急性および亜急性ネズミ後肢虚血のための方法

本プロトコルの総合的な目的は、マウスの大腿動脈に縫合糸またはアメロイド収縮環を留置することで、それぞれ急性または亜急性の後肢虚血を誘発し、ヒトの末梢動脈疾患をモデル化することです。末梢動脈疾患は重要な臨床的課題であり、ヒトの疾患をより適切に再現するために、動物モデルを用いたこれらの手法が開発されました。これらの手法の主な利点は、肢虚血の発症タイミングおよび重症度を研究者が制御できることです。

手順のデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるMike Padgettが行います。処置の1〜2日前に、足指へのピンチ刺激に対する反応がないことでマウスが十分に鎮静されていることを確認し、眼軟膏を塗布します。次に、小型電動バリカンを使用して、両後肢の被毛を剃毛します。

すべての被毛をトリミングした後、あらかじめ温めておいた除毛クリームを塗布します。1分後、湿らせたガーゼパッドでクリームを優しく拭き取ります。その後、マウスが腹臥位を維持できるようになるまで、ペーパータオルを敷いた空の回復ケージに入れておきます。

手術当日、十分に鎮静させたマウスをTechnic実体解剖顕微鏡の下に仰臥位で置き、両脚をサージカルテープで固定します。温度制御機能付きのヒーティングパッドを使用する場合は、温度プローブを取り付け、プローブをサージカルテープで手術プラットフォームのベースに固定します。次に、ポビドンヨードとアルコールのワイプを交互に3回使用して手術部位を洗浄し、切開部位に穴が開いた滅菌サージカルドレープで動物を覆います。

メスを用いて、膝から腹部に向かって大腿内側の中央に沿って最初の切開を行います。次に、精細鋏を用いて切開線を約1 cmまで延長します。ピンセットで切開部を広げ、鼠径脂肪組織を覆っている膜を露出させます。

次に、閉じたピンセットを使用して膜を貫通し、脂肪組織と腹部の間の空間に入れます。ピンセットの圧力を緩やかに解放して脂肪組織を腹筋から分離し、神経血管束を露出させます。神経血管束を解剖する前に、主要な血管とその分枝を正確に特定しておくことが極めて重要です。

収縮装置の設置場所や結紮部位の変動は、虚血の程度を著しく変化させ、結果に大きなばらつきをもたらす可能性があります。切開部にリトラクターを挿入し、腹部組織を動物の頭側へ牽引して、外側大腿回旋動脈の直近にある近位アメロイド収縮装置の設置部位を露出させます。次に、切開部の遠位側に内側と外側にそれぞれリトラクターを挿入して術野を広げ、鼠径部の脂肪組織を足側へ、術野から離れるように牽引します。

大腿動脈の近位および表在側尾側分枝が容易に観察できるはずです。外側大腿回旋動脈は、尾側分枝から近位に約5mmの位置にあり、膜によって隠れている場合があります。ここで、血管同士を結合している膜の下にピンセットの先端をそっと滑り込ませ、静脈と動脈の間に先端の半分を挿入します。

次に、鉗子を閉じ、膜をそっと剥がします。膜をすべて除去したら、閉じた鉗子の先端を静脈と動脈の間に挿入し、鉗子の圧力を緩めて血管の間に隙間を作ります。亜急性肢虚血の場合は、鉗子の先端を大腿動脈の下に滑り込ませ、神経血管束から血管を単離します。

2セット目の有角鉗子を使用してコンストリクターの端を掴み、コンストリクターを大腿動脈の下に通します。次に、動脈をコンストリクターのスロットに収めます。続いて、大腿動脈が膝窩動脈と大伏在動脈に分岐する直前の近位側に遠位コンストリクターを配置し、大腿動脈をコンストリクターのスロットに収めます。

急性肢虚血の場合、近位側の絞扼部位と同じ位置で、動脈の下に7-0縫合糸を通し、動脈を結紮します。次に、1つ目の結紮部位から遠位に約1mmの位置で2つ目の結紮を行い、スプリング scissorsを用いて2つの結紮部位の間で動脈を切断します。遠位側の動脈切断では、大腿動脈が膝窩動脈と伏在動脈に分かれる直近位の部位に、約1mmの間隔を空けて結紮を行います。

次に、5-0 Vicryl縫合糸を用いて結節縫合で切開部を閉じ、マウスをレーザードップラー血流イメージング装置下の37 °Cのヒートパッドに移動させます。イメージング装置の電源を入れ、画像キャプチャソフトウェアを起動します。「New Single Image」アイコンをクリックしてスキャナー設定ウィンドウを開き、スキャンサイズを「large」に、スキャン速度を「4 ms/pixel」に設定します。

Scan AreaユニットパネルのXおよびYの値を適切な値に変更し、Video and Distanceタブをクリックして、両後肢をスキャンエリア内に配置します。Auto Distanceをクリックし、次にNextをクリックしてSubject Detailsウィンドウを開き、被験者情報を入力します。Nextをクリックしてスキャンウィンドウに進みます。

次に、「Start Measurement」ボタンをクリックして「Confirm or Override Scan Distance」ダイアログボックスを開き、「OK」をクリックしてスキャンプロセスを開始します。スキャンが完了したら、完全に回復するまで、モニタリングが可能な空きのリカバリーケージにマウスを移動させます。動物実験に固有の個体差に加えて、体温や動物の固定位置などの要因が、レーザードップラー血流画像法における変動要因となる可能性があります。

亜急性後肢虚血モデルはアメロイド収縮装置の品質に依存しますが、その品質は同一ロット内でも大きく異なる場合があります。手術の効果を実証し、術後の灌流のベースラインを確立するために、動物がまだ麻酔下にある状態で、処置直後にレーザードップラー灌流画像診断を行う必要があります。急性肢虚血の誘発後には後肢灌流の完全な消失が観察されますが、亜急性モデルにおけるアメロイド収縮装置の留置後には、通常、軽度の灌流低下のみが観察されます。

これらの手順により、ヒトの末梢動脈疾患のモデルであるマウスを用いて、異なる程度の虚血が血管リモデリングおよび骨格筋再生に及ぼす影響を探索することが可能になります。習得後、正しく実施すれば、これらの処置は約15分で完了できます。これらの手術を行う際は、動物の体温および麻酔の適切性を継続的に監視することが重要です。

結紮糸や絞扼具の配置を調整することで、虚血性損傷の重症度を変更することが可能です。これは、動物の遺伝的背景や心血管リスク因子の有無に応じて重要な変数となります。このビデオを視聴することで、マウスにおいて急性および亜急性の後肢虚血を誘発する方法と、適切な結果および手順の再現性を確保するための血管解剖学的構造の定義について、十分に理解できるはずです。