの処理中に32％増加した（ 図3B、P &lt;0.001、t検定、群当たりn = 10）と比較。これは、プラセボ注入に対する心筋酸素消費量（ 図3C）において大きな増加と関連していました。このようにして、別の強心薬や用量の相対的な効力およびエネルギーコストが負荷条件に対するそれらの効果を互いに独立に比較することができます。 コンテンツ &quot;FO：キープtogether.withinページ=&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54149/54149fig1.jpg" /> 図1： 逆行性灌流およびワーキングハートモードで完全計装心臓内の流れの図 （ パネルA：ランゲンドルフモード; パネルB：。。作業心臓モード逆行モードでは、KHBは大動脈ルートに設定された灌流圧で注入されます。このモードは、虚血時間や計測中に次の心筋を回復するために利用される。心臓の作業モードでは、灌流液は、冠循環を灌流する前に、左心を通って流れる。このモードでは、心筋が独自の灌流圧を生成する必要があります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54149/54149fig1large.jpg" target="_blank">ご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54149/54149fig2.jpg" /> Figure 2： ベースライン測定時に得られた代表的な圧力とボリュームトレーシング。 （A）大動脈根圧力、（B）左心房圧、（C）、左心室の圧力及び（D）は、ベースライン測定時心室容積の追跡を左に表示されています。一回拍出量、脳卒中作業、心拍出量、タウ、および他のパラメータを自動的に計算し、ソフトウェアによりリアルタイムで表示することができます。ワーキング心モードの貧しい心臓出力に関連鈍化左心房トレース（E）は、カニューレが左心房に位置異常されていることを手がかりとすることができます。うまく配置された左心房圧トレースの著名なV波が原因で完全にインストルメント動物で減少した左心房のコンプライアンスに、共通の可能性があることに注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54149/54149fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図 3： 圧力-容積曲線に対するドパミンの効果が増加行程容積を含むPV曲線（A）中左シフト、内ドーパミン輸液結果は、ベースライン測定と比較して、収縮期容積を終了減少しました。これらのPV曲線のいくつかの構成要素の形状が原因で動脈と静脈のエラスタンスの不在に（ 図4を参照）は、典型的には、 生体内で測定されたものとは異なること。（B）直前のベースラインと比較して、ストロークの作業は注入の間に有意に多くの増加に注意してくださいプラセボよりもドーパミンの（**、P = 0.0017、t検定）、心筋酸素消費をしたとして（*、P = 0.013、t検定、C）。このモデルを使用して、ベースラインでの平均心筋酸素消費量は、推定dissolvを用いて、0.22±0.02ミリモルO 2 /グラム組織/分40℃の生理食塩水で165マイクロモル/ LのEDの酸素含有量このような測定は、様々な薬の心筋酸素消費量を比較するために使用することができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54149/54149fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54149/54149fig4.jpg" /> 図4： 圧力ボリュームループの解析。示さ理論的圧-容積ループは、正常な心臓サイクルを記述し （1）、isovolemic収縮が発生した大動脈弁（AV）の閉鎖（1から2）に続いて。心室圧として心房圧未満に減少します。この段階の持続時間は、タウによって表されます。僧帽弁（MV）を心室（ - 2,3）を充填し、心房収縮と同時に開きます。収縮期はその後isovolemic contracti始まります（3 - 4）に心室圧までAVが開く時の拡張期動脈圧を超えます。 2と3 - -ストロークボリュームはライン1との間の差である。2 - - 3 - 4ストローク作業が1内の領域である。4、曲線<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54149/54149fig4large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

孤立した作業心臓モデルは、負荷条件、心拍数、および投薬が心筋のパフォーマンスと酸素消費に及ぼす影響を測定するために使用することができます。さまざまな条件下での収縮期および拡張期のパフォーマンスと酸素消費量の研究を可能にするげっ歯類の左心作業モデルの準備方法について説明します。

