Name: のサブタイピングカンピロバクター・ジェジュニ SSP。 doylei質量分析ベースのPhyloProteomics（MSPP）を使用して分離株 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 学ぶ質量分析ベースのファイロプロテオミクス（MSPP）を用いたCampylobacter jejuni ssp. doyleiのサブタイピング手法。迅速かつ低コストで菌株レベルの関連性を解析し、薬剤耐性や病原性の予測に応用可能です。

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優れた技術サポートを提供してくださったHannah Kleinschmidt氏に感謝します。この論文は、Deutsche Forschungsgemeinschaftのオープンアクセス支援プログラムとゲオルク・アウグスト大学のゲッティンゲン大学の出版基金から資金提供を受けました。

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<li>Novais, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+mass+spectrometry+as+a+tool+for+the+discrimination+of+high-risk+Escherichia+coli+clones+from+phylogenetic+groups+B2+%28ST131%29+and+D+%28ST69%2C+ST405%2C+ST393%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for the discrimination of high-risk Escherichia coli clones from phylogenetic groups B2 (ST131) and D (ST69, ST405, ST393).</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2014).</li>
<li>Matsumura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+extended-spectrum-beta-lactamase-producing+Escherichia+coli+ST131+and+ST405+clonal+groups+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal groups by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry.</a> J Clin Microbiol. 52 (4), 1034-1040 (2014).</li>
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<li>Verroken, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization-Time+of+Flight+Mass+Spectrometry+for+Identification+of+Nocardia+Species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clinl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Nocardia Species.</a> J Clinl Microbiol. 48 (11), 4015-4021 (2010).</li>
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<li>Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+analysis+of+Rhodococcus+erythropolis+based+on+the+variation+of+ribosomal+proteins+as+observed+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-mass+spectrometry+without+using+genome+information%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information.</a> J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).</li>
<li>Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+on-target+lysis+%28YOTL%29%2C+a+procedure+for+making+auxiliary+mass+spectrum+data+sets+for+clinical+routine+identification+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts.</a> J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).</li>
<li>Stark, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+profiling+of+Bacillus+cereus+strains+and+quantitation+of+the+emetic+toxin+cereulide+by+means+of+stable+isotope+dilution+analysis+and+HEp-2+bioassay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay.</a> Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

MSPPスキームの確立に最も重要なステップは、バイオマーカーイオンアイデンティティの明確な遺伝的決意です。それは間違いなくバイオマーカーを同定することが可能でない場合、それはスキーム13から除外されるべきです。 C.ジェジュニ SSP。doylei方式は、14の異なるバイオマーカーイオンを含んでいます。これらは、5以下Cに比較され、検出可能なCの間ジェジュニ SSP。 ジェジュニ MSPPスキーム13【選択最も大きな違いジェジュニ SSP。 ジェジュニとC.ジェジュニ SSP。doyleiバイオマーカーは、L31（-M）およびL35（-M）13の場合のアミノ末端メチオニンの翻訳後除去しました。 試験Cに示すようにジェジュニ <e...

過去十年間の間に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF MS）は、臨床微生物学1,2における微生物の属および種の同定のための非常に価値の標準的な方法であることが進んでいます。種の同定は、無傷細胞または細胞溶解物の小タンパク質フィンガープリントの記録に基づいています。日常的な臨床微生物学で使用される質量分析計のための典型的な質量範囲は2-20 kDaです。さらに、得られたスペクトルは、以下の種と下記亜種のレベル3での株を識別するために使用することができます。初期の先駆的な研究では、 カンピロバクター・ジェジュニ 4株の特定のサブグループ、 クロストリジウム・ディフィシル 5、 サルモネラ菌の SSPの特定のバイオマーカーイオンを同定しました。エンテリカ血清型チフス 6、 黄色ブドウ球菌 7から9、およびE12 - scherichiaは10コリ 。 対立遺伝子のアイソフォームに対応するいくつかの変数バイオマーカーの質量の組み合わせは、より深いサブタイプのオプションを提供しています。以前は、我々が正常にCに質量分析ベースphyloproteomics（MSPP）と呼ば有意義かつ再現性のphyloproteomic関係に質量プロフィールにおけるこれらの変化に変換する方法を実装しましたジェジュニ SSP。 ジェジュニ分離株のコレクション13。 MSPPは、多座配列タイピング（MLST）のようなDNA配列に基づくサブタイピング技術と質量分析と同等に使用することができます。 カンピロバクター種は、世界中で、細菌性胃腸炎14、15の主要な原因です。カンピロバクター感染後後遺症の結果として、すなわち、ギラン・バレー症候群、反応性関節炎および炎症性腸疾患は、16を生じる可能性があります。感染症の主な供給源であります鶏、七面鳥、豚、牛、羊、アヒル、牛乳と表面水15、17からの汚染された家畜の肉。したがって、食品の安全性の文脈における定期的な疫学的サーベイランス研究が必要です。 MLSTは、 カンピロバクター種18のための分子タイピングの「ゴールドスタンダード」です。サンガーシーケンシングベースのMLST法は、労働集約的であるため、時間がかかり、比較的高価な、MLSTタイピングは、比較的小さな分離株コホートに制限されています。したがって、安価で高速サブタイピング方法に対する必要性が存在します。この必要性は、MSPPのような質量分析法によって満たされる可能性があります。 本論文では、分離株doylei。 カンピロバクター SSPのコレクションを使用してMSPPタイピングのための詳細なプロトコルを提示し、MLSTとその可能性の比較。

