免疫組織化学および免疫蛍光分析のための腸組織の調製のための改良されたスイス・ローリングテクニック
2016年7月13日
腸の粘膜内層に沿って上皮細胞の正確な同定と位置が異なる細胞系譜を定義することが不可欠です。腸組織の適切な画像化は、最大解像度でのタンパク質発現パターンの同定のために重要です。本研究では、マウスの腸組織を処理するための最適な方法および条件を線引きすることを目指しています。
この技術の全体的な目標は、マウス腸組織の長い切片を効率的に処理し、その長さに沿って組織学的染色を均一にすることです。腸切片を得るためには、腸の全長に沿った染色にばらつきがあり得る。私は標準的なスイスのローリング技術を利用してみましたが、腸組織が非常に硬く、開きにくいことがわかりました。
いくつかの実験で、私は毒性の少ない化学物質を使用し、腸組織のスイスのローリングをはるかに改善できる迅速な固定方法を思いつきました。修飾された固定剤は、他の厚い組織を迅速に固定するために使用できます。準備として、テキストプロトコルに従って試験動物を安楽死させ、手術環境を準備します。
まず、解剖鉗子とハサミを使用して、マウスのサイズに応じて胸郭の約1〜2センチ下の腹部の中央に横方向の切開を行います。次に、皮膚をそっと引き離して切り取り、腹部の筋肉を露出させます。次に、腸をつかんだり引っ張ったりせずに、筋肉をつかんで引き上げます。
次に、腹筋を慎重に切開し、慎重に切り込みを入れて腸を露出させます。次に、結腸を特定し、直腸と結合する遠位端まで追跡します。次に、はさみを使用して、結腸をできるだけ肛門の開口部の近くで横断します。
次に、胃が小腸と結合する場所を見つけ、はさみを使用して胃から腸を約1センチ切り取ります。次に、遊離小腸と結腸の全長をPBSを含むきれいなシャーレに移します。次に、結腸の遠位端を固定し、結腸の全長をゆっくりと解き、付着した腸間膜組織を取り除きます。
次に、盲腸を特定し、盲腸が結腸に結合する腸を横断して、結腸を分離します。同様に、付着した腸間膜結合組織と脂肪組織から小腸の残りの部分を解きほぐします。次に、盲腸と結合するところで小腸を横断します。
その後、盲腸を取り除き、廃棄することができます。次に、10ミリリットルの注射器に改変されたブアンの固定剤を充填し、強制針を取り付けます。針を腸の前方開口部に約半センチメートル挿入します。
強制針をセグメント内にしっかりと固定しながら、固定剤で組織内容物をゆっくりと洗い流します。圧力がかかりすぎるとセグメントが破裂するので注意してください。小腸が長すぎて扱えないように見える場合は、最初に小腸を3つの等しいセグメントに切り、各セグメントを別々にフラッシュすることをお勧めします。
固定すると、腸の部分の色が不透明になります。次に、はさみを使用して、セグメントを腸間膜線に沿って縦方向に切断し、次に鉗子で開いたままPBSの皿でセグメントを短時間すすぎます。次に、小腸を近位、中部、遠位の3つの等しいセグメントに切り取り、これらは十二指腸、空腸、回腸にほぼ対応します。
巨視的には、各セクションに識別できる特徴はありません。各セグメントの遠位端から近位を識別するためのマークを必ず作成してください。次に、ルーメンナル側を上に向けてセグメントをシャーレの蓋に置きます。
結腸セグメントで、近位端でその幅を横切る隆起によって内腔側を特定します。中央部と遠位部には、縦方向に走る斑入りがいくつかあります。小腸では、絨毛をマークする粗い表面で内腔側を特定します。
顕微鏡検査では、絨毛は各セグメントの近位領域で最も長く、結腸陰窩は近位領域で最も短く、中央部で最も高いことが示されています。コロンのスイスローリングを進めます。結腸を平らに開き、内腔側を上にして、鉗子で近位端からペトリ皿の端に向かって引っ張ります。
内腔側を上にして、近位端を鉗子で保持し、近位端の端をつまようじで包み、包んだ端をつまようじにしっかりとつまみます。次に、つまようじの周りでコロンをゆっくりと転がして、スイスロールを形成します。結腸全体の長さが巻き上げられたら、別の鉗子を使用して、ロールを組織処理カセットに慎重にスライドさせます。
次に、カセットを10%緩衝ホルマリンに移し、室温で一晩インキュベートします。小腸の一部をスイスロールするには、内腔側を上にして開き、鉗子で近位端から皿の端に向かって引っ張ります。次に、コロンで示されているのと同じ手法を使用して、スイスロールを作成し、ホルマリンで固定します。
上記の方法を用いて、C57 black 6マウスの大腸のHND染色により、包括的な組織学的評価のための結腸の全部分が明らかになりました。次に、この調製物を、周辺腸管でのみ活性を持つLGR5プロモーターによって駆動されるEGFPを発現するマウスに用いました。このEGFP導入遺伝子の浸透度は約5〜10%しかありませんが、関心領域は簡単に見つけることができます。
EGFP LGR5発現を有する同じマウスを用いて、KLF5およびKI67を染色した。まず、LGR5の発現が正常な対照マウスを研究しました。EGFP陽性細胞は青色矢印で、EGFP陰性細胞は白色矢印でマークされています。
次に、同じ導入遺伝子をKLF5ノックアウトマウスで発現させました。KLF5とKI67の共染色は、EGFP陽性幹細胞には見られませんが、EGFP陰性陰茎細胞には残っています。明らかに、マルチフルオロフォース染色の調製物の品質は非常に良好です。
一度習得すると、この技術は、小腸と結腸の両方を収集している場合、マウスあたり約15分で行うことができます。ブアンの固定剤の使用は、目に非常に危険を及ぼす可能性があることを忘れないでください。この手順を実行するときは、常に適切な目の保護などの予防措置を講じる必要があります。