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

この手順の総合的な目的は、心室の負荷条件を精密に制御可能な、げっ歯類を用いた左作動心分離モデルを作製することです。この手法は、薬剤が心筋収縮力、心拍出量、および酸素消費量に及ぼす影響など、心血管生理学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の最大の利点は、心臓の負荷条件を正確に制御できることです。大動脈の剥離と単離、左心房の顆粒化、および肺静脈の単離には熟練した技術と練習が必要であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要となります。適切な鎮静、鎮痛、およびヘパリンによる抗凝固処置を行った後、ドナーラットの手術を開始します。まず、ピンセットで腹腔から皮膚を引き上げ、鋏を用いて腹腔を切開します。横隔膜の曲線に沿って肋骨の後方に辿ります。横隔膜が見えたら、ハサミを用いて、以前の切開線に合わせて横隔膜の前表面に沿って切開し、胸腔にアクセスします。各切開を両側の腋窩線に沿って腋窩まで延長します。次に、鉗子を用いて肋骨を剣状突起から前方に開いて牽引します。続いて、心膜と胸膜を切開します。横隔膜を切開すると換気機能が損なわれるため、効率的に操作を進めてください。横隔膜の直上で下大静脈と大動脈を確認し、鈍端鉗子を用いてそれらをまとめて前方に牽引します。次に、大型の曲剪を用いて、下大静脈と大動脈を迅速に切断します。上行大動脈を切断しないように注意しながら、食道、気管、腕頭動脈および静脈を頭側に向かって切断します。次に、心臓および肺とともにこれらの胸腺組織をブロック状に摘出します。心臓と肺を直ちに氷冷KHBに浸し、Langendorff装置へ移動させます。心臓・肺複合体を平皿に置き、胸腺と大血管が実験者側を向くように心臓を配置します。そして、肺の後面をテーブルに向けます。次に、胸腺の2つの葉を分け、大動脈から分岐する腕頭動脈を確認します。これで、大動脈をディッシュの縁にかけて固定します。次に、小さなはさみを用いて、大動脈弁から約5 mm上方の右鎖骨下動脈の分枝直近で大動脈を横断切除します。円形の断面が必要であるため、適切に切断されるまで繰り返し切除を行ってください。以下のビデオ顕微鏡映像では、本手順の重要な部分である、カニュレーションに向けた大動脈の剥離および切断について詳しく解説します。ここで示しているように、胸腺を中央で分割すると、簡単に分かれます。湾曲鉗子を用いて、心膜を慎重に切り開き、大動脈周囲の組織を取り除いてください。過度な力を加えないようにしてください。無名動脈の断端を確認し、大動脈を牽引するための保持点として把持します。次に、大動脈弁と鎖骨下動脈の分枝点の中点において、小型の鋭い鋏を用いて大動脈を横方向に切開します。切断部位が高すぎると、大動脈が冗長になり、カニューレを中心に心臓がねじれる原因となります。あるいは、腕頭動脈の断端からクランプ緩衝液が漏れ出す可能性があります。逆に短すぎると、カニューレの先端が大動脈弁を越えてしまう恐れがあります。次に、2組の曲鉗子を用いて、KHBをゆっくりと滴下させている大動脈カニューレの上に大動脈を誘導します。大動脈弁はカニューレの先端から1〜2 mm下に位置させる必要があります。その後、大動脈を固定するために、鉗子を大動脈に対して垂直に配置し直します。クランプを使用することも可能です。その際、助手に4-0シルク縫合糸を使用してもらい、心臓の両側でカニューレを複数の結び目で固定させます。次に、カニューレを完全に開放し、十分な逆行性大動脈血流を開始します。心臓は力強く拍動している必要があります。起こりうる失敗の一つに、大動脈カニューレの先端が大動脈弁を越えて左心室に入ってしまうことがあります。ここで示されているように、もしそうなった場合、心臓は蒼白に見え、左心房が拡張します。これは、冠血流を一時的に停止させ、大動脈カニューレ上の心臓の位置を下に修正することで、直ちに改善する必要があります。齧歯類の大動脈組織は脆弱であり、容易に裂けることに注意してください。もう一つの潜在的な落とし穴は、大動脈根部の漏出であり、これは組織の裂傷か、あるいは大動脈を高く切りすぎたために腕頭動脈からKHBが漏出することによって起こります。これは、冠血流を停止させ、大動脈カニューレから心臓を取り外して再配置することで対処できます。