<table><tbody><tr><td>アセトニトリル</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Autoflex III TOF/TOF 200 system</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td><td>GT02554 G201</td><td>質量分析計</td></tr><tr><td>細菌試験標準 BTS</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td><td>604537</td><td></td></tr><tr><td>BioTools 3.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td><td>263564</td><td>Software Package</td></tr><tr><td>ブルカーIVDバクテリアルテストスタンダード</td><td>ブルカーダルトニクス、ブレーメン、ドイツ</td><td>8290190</td><td>5 tubes</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>ベルギーの微生物のコーディネートコレクション/微生物学研究所 UGent BCCM/LMG ゲント、ベルギー</td><td>LMG8843</td><td>ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;株 093</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni亜種 doylei 分離株&nbsp;</td><td>ベルギー Coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td><td>LMG9143</td><td>Goossens Z90</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>ベルギーの微生物のコーディネートコレクション/微生物学研究所 UGent BCCM/LMG ゲント、ベルギー</td><td>LMG7790</td><td>ATCC 49350;CCUG 18265;カスパー71;LMG8219;NCTC 11847</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei アイソレート&nbsp;</td><td>ベルギー 微生物学研究所 UGent BCCM/LMG ゲント、ベルギー</td><td>LMG9243</td><td>Goossens N130</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>ベルギー 微生物のコーディネートコレクション/微生物学研究所 UGent BCCM/LMG ゲント、ベルギー</td><td>LMG8871</td><td>NCTC A603/87</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>ベルギー 微生物学研究所 UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td><td>LMG9255</td><td>Goossens B538</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>ベルギーの微生物のコーディネートコレクション/微生物学研究所 UGent BCCM/LMG ゲント、ベルギー</td><td>LMG8870</td><td>NCTC A613/87</td></tr><tr><td>コロンビア寒天基地&nbsp;</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1.10455 .0500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Compass for FlexSeries 1.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td><td>251419</td><td>Software Package</td></tr><tr><td>defibrinated sheep blood&nbsp;</td><td>Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany</td><td>SR0051</td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>02854 Fluka</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>HCCA matrix</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td><td>604531</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes paper tissue</td><td>Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td></td><td></td>Z188956</tr><tr><td>MALDI Biotyper 2.0</td><td>Bruker Daltonics, ブレーメン, ドイツ</td><td>259935</td><td>ソフトウェアパッケージ</td></tr><tr><td>マスト Cryobank バイアル</td><td>Mast Diagnostica, Reinfeld, Germany</td><td>CRYO/B</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 polished steel target</td><td>Bruker Daltonics, ブレーメン, ドイツ</td><td>224989</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen、ヒルデン、ドイツ</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトインスリン</td><td>Sigma-Aldrich、タウフキルヒェン、ドイツ</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸</td><td>Sigma-Aldrich、タウフキルヒェン、ドイツ</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>水、分子生物学グレード</td><td>Sigma-Aldrich、タウフキルヒェン、ドイツ</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

のサブタイピング<em&gt;カンピロバクター・ジェジュニ</em&gt; ssp。<em&gt; doylei</em&gt;質量分析ベースのphyloproteomics（mspp）を使用して分離株

