のサブタイピングカンピロバクター・ジェジュニ SSP。 doylei質量分析ベースのPhyloProteomics（MSPP）を使用して分離株

この質量分析法の全体的な目標は、MSPPまたはMass Spectrometry-based PhyloProteomicsと呼ばれ、菌株レベルで細菌をサブタイプ化することです。この方法は、微生物学、疫学、衛生学の分野における重要な質問に答えるために使用できます。例えば、系統学的な関連性を可視化することで、アウトブレイクの状況を分析するために使用することができます。

他のタイピング方法と比較して、MSPPはサンプルあたり安価で、非常に高速です。院内感染はますます重要性を増している問題であり、私たちのMSPPスキームが他の細菌や真菌の疫学的タイピングにまで拡大できることを願っています。当社のMSPPスキームは、株の関連性に関する洞察を提供するため、薬剤耐性や病原性などの関連する表現型の予測には、これらの表現型が特定の遺伝子型と相関する場合にそれを適用することは理にかなっています。

この手順を開始するには、2.5ミリグラムのHCCAを250マイクロリットルの有機溶媒混合物(50%イソニトリル)に溶解して、2本のチューブのマトリックス溶液を調製します。それらの1つに内部較正剤として組換えヒトインスリンを追加し、次に47.5%の二重蒸留水と2.5%のトリフルオロ酢酸を加えます。次に、参照株からピンヘッドサイズのコロニーをマルディターゲットプレートに直接広げます。

キャリブレーションピークの正確な質量を決定するには、マイクロリットルの試験標準を別の場所に置きます。細菌と標準の各スポットに1マイクロリットルのHCCAスパイクマトリックス溶液を重ね合わせ、室温で結晶化させます。分析する各菌株について、塗抹標本の準備を繰り返します。

各スポットに1マイクロリットルのスパイクHCCAマトリックス溶液を重ね、室温で結晶化させます。あるいは、嘘をつきにくい細胞からタンパク質を抽出することもできます。このためには、接種ループを備えた寒天プレート培養物から約5コロニーを収穫します。

1.5ミリリットルの反応チューブに300マイクロリットルの二重蒸留水で懸濁し、細菌のコロニーが完全に懸濁するまでピペッティングを繰り返して十分に混合します。次に、900マイクロリットルの無水エタノールを加えて混ぜます。サンプルを13, 000 gで1分間遠心分離します。

ペレットを乾燥させた後、70%ギ酸の50マイクロリットルでピペッティングして再度懸濁します。次に、50マイクロリットルのアセトニトリルを加えて混ぜます。13, 000 gで2分間遠心分離して破片を取り除きます。

終了したら、1マイクロリットルのスーパーネームをマルディターゲットプレート上のサンプル位置に移します。サンプルを乾燥させた後、各スポットに1マイクロリットルのHCCAマトリックス溶液を重ね、室温で結晶化させます。この時点で、各スポットについて600のスペクトルを100ショットステップで収集することにより、MALDI-TOF分析を実行します。

まず、質量分析計の設定ソフトウェアで自動実行タブをクリックします。メソッドボタンを左クリックし、プルダウンメニューからメソッドを選択して、メソッドを開きます。次に、編集ボタンを左クリックして、自動実行メソッドエディタを開きます。

[Accumulation] タブで、満足のいくショット値を 100 に、合計値を 600 に設定します。各スペクトルについて、リストからキャリブラントピークを選択し、自動割り当てをクリックしてOKを押します各スポットから質量スペクトルを取得した後、スペクトルブラウザでスペクトルを開き、キャリブラントなしのスペクトルと比較して予想される質量のピークを見つけることにより、キャリブレーションピークの正確な質量を実験的に決定します。キャリブラントのピークが、対象生物の他のバイオマーカーによって隠されていないことを確認します。

参照株のゲノムシーケンシングデータから、DNA配列を対応するアミノ酸配列に翻訳することにより、コードされた各タンパク質の理論的なモノアイソトピック分子量を計算します。このタンパク質配列を適切なバイオインフォマティクスリソースパネルの入力ボックスにファイルまたはコピーペーストしてアップロードし、理論上の等電点と分子量を計算します。結果をスプレッドシートにコピーし、1つの列に遺伝子識別子、もう1つの列に分子量を入力します。

計算された分子量で行をソートして、質量の検索を容易にします。スプレッドシートに、demathianinated形式の分子量の列を追加で挿入し、モノ同位体分子量から135ダウトンを差し引きます。ゲノムテーブルから測定された質量を調べることにより、各主要な測定されたバイオマーカーの質量を参照株から計算された質量に割り当てます。

別のスプレッドシートで、各バイオマーカーイオンの質量と識別子を記録します。次に、コレクション分離株から得られた質量スペクトルを、参照株に対して行ったようにキャリブレーションします。1 行につき 1 つの分離株について、マススペクトル内のバリアントバイオマーカーを同定し、各バイオマーカーの測定質量と予測アイソフォームをそれぞれの列に記録します。

C-Jejuni 亜種 doylei ATCC 49349 の MALDI-TOF 質量スペクトルには、計算された分子量と参照スペクトルとの比較によって同定できる 14 の特異な荷電バイオマーカーイオンが含まれています。コレクション内では、メチオニンを含まない L32、L33、および gil152939117、S20 M、および S15 M によってコードされる仮想タンパク質について、さまざまなアイソフォームが検出されました。質量シフトに対応するアミノ酸置換は、ここに列挙したプライマーを用いた特定の遺伝子のPCR増幅およびサンガーシーケンシングによって同定されている。

MSPPスキームに含まれるすべてのバイオマーカーイオンのアミノ酸配列と、検出されたアレル酸アイソフォームをここに示します。調査したC jejuni亜種doylei分離株から構築されたMLSTベースのUPGMA樹形図は、各分離株が異なるMLST配列タイプに属していることを示しています。そして、LMG7790株は系統発生距離が最も長いです。

MLSTアレイで見られるように、分離LMG7790は、調査したC jejuni亜種doylei分離株のMSPP分析で最も長い系統プロデオミック距離を持っています。このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば1日で完了します。この手順に従う際には、実験中に使用される一部の物質の毒性を覚えておくことが重要です。

例えば、アセトニトリルは皮膚の炎症を引き起こす可能性があります。さらに、MSPPには、DNAシーケンシングなどの他の方法を実行して、耐性遺伝子の存在などのさらなるパラメーターを解析することができます。この技術の開発は、微生物学の分野の研究者が光発生を探求する道を開くものです。

このビデオを見れば、MSPP がどのように機能し、特定の質問にどのように適用できるかについて十分に理解できるはずです。凶暴な病原体を扱う作業は非常に危険である可能性があるため、S2ラボ機器などの予防策を常に講じる必要があることを忘れないでください。