このステップの目的は、前負荷ブロックからのすべての圧力が左心構造に伝達される閉鎖系を構築することです。肺静脈を完全に閉塞させなかった場合、前負荷の喪失を招き、心臓標本の不安定化や結果の偽陽性を引き起こす可能性があります。大動脈カニューレを手動で回転させ、心臓の後面が術者側に向くようにします。次に、左肺に至る血管を剥離します。血管へのアクセスを容易にするため、鉗子を用いて左肺組織を吊り上げてください。次に、中型の外科用クリップを用いて、左肺動脈、肺静脈、および気管支を遮断します。続いて、クリップの末梢側で左肺を摘出します。同様の手順を右肺にも繰り返します。両肺動脈を完全に閉塞させると、右心房が拡張し、心拍数が低下（徐脈）することがあります。必要に応じて、クリップや縫合糸を追加して漏出箇所を塞ぎ、効率的に作業を進めてください。次に、肺動脈の切開を行います。大動脈カニューレを回転させて心臓の前面にアクセスし、肺動脈を特定します。小さなハサミを用いて、肺動脈弁から約3 mm上の位置に横切る切開を入れます。これにより、後のステップで肺動脈にカニューレを挿入することが可能になります。次に、左心房にカニューレを挿入します。左心房を確認し、小さなハサミを用いて、房室溝から約3 mm上の左心房体部に2〜3 mmの切開を加えます。その後、左心房カニューレを僧帽弁の平面に対して垂直に、心房中隔に向けるように配置します。温めたKHBが目に見えて流れるまで、左前方のカニューレを開きます。低体温症を防ぐため、KHBが触れて温かいことを確認してください。カニュレーションの間、KHBの流れを滴下速度に移行させます。次に、ピンセットで対抗牽引を行いながら、心房カニューレを左心房内に挿入します。心房は脆弱であるため、過度な力を加えないでください。心房壁に緊張がかからないよう、カニューレを心房の中央に配置します。次に、左心房の背面を含む心房体に4-0シルク縫合糸をかけ、カニューレを心房に固定します。必要に応じて追加の縫合を行います。密封後、カニューレを1〜2 mm引き戻し、心房中隔に接するのではなく心房の中央に位置するようにします。これは左心房の波形を確認することでチェックできます。次に、左心房に十分な前負荷を与えるために、カニューレバルブを完全に開きます。心臓からの滴下速度をモニターすることが極めて重要です。カニューレが開いている間、状態が安定している必要があります。安定していない場合は、心房をカニューレの周囲で結び直し、問題の原因と思われる漏れを塞いでください。ガス、薬剤、サイトカインなどの冠状動脈流出液中の物質を測定するには、肺動脈の切開部にフレキシブルチューブを挿入します。圧力と容量を連続的に測定するため、校正済みの圧力容量コンダクタンスカテーテルを左心室に挿入します。これは大動脈弁を介して逆行性に挿入するのが最適です。技術的に困難な場合は、心尖部から心室穿刺を行い挿入することも可能です。適切な準備のためには、DPDT maxが少なくとも3500から4000である必要があります。冠血流を時間的に定量するため、肺動脈および心臓からの冠静脈洞流出物をメスシリンダーに回収します。次に、心筋酸素消費量を算出します。最後に、逆行性大動脈ポンプを停止し、作動心モードに移行します。逆行性灌流は記載通りに準備しました。セットアップ中の初期状態では、血流は逆行性でした。逆行性ポンプを停止させると、血流が順行性に切り替わり、拍動心となります。このモデルにおける典型的な拡張末期圧は約3〜5 mmHgであり、収縮期最高血圧は約100 mmHgです。左房カニューレを心房中隔から遠ざけると、左房波形に変化が検出されます。これらの実験では、大動脈圧を90 mmHgに、左房圧を10 mmHgに設定しました。ある実験では、左房ブロックにドパミンを15 µg/kg/minで注入しました。拡張末期圧に変化はなかったが、ドパミンによって左室拡張末期容量が2.5%減少し、左室収縮末期容量が4.9%減少したため、結果として一回拍出量が増加した。プラセボ投与と比較して、圧力-容量曲線内の面積として定義される左室一回仕事量は、ドパミン治療中に32%増加した。これはまた、心筋酸素消費量の大幅な増加とも関連していた。この手法を習得すれば、適切に実施することで15分以内に完了できます。

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JoVE Journal

Biology

生物学

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