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF MSは、ひずみレベルで、種や亜種のレベルではなくても、以下にするだけでなく、いくつかの細菌を区別する可能性を提供しています。検出可能なバイオマーカーイオンの対立遺伝子のアイソフォームを単離固有の質量シフトをもたらします。質量分析ベースのphyloproteomics（MSPP）ゲノムと比較して、分離株、特定の質量シフトからphyloproteomic関係の控除は、参照株の配列決定を可能にする方式では、質量分析検出可能なバイオマーカーの質量を組み合わせた新規な技術です。推定アミノ酸配列は、その後、MSPPベースの樹状図を計算するために使用されます。 ここでは、 カンピロバクター・ジェジュニの SSPを入力してMSPPのワークフローを説明します。doyleiは 7株のコレクションを分離します。すべての7株は、それらの遺伝的多様性を実証したヒト由来と多座配列タイピング（MLST）でした。 MSPPタイピングは、十分にそのPHYを反映して、7つの異なるMSPPシーケンスの種類をもたらしましたlogenetic関係。 C.ジェジュニ SSP。doylei MSPP方式は、14の異なるバイオマーカーイオン、2〜11キロダルトンの質量範囲内の大部分はリボソームタンパク質を含んでいます。 MSPPは、原則として、拡張質量範囲を有する他の質量分析プラットフォームに適合させることができます。従って、この技術は、ひずみレベル微生物タイピングのための有用なツールになる可能性があります。

以前は、我々が正常にCのMSPPスキームを確立しますジェジュニ SSP。 ジェジュニ 13。ここでは、兄弟の亜種Cにメソッドを拡張することを目的としましたジェジュニ SSP。doylei。この特定の設定では、7 C.ジェジュニ SSP。doylei分離株は、微生物/微生物学UGent BCCM / LMGゲント、ベルギーの研究室のベルギーのコレクションから取得しました。私たちの分析に使用されるすべての7分離株は、ヒト由来のものでした。元々下痢と2歳のオーストラリア人の子供の糞便から単離されたゲノム配列を決定菌株ATCC 49349（LMG 8843）は、参照を務めました。コレクションから、6つの追加の株が利用可能であった：LMG 9143、LMG 9243、およびLMG 9255は、子供の下痢に苦しんで、ブリュッセル、ベルギーに住んでいるの糞便から分離されました。ドイツからの個々の胃生検試料から単離されたLM...

質量分析ベースのphyloproteomics（MSPP）は、 カンピロバクター・ジェジュニ SSPのコレクションを入力するために使用された。doylei多座配列タイピング（MLST）と比較して、歪みレベルで分離します。

のサブタイピング<em&gt;カンピロバクター・ジェジュニ</em&gt; SSP。<em&gt; doylei</em&gt;質量分析ベースのPhyloProteomics（MSPP）を使用して分離株

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

MSPP（質量分析ベースの系統プロテオミクス：Mass Spectrometry-based PhyloProteomics）と呼ばれるこの質量分析法の全体的な目的は、細菌を株レベルでサブタイピングすることです。この手法は、微生物学、疫学、および衛生学の分野における重要な疑問に答えるために活用できます。例えば、系統プロテオミクス的な親縁性を可視化することで、アウトブレイク状況の解析に利用することが可能です。他のタイピング法と比較して、MSPPはサンプルあたりのコストが安く、非常に迅速です。院内感染は重要性が増している課題であり、我々のMSPPスキームが他の細菌や、さらには真菌の疫学的タイピングへと応用されることを期待しています。我々のMSPPスキームは株間の親縁性に関する知見を提供するため、薬剤耐性や病原性といった関連表現型の予測において、これらの表現型が特定の遺伝子型と相関する場合に本手法を適用することは理にかなっています。この手順を開始するために、2.5 mgのHCCAを250 µLの有機溶媒混合液（50%イソニトリル、47.5%二回蒸留水、2.5%トリフルオロ酢酸）に溶解し、マトリックス溶液を2本のチューブに準備します。そのうちの1本に、内部標準としてリコンビナントヒトインスリンを加えます。次に、参照株のコロニーをピンヘッド分量、MALDIターゲットプレート上に直接塗布します。キャリブレーションピークの正確な質量を決定するために、別の箇所にテスト標準品を1 µL点滴します。細菌および標準品の各スポットの上に、HCCAを添加したマトリックス溶液を1 µLずつ載せ、室温で結晶化させます。解析する各菌株について、この塗抹調製を繰り返します。各スポットに1 µLの添加済みHCCAマトリックス溶液を重ね、室温で結晶化させます。あるいは、定着が困難な細胞からタンパク質を抽出することも可能です。この場合、白金線を用いてアガープレート培養から約5つのコロニーを回収してください。1.5 mL反応チューブ内で、それらを300 µLの二回蒸留水に懸濁させ、細菌コロニーが完全に懸濁するまでピペッティングを繰り返して十分に混合します。次に、900 µLの無水エタノールを加えて混合します。サンプルを13,000 gで1分間遠心分離します。ペレットを乾燥させた後、50 µLの70%ギ酸を加え、ピペッティングにより再懸濁させます。次に、50 µLのアセトニトリルを加えて混合します。13,000 gで2分間遠心分離し、デブリを除去します。完了後、1 µLのスーパーネームをMALDIターゲットプレートのサンプル位置に転写します。サンプルを乾燥させた後、各スポットに1 µLのHCCAマトリックス溶液を上乗せし、室温で結晶化させます。この時点で、各スポットについて100ショットステップで60

