ムチンアガロースゲル電気泳動：高分子量の糖タンパク質のためのウェスタンブロッティング

この高分子糖タンパク質のウェスタンブロッティング技術の全体的な目標は、粘液が豊富なサンプルに含まれるムチンを電気泳動で分離することです。この方法は、さまざまな粘膜表面から採取された特定のムチンの相対濃度における高分子状態の調査など、ムチン生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、確立が容易で、比較的低コストで、必要な実験装置が最小限であることです。

この手順を実演するのは、私の研究室の研究専門家であるソフィア・サミールです。ゲルを準備することから実験を開始します。150ミリリットルの1x TAE 0.1%SDSバッファーを電子レンジ対応の三角フラスコに注ぎ、厚さ6ミリメートルのゲルを作り、1.2グラムのアガロース粉末を加えます。

アガロースが完全に溶解するまで、断続的に渦を巻きながらフラスコを30秒間隔で電子レンジで加熱します。アガロース溶液を最大10分間冷まします。次に、10 x 15 cmの電気泳動鋳造トレイをゲルキャスターに入れます。

アガロース溶液をゆっくりと注ぎ、コームを所定の位置に置きます。ピペットチップで形成された可能性のある気泡を取り除き、ゲルを冷まして固めるのを待ちます。ゲルが完全に固まったら、ウェルが崩壊しないようにコームをゆっくりと取り外し、トレイをゲルキャスターから取り外します。

ゲルをゲルボックスに入れ、ゲルが完全に覆われるまで電気泳動ユニットを満たします。各サンプルにローディング色素を10%添加します。ピペッティングで上下させてサンプルを均質化します。

次に、チューブを5000RPMで短時間回転させて液滴を収集します。次に、容積式ピペットを使用して、高粘度のサンプルのロードを容易にします。サンプルの80〜90%をゆっくりと吸引して、気泡がピペッティングされないようにします。

ウェルの底からゆっくりとロードし、ピペットの先端を徐々に上に動かします。ピペットチップに付着したままのサンプルの場合は、45度の角度で分注し、ウェルの真上に伸ばすか、ウェルの側面を静かに使用して糸状の粘液を破ります。粘弾性サンプルを正確にロードすることは、粘液がローディングチップに本質的に付着しているため、困難な場合があります。

また、バッファーが粘液に加える浮力により、装填された体積の全部または一部がウェルから変位する可能性があります。ゲルを80ボルトで60〜75分間、ダブルコームゲルに流して、2つの列が重ならないようにします。ゲルが適切な長さになったら、発電機の電源を切り、電極を電源から外します。

片手でキャスティングトレイの両側にゲルを慎重に取り出し、ゲルが所定の位置に留まるようにします。ゲルをガラス容器に平らに慎重に置きます。次に、ゲルを蒸留水ですすぎ、微量のTAE SDSバッファーを除去します。

ゲルをあらかじめ調製したDTT 4x SSCバッファーに浸し、ゲルを覆います。次に、ゲルを毎分10回転で静かに揺さぶります。20分間揺さぶった後、DTTフリーの4x SSCバッファーでゲルをすすぎます。

ニトロセルロースメンブレンをゲルよりわずかに広く慎重に切断することにより、転写用の真空ブロッターを準備します。多孔質マットを蒸留水で濡らし、滑らかな面を上にして吸い取り紙に置きます。多孔質マットの中央に2層のWhatmanペーパーを濡らして置きます。

ニトロセルロースメンブレンをDTTフリーの4x SSCバッファーで湿らせ、Whatman紙の上に置きます。多孔質マットをゴム製ガスケットで覆い、ガスケットの開口部をニトロセルロース膜と正確に位置合わせします。多孔質マットがまだ見える場合は、ガスケットとメンブレンの間に隙間が残らないようにメンブレンを慎重に調整します。

ニトロセルロースメンブレンをDTTフリーのSSC培地で濡らします。アガロースゲルをメンブレンの上に慎重に置きます。ゲルがガスケットと密接に密封され、ゲルのウェルが転写のためにメンブレン上に配置されていることを確認します。

タンパク質の転写中は、アガロースゲルとニトロセルロースメンブレンとの間にしっかりと密閉されていることを確認してください。ゲルをメンブレンに置いたら、ゲルを動かしたり調整したりせず、ゲルを十分に水分補給してください。気泡の形成を最小限に抑えるには、メンブレン上に4x SSCバッファーを数滴噴射し、ゲルを上から下にスライドさせて、形成された気泡を洗い流します。

ゲルを4x SSCバッファーで慎重に覆います。真空ブロッターを90分間オンにして、ムチン転写を開始します。ゲルの乾燥を防ぐために、5〜10分ごとにゲルに4x SSCバッファーを数滴加えます。

完了したら、向きのために鉛筆でウェルに印を付けます。ゲルを廃棄し、プラスチックピンセットでニトロセルロース膜を膜の端から取り出します。メンブレンを直ちに1xリン酸緩衝生理食塩水またはPBSですすいでください。

メンブレンを15ミリリットルの3%ミルクPBSブロッキングバッファーに浸し、室温でロッカーに1時間置きます。インキュベーション後、ブロッキングバッファーを廃棄します。次に、メンブレンを1%ミルクPBS一次抗体溶液に浸し、メンブレンをロッカーで摂氏4度で一晩インキュベートします。

インキュベーション後、一次抗体溶液を廃棄してください。その後、揺らしながらPBSでメンブレンを洗います。メンブレンを不透明な容器に移し、メンブレンを1%ミルクPBS二次抗体溶液に浸し、メンブレンを室温でロッカーで1時間インキュベートします。

インキュベーション後、二次抗体溶液を廃棄してください。メンブレンをPBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。最後に、メンブレンを蒸留水ですすいで塩分を取り除きます。

このウェスタンブロットは、IL-13に負荷をかけたマウスの気管支肺胞洗浄液中のMuc5acおよびMuc5bタンパク質のアップレギュレーションを、対照マウスと比較して示しています。定量分析では、アップレギュレーションはPBS処理マウスの5.1倍であったことが示されています。ムチンアガロースゲル電気泳動を使用して、DTTの濃度を増加させて処理した後のムチンポリマーのモノマーへの還元を示しました。

この手順を試みる際には、特定のムチンを研究する前に抗体の特異性を確認することを忘れないでください。薬理学的試験では、化学試薬がエピトープ認識に及ぼす影響を調べることが重要です。このビデオを見れば、粘弾性サンプルの操作方法、ムチンの高分子状態とその相対的な定量を決定する方法について十分に理解できるはずです。