麻酔ラットにおける電図および視覚誘発電位の同時記録
July 1st, 2016
このプロトコルは、麻酔をかけたラットにおける網膜電図と視覚誘発電位の同時測定を説明しています。
この手順の全体的な目標は、ラットのエレクトロレチノガムと視覚誘発電位を同時に測定することです。この方法は、亀裂神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、老化や病気の影響が視覚経路の特定の要素に影響を与えるかどうかなどです。
この技術の主な利点は、網膜機能と視覚誘発皮質機能に対するその上流の影響を包括的に評価できることです。この手順を開始するには、長さ70ミリメートルの銀線を切断し、直径8ミリメートルのループを形成してラットの目を取り囲むことにより、カスタムメイドのERG非アクティブ電極を事前に作成してください。均一な円を用意し、1mmのパイプヘッド先端にループを形作ることでループの大きさを調整します。
リングが小さすぎると不注意で内耳圧が上昇する可能性があり、リングが大きすぎると信号の変動性が増加する可能性があるため、これは重要です。次に、カスタムメイドのVEP非アクティブ電極を、長さ70mmの銀をカットして事前に製造します。そして、直径8ミリメートルの楕円を形成して、ラットの切歯に引っ掛けます。
次に、30ミリメートルの長さの銀線を切断し、直径約1〜2ミリメートルの小さなループを形成することにより、カスタムメイドのERGアクティブ電極を事前に作成し、角膜の擦り傷を最小限に抑えてラットの角膜に優しく接触させるために使用されます。その後、露出したインナーワイヤーに銀を絡ませて、電極を電極リードにしっかりと取り付けます。露出した余分な金属をマスキングテープで断熱して、光起電力アーティファクトを減らします。
ERGアクティブ電極の場合、マスキングテープの層をより多く適用して、より厚く、より剛性の高いラッピングを実現できるため、電極はマイクロマニピュレータで保持されやすくなります。各ERG非アクティブ電極に、マスキングテープに小さなフックとループファスナーを貼り付けて、げっ歯類のネックストラップに安定して取り付けられるようにします。次に、各VEPアクティブ電極について、電極リード線の内側のワイヤにワニ口クリップを取り付けます。
録音の直前に、銀線の露出面に塩化物で電気メッキを施し、信号の伝導を改善します。これを行うには、カソードをバッテリーのマイナス端子に接続し、もう一方の端を生理食塩水に浸します。その後、アノードワイヤーの銀色の先端を通常の生理食塩水に浸し、この電極ワイヤーのもう一方の端を9ボルトのバッテリーのプラス端子に接続します。
20秒後にそれらを外すと、電極ワイヤーの銀色の先端が白く均一にコーティングされます。すべての銀ERGおよびVEP電極に対して塩素化手順を繰り返します。この手順では、麻酔をかけた動物の剃毛部分を10%ポビドンヨードで3回消毒します。
メスで頭の正中線に沿って矢状切開を行い、直径20ミリメートルの真皮組織の円を切除して頭蓋骨を露出させます。次に、ガーゼでこすり落として乾燥させることにより、下にある骨膜を切除し、冠状および矢状頭蓋縫合糸を露出させます。両半球の頭蓋骨に2つの穴を開けます。
ステンレス鋼のネジを2つの既製の穴に最大1ミリメートルの深さまでねじ込み、しっかりと固定できるようにします。次に、頭蓋骨をガーゼで乾燥させ、2つの縫合糸で皮膚を引っ込めることにより、歯科用アマルガムの手術領域を準備します。次に、露出した頭蓋骨に歯科用アマルガムを広げて、ネジ電極を所定の位置に固定し、約1.5ミリメートルのネジが記録のために露出していることを確認します。
その後、リトラクション縫合糸を取り外します。暗所視記録の場合、すべての手順は暗い部屋で行われます。説明のために、電極の位置決めはここでは通常の室内照明の下で行われます。
動物は12時間前に暗順応し、ケタミンとキシラジンで麻酔をかけました。瞳孔拡張と局所麻酔の後、非アクティブなVEP電極を下の切歯の周りに引っ掛けます。次に、ファラデーケージにあるガンツフェルドボウルの前のERGプラットフォームに動物を置きます。
うなじの周りにしっかりと配置されたフックとループの留め具のストリップで動物をプラットフォームに固定します。次に、赤道の目の周りで非侵襲的にsclaralリングを囲むことにより、ERG非アクティブ電極を配置します。リンバスの約3メートル後ろ。
うなじの周りの面ファスナーストリップに電極を取り付けて、これを安定させます。反対側の目についても手順を繰り返します。次に、頭蓋骨に事前に埋め込まれたステンレス鋼のネジにワニ口クリップを取り付けて、VEPアクティブ電極を固定します。
ERGアクティブ電極を配置する前に、電極に1%カルボキシメチルセルロースナトリウムを少量滴下して、信号品質を改善します。ERGアクティブ電極を、特注の定位固定アームに取り付けられたマイクロマニピュレーターを使用して、角膜中央表面に軽く触れるように配置します。余分な水分を拭き取ることにより、カルボキシメチルセルロースナトリウムが角膜にのみ接触し、スクララには接触しないようにします。
次に、ステンレス鋼の接地針電極を2〜5ミリメートル、尾部に皮下に挿入します。プラットフォームをGanzfeldボウルに近づけてスライドさせ、動物の目がボウルの開口部と揃っていることを確認して、両方の網膜を均一に照らすことができるようにします。その後、ファラデーケージを閉じて、異音を減らします。
上記のプロトコルを使用すると、ERG波形のスタックを、最も暗いフラッシュが下部に表示され、最も明るいフラッシュが上部に表示される範囲で、さまざまな刺激に応答して記録できます。非常に暗い光レベルでは、暗所視閾値応答を記録できます。刺激の明るさが増すと、波形はB波によって支配されるようになり、次に最も明るい刺激で負のA波が現れます。
桿体視細胞の機能は、P3を使用してA波をモデル化することで評価できます。この図は、P2の振幅が刺激エネルギーの増加とともに大きくなることを示しています。桿体双極細胞の機能は、桿体P2の強度応答理論をモデル化することで、ナカ・ルシュチン機能を持つと言える。
網膜神経節細胞の機能は、薄暗い光エネルギーで評価され、pSTRピークの振幅とタイミングによって定量化されます。コーンバイポーラセル機能は、ペアフラッシュパラダイムによって誘発され、コーンP2ピーク振幅とタイミングによって定量されます。VEPの振幅解析は、トロフィーおよびトロフィーツーピーク振幅をピークとして取得され、これらの応答のタイミングが得られます。
VEP波の振幅は、刺激エネルギーの増加とともに増加します。習得すると、このテクニックは、電極の準備と電極の配置、および適応の時間を除いて、約30〜45分以内に行うことができます。この手順を試行する際には、電極をどれだけ正確に配置し、適応に十分な時間を確保するかに注意を払うことが特に重要です。
この手順に続いて、特定の質問に答えるために、疾患修飾や治療などの他の手順を実行できます。このビデオを見れば、電極の準備と配置の方法、ERGとVEPの波形の記録と分析の方法について十分に理解できるはずです。
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概要
このプロトコルは、麻酔下のラットにおける電気網膜図と視覚誘発電位の同時測定を説明しています。この方法は、特に老化や疾患が視覚経路に与える影響に関する、裂隙神経科学分野の主要な質問に答えるのに役立ちます。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 電気生理学
- 視覚処理
背景
- 電気網膜図（ERG）は網膜機能を測定します。
- 視覚誘発電位（VEP）は皮質視覚処理を評価します。
- 視覚経路の成分の理解は神経科学研究にとって重要です。
- 年齢と疾患は視覚機能に影響を与える可能性があります。
研究の目的
- ラットでERGとVEPを同時に測定すること。
- 老化と疾患が視覚経路に与える影響を評価すること。
- 網膜機能と皮質機能の包括的な評価を提供すること。
使用される方法
- 銀線を使用したカスタムERG電極の準備。
- ラットの目の周りの電極配置。
- ERGとVEP信号の同時記録。
- 視覚機能を評価するためのデータ分析。
主な結果
- 麻酔下のラットにおけるERGとVEPの成功的な測定。
- 老化や疾患による視覚経路成分の変化の特定。
- 包括的な視覚評価のためのこの方法の有効性の実証。
- 視覚処理における網膜と皮質の相互作用に関する洞察。
結論
- この技術により、動物モデルにおける視覚機能の詳細な研究が可能になります。