subtyping-campylobacter-jejuni-ssp-doylei-isolates-using-mass

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

キャプチャ化合物は、光架橋および精製に続いて​​機能的な可逆小分子 -...

メチルトランスフェラーゼのプロファイリングおよびその他の S -アデノシル- L</subキャプチャの複合質量分析法（CCMS）別> -ホモシステイン結合タンパク質

マススペクトロメトリー（APMS）との組み合わせでタグ付けされたタンパク質のアフィニティー精製は、タンパク質相互作用ネットワークの体系的マッピングのため、生物学的プロセスの基本メカニズムを調査するための強力な方法です。ここでは、細菌のために開発最適化された順次ペプチドアフィニティー（SPA）をAPMSの手順を説明...

のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

正確に高分解能質量分析計を接続した液体クロマトグラフィーによる定圧ラベリング、広範な分別、バイオインフォマティクス...

定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

ここでアセンブリと biolayer 干渉計 (結合) による炭疽菌毒素の分解を監視するためのプロトコルを提案する.次のアセンブリ/分解バイオ...

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオ センサーから解放

カンピロバクターの便培養は不正確ですが、依然として識別のためのゴールドスタンダードと考えられています。ヒト便中のC.セジュニの輸送媒体における検出および生存の限界を決定する方法が、より良い精度で新しい免疫アッセイと比較される。...

ヒト胎児標本におけるカンピロバクター・イェジュニの輸送培地における検出と生存の限界を決定する培養方法

タンパク質アルギニン(R)-メチル化は、複数の生物学的経路を調節する広範な翻訳後修飾です。質量分析は、修飾ペプチド濃縮のための生化学的アプローチと組み合わせると、R-メチルプロテオームをグローバルにプロファイリングするための最良の技術です。ここでは、ヒト細胞における全体的なR-メチル化を高信頼で同定するために設計されたワークフローについて説明します。...

質量分析に基づくプロテオミクスアプローチによるグローバルで信頼性の高いタンパク質R-メチル化分析

ここでは、MALDI-TOF-TOFタンデム質量分析法を用いて、ゲノム的に配列された病原性細菌によって産生されるタンパク質を迅速に同定するためのプロトコルを、社内で開発したソフトウェアを用いて提示する。アスパラギン酸効果とこの特異性のために、メタスタブルタンパク質イオン断片は、タンパク質同定のために利用されます。...

MALDI-TOF-TOF-MS/MSとトップダウンプロテオミクス解析を用いた 、大腸菌 における抗菌性免疫タンパク質の同定

ベンチトップ機器を使用した全ゲノムシーケンス(WGS)戦略の実現可能性により、ラボ環境での公衆衛生に関連するすべての微生物のゲノム調査が簡素化されました。細菌WGSのワークフローの方法論的適応について説明し、分析のためのバイオインフォマティクスパイプラインも提示します。...

オレオクロミス属由来の病原性大腸菌株のキャラクタリゼーション 全ゲノムシーケンシングを使用する農場

カンピロバクター は、世界中の細菌性食品媒介性胃腸炎の主な原因です。施設が施設全体の蔓延を減らすための対策を講じているにもかかわらず、汚染された製品は一貫して消費者に届いています。過去12年間に開発されたこの技術は、生肉から カンピロバクター...

生肉からの カンピロバクター 属菌の検出と分離

このプロトコルは、カルチュロミクスとMALDI-TOF MSを組み合わせることで、乳製品中の微生物組成を迅速かつ費用対効果の高い評価を可能にします。従来の培養法よりも短いターンアラウンドタイムで、16S rRNAシーケンシングに匹敵する分類結果を提供します。...

MALDIアプローチ による 細菌プロテオミクスプロファイリングを用いた酪農の微生物安全性の評価

学ぶ質量分析ベースのファイロプロテオミクス（MSPP）を用いたCampylobacter jejuni ssp. doyleiのサブタイピング手法。迅速かつ低コストで菌株レベルの関連性を解析し、薬剤耐性や病原性の予測に応用可能です。

のサブタイピング

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