ヒト肝幹細胞を用いたヒト化マウス肝臓の生成

この外科的な幹細胞移植手順の全体的な目的は、ヒト未熟肝幹細胞前駆細胞を用いて、細胞の増殖、成熟、および分化による薬物代謝能の獲得を可能にし、ヒトの肝機能を持つ新規のキメラマウスモデルを作製することです。この手法は、ヒトドナー肝幹細胞前駆細胞の増殖、分化、および損傷したレシピエントマウス肝臓の再構成をサポートするための微小環境を構築する強力なツールとなります。本技術の主な利点は、成熟・増殖した細胞を利用できること、および肝臓がほぼ完全に再構築されることです。

まず、1 mgのDTにフェノール化0.85%塩化ナトリウム溶液を1 mL加え、1 mg/mLのジフテリア毒素（DT）ストック溶液を作成します。Albtrek SCIDマウスを仰臥位に固定し、正中線左右の膝の曲がり手前から、体に対して45度の角度で針を刺入し、DTの腹腔内投与を行います。インスリン用注射器を用い、体重20 gのマウスあたり、調製直後の0.3 µg/mL DT溶液を100 µL注入します。DT投与から48時間後、マウスを拘束器に入れ、血管を拡張させるため、尾を30 °Cのウォーターバスで約10分間温めてください。

次に、尾の先端から2 cmのところで、鋭利なメスを用いて尾に1 mmの切り込みを入れ、キャピラリーチューブで血液を採取します。血液の入ったマイクロキャピラリーチューブを1500 ×gで5分間遠心分離し、上清を細胞ペレットから分離して血清を回収します。血清を1:20に希釈したものを50 µL、GOT ASTP3スライドにピペッティングします。

次に、製造者のプロトコルに従って多目的自動乾式化学分析装置を使用し、反応生成物の吸光度を650 nanometersで測定します。セルソーターを用いて、ヒト原代胎児肝細胞からCDCP1、CD90、およびCD66細胞抗原を持つヒト肝幹細胞を分離し、CDCP1陽性、CD90陽性、CD66陰性のサブポピュレーションを得ます。これらの細胞をコラーゲンIVコーティング済みの培養ディッシュに播種し、37 degrees Celsiusでインキュベートします。

細胞が80から90%のコンフルエンスに達したら、PBSを用いて細胞を1回洗浄します。次に0.05% Trypsin EDTAを加え、室温でインキュベートします。顕微鏡下で細胞が浮遊しているか、あるいは自由に流動しているように見えたら、10% FBSを含むDMF12を8 mL加えて酵素消化を停止させます。

10 mLのセロロジカルピペットを用いて、細胞をゆっくりと懸濁させ、15 mLのコニカルチューブに移します。細胞を100 ×g、4 °Cで5分間遠心分離します。10% FBSを含むDMF12を10 mL使用して、細胞ペレットを慎重に再懸濁し、細胞計数装置を用いて細胞数を測定します。

細胞を、マウス1匹あたり50 µLのPBSに1×10⁶個の割合で分注し、移植まで氷上で保存します。本文のプロトコルに従ってマウスを麻酔した後、後肢の足底を軽くつまんで反射を確認します。その後、乾燥を防ぐために眼軟膏を塗布します。

電気バリカンで手術部位を剃毛し、70% ethanolとポビドンヨードを塗布して消毒します。肋骨の肋骨縁の直下、左側腹部に1 cmの皮膚切開を加えます。続いて、左腹壁を切開し、さらに腹膜を切開します。

次に、脾臓を慎重に露出させます。続いて、5度の角度で、32G 1/2インチの針を装着した100 µLマイクロインジェクション用シリンジを、脾臓の厚さの半分まで刺入します。臓器の端から端まで、1×10⁶ 個のヒト肝幹細胞を50 µLのPBSに懸濁させて直接注入し、針を抜きます。注入後の細胞の漏出を防ぐため、指で2分間軽く圧迫します。