- これは、様々な要因が視覚経路に与える影響を解明するのに役立ちます。
- さらなる研究により、健康と疾患における視覚処理の理解を深めることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Simultaneous ERG and VEP recording enables comprehensive assessment of retinal-to-cortical visual pathway integrity in preclinical models. This dual-modality approach supports mechanistic de-risking by linking retinal dysfunction to upstream cortical effects, informing target validation in neurodegenerative and ophthalmic disease research. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing quantitative, translatable electrophysiological readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating retinal electrophysiological changes with cortical visual processing deficits.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous measurement of retinal and visual pathway responses to light stimulation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that modulate specific visual pathway components (e.g., rod bipolar, retinal ganglion cell function).
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline retinal and cortical electrophysiological profiles.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs (e.g., P2 amplitude, pSTR peak) for reliable compound screening.
- Scalability: Facilitates platform reuse across disease models due to consistent electrode preparation and signal acquisition protocols.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains translational continuity by assessing disease-relevant visual pathway alterations from retina to cortex.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through amplitude and timing analysis of ERG and VEP waveforms.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether retinal changes drive cortical dysfunction or occur independently, reducing false positives in target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, providing electrophysiological biomarkers of visual pathway integrity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how genetic or pharmacological manipulations affect retinal neuronal and glial cell class responses.
- Screening: Enables assay readiness via stable, low-noise signal acquisition after electrode chloridation and proper dark adaptation.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (ERG A/B waves, VEP peak-to-peak amplitude) for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by modeling retinal ganglion and cone bipolar cell function using established intensity-response paradigms.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable capability for chronic studies due to stable electrode implantation and standardized recording parameters.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing retinal versus cortical contributions to visual deficits.
- Operational Value: Ensures standardization through detailed electrode preparation (silver wire chloridation, loop sizing) and placement protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target modulation to functional visual pathway outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on dose-responsive changes in scotopic threshold responses and VEP amplitude.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, microsurgery, and electrode fabrication for stable signal acquisition.
- Depends on instrumentation including Ganzfeld stimulator, Faraday cage, micro-manipulator, and differential amplifiers.
- Necessitates cross-team standardization of dark adaptation protocols and stimulus intensity ranges for reproducible data.
- Involves adaptation considerations across rodent strains and anesthesia regimens affecting pupil dilation and corneal sensitivity.
- Practical limitations include signal variability from improper electrode sizing or inadequate chloridation, as noted in the protocol.