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概要
本研究では、均一な組織学的染色を実現するためのマウス腸管組織の効率的な処理に焦点を当てています。ここでは、イメージングおよび解析に向けた組織サンプルの品質を向上させるための、適切な固定法の重要性について解説します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 組織学
- 組織処理
背景
- 上皮細胞を正確に同定することは、細胞系譜を定義する上で極めて重要です。
- 腸管組織のイメージングには、最適な処理方法が必要です。
- 染色性に腸管の部位によるばらつきが生じることがあります。
- 標準的な手法では組織が硬くなり、解析を困難にする場合があります。
研究目的
- マウス腸管組織を処理するための最適手法を明確にする。
- 組織学的染色の均一性を向上させる。
- より低毒性の化学物質を用いた固定法を開発する。
使用した手法
- 改良版スイスロール法の活用。
- 迅速固定法の検討。
- 組織採取のための手術環境の準備。
- 厚い組織への改良固定液の適用。
主な結果
- 改良された固定法により、腸管組織のより良好なスイスロール法による巻き込みが可能になります。
- 毒性の低い化学薬品の使用により、固定プロセスの安全性が向上します。
- 新しい方法を用いることで、均一な組織学的染色を達成できます。
- この技術は、他の厚い組織にも適用可能です。
結論
- 固定法の改善により、組織学における組織処理の効率が向上します。
- 正確なイメージングと解析には、効率的な手法が不可欠です。
- さらなる研究により、これらの技術の応用範囲を広げることができます。
よくある質問
産業界における有用性
腸管組織を効率的に処理することで、臓器全体の長さにわたって一貫した組織学的評価が可能となり、炎症や腫瘍形成の定量的な分析をサポートします。改良されたスイロール法（Swiss-rolling technique）は、組織形態の保存性を高め、信頼性の高い免疫組織化学的および免疫蛍光的な検出を容易にします。この手法は、サンプル調製におけるばらつきを抑えることで、前臨床モデルにおける予測の信頼性を向上させます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的活用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 腸上皮の恒常性、および傷害と再生への反応の解析を可能にします。
- 実用的価値： 腸管全層切片の組織学的評価を改善することで、機能的なターゲットバリデーションをサポートします。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： セクショニング後も腸の構造的特徴が維持されていることを確認し、後続のワークフローに向けた検証済み生物学的システムを準備します。
- 運用の価値： 組織の長さに沿って均一な組織学的染色を行うことで、アッセイの標準化と再現性の課題を解決します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：定量測定に不可欠な腸管の構造的特徴の分化を可能にすることで、疾患に関連するシステムの解析を支援します。
- 運用の価値：免疫組織化学的および免疫蛍光検出法を用いた堅牢な処理により、トランスレーショナルバイオマーカーの整合性を向上させます。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、組織学的解析に向けた組織処理を改善することで創薬生物学のワークフローに組み込まれ、前臨床モデルにおける信頼性の高い化合物評価を通じてリード化合物の同定を支援します。
- 発見生物学：腸管上皮の形態評価を可能にすることで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：免疫組織化学的および免疫蛍光分析による定量的な出力により、アッセイの準備状況を記述します。
- 分析：組織全長の腸管炎症および腫瘍形成の測定を強調します。
- トランスレーショナルリサーチ：疾患関連システムとバイオマーカーの整合性を通じて、前臨床段階への継続性を繋げます。
- エンタープライズ再利用：本手法を、腸管サンプル以外の厚い組織の処理に再利用可能な機能として定義します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 腸組織解析におけるメカニズム的な曖昧さを低減することで、予測の信頼性を向上させる。
- 運用の価値： 組織処理ワークフローの標準化、再現性、および拡張性の確保。
- 戦略的価値： ターゲットバリデーションの改善と、後期の生物学的リスクの低減による、より適切なgo/no-go判断の実現。
- ポートフォリオへの影響： 前臨床モデルの信頼性向上による、リスク調整後の優先順位付け。
実施上の検討事項
- 組織学および組織処理技術に関する専門的な科学的知見が必要です。
- 固定、包埋、および切片作成のための機器および分析インフラストラクチャが必要です。
- 一貫したスイスロール法（Swiss-rolling）の実施に向けた、チーム間での標準化要件があります。
- 改良ブアン固定液（modified Bouin's fixative）を使用する際の、モデルシステム間の適応に関する検討事項があります。
- 実務上の制限として、適切な目の保護具を必要とする有害化学物質の取り扱いが含まれます。