脾臓をマウスの体内に戻し、通常の走行縫合を用いて筋肉と皮膚を縫い合わせ、体腔を閉じます。直ちにマウスを側臥位にし、37 °Cに予熱したケージに移します。ケージの敷材が手術部位に接触しないようにし、テキストプロトコルに従って動物を観察します。

移植後4〜6週に、テキストのプロトコルに従ってマウスを安楽死させた後、外科用鋏を用いて皮膚と筋膜を同時に切開し、腹腔を開きます。鋏を開創器として使用し、白線に沿って腹膜上の結合組織を剥離して腹腔を開きます。ピンセットで胸骨を持ち上げます。

次に、横隔膜を穿刺し、胸骨の両側を頸帯まで切断します。肝臓の胸腔側に位置する大静脈を切断し、食道を肝臓を通して前方に引き出します。横隔膜を取り除き、それをハンドルとして利用しながら、肝臓を腹腔から引き出し始めます。

下大静脈が肝臓を固定しています。したがって、右副腎を不用意に遊離させないよう注意しながら、下大静脈を切断します。肝葉を接合部で互いに分離し、メーカーのプロトコルに従ってOCTに包埋します。

クリオスタット上のメタルグリッド内で、肝組織を含むOCTを凍結させます。クリオスタットを用い、-18 °Cで厚さ5 µmのサンプル切片を作成し、室温の顕微鏡スライドに貼付します。ストックは-80 °Cで保存してください。

最後に、既報の手順に従ってH&E染色のスライドを調製し、本文のプロトコルに従ってELISAを実施します。これらのH&E染色切片に示されているように、DT投与マウスでは肝臓構造の崩壊が認められ、血清AST活性の上昇を伴ううっ血への補正が見られました。移植後6週において、ヒト肝幹細胞由来の細胞が、常在するマウス肝細胞を置換することで肝構造を再構築しました。

肉眼的に、移植後4日目には、肝臓の周囲に均一に分布した小さなヒト肝細胞クラスターが検出されました。45日目には、これらのクラスターは増殖して大きなクラスターとなりました。ここで示されているように、ヒト核およびサイトケラチン8/18抗体を用いた染色により、移植後6週目にマウス肝臓内へのヒト肝細胞の存在が初めて確認されました。

ヒトALB陽性かつCK19陰性の肝細胞は機能的な肝細胞に類似していた一方で、ヒトALBとCK19の両方に陽性反応を示した細胞は、肝細胞と胆管細胞の両方に分化し得る二分化能を示した。肝葉の周囲に、明瞭なヒトの核とCK8/18の発現を伴う複数の円形クラスターが存在することが確認され、ヒト化肝臓におけるヒト肝幹細胞のコロニー形成能が実証された。最終的に、再構築率は移植後1ヶ月で最大90%に達し、再構築されたマウス肝臓においてヒトAlbuminの分泌が検出された。

習得すれば、適切に行うことで外科的な細胞移植は10分で完了できます。この処置を行う際は、肝損傷を補助肝に限定させることが重要です。細胞漏出がある場合は、細胞移植を控えてください。

本手順に加え、ヒト細胞を用いたin vitro直接リプログラミングのための遺伝子導入などの他の手法を併用することで、現在のモデルにおけるヒト細胞の収束性を探索することが可能です。この技術の開発により、肝臓学分野の研究者は、ヒト化肝臓モデルを用いて、ヒトの薬物代謝、薬物相互作用、肝毒性、および肝炎ウイルスを探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、肝幹細胞の単離と拡大、肝損傷の誘導、および脾臓を介した細胞移植によるヒト肝機能を備えたキメラマウスモデルの作製方法について、十分に理解することができるはずです。

ジフテリア毒素は制御可能であること、また本手順の実施にあたっては、心臓や肝臓の壊死を避けるなどの重要な予防措置を常に講じる必要があることに留意してください。