胞胚の開発の外科的融合による並体結合ゼブラフィッシュ胚の生成

この方法の全体的な目標は、パラビオティックゼブラフィッシュの胚を生成することであり、これは、目的の候補遺伝子の細胞内因性機能と細胞外因性機能の研究に使用できます。この方法は、細胞の自律性に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、造血系では、HSC遊走における重大な欠陥は、HSCまたはニッチ微小環境に内在しています。

このプロトコールの主な利点は、パラビオティックゼブラフィッシュの胚を成功裏に生成する能力が向上することです。一般に、この方法に不慣れな個体は、発生中の胚が非常に壊れやすく、損傷しやすいため、苦労します。外科的縫合手順は、高度な精度と精度を必要とするため、習得が難しい場合があるため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。

ここでは、発生中の胞胚の外科的融合によりパラバイオティックゼブラフィッシュ胚を生成するためのステップバイステップの説明を提供します。この方法は、パラビオティック融合の効率を高め、結合した胚の生存率を高める方法を示しています。テキストプロトコルに従って試薬とツールを調製した後、ピペットの端をブンゼンバーナーで短時間加熱することにより、2〜3個の改造パスツールピペットを準備します。

次に、大きな鉗子を使用して、まだ熱いうちに、ピペットの端を約45度曲げます。胚を損傷する可能性のある鋭いエッジがないように、ピペットの端をブンゼンバーナーの上に1〜2秒間置いてください。血漿DNA、mRNA、モルフォリノを用いて、胚採取から1時間以内に胚をマイクロインジェクションし、256細胞期まで成長させます。

胚が256細胞期に近づくと、各遺伝的背景を別々のアガロースコーティング皿、傷のつかないガラスビーカー、またはシャーレに移します。テキストプロトコルに従って胚を解剖した後、事前に調製したメチルセルロースを解凍し、卓上遠心分離機を使用して最高速度で未溶解の結晶をペレット化します。これは胚を損傷したり、卵黄を破裂させたりします。その間に、マーカーを使用して、100ミリリットルのアガロースコーティングされたペトリ皿の底面に12〜15の所定のスポットをマークします。

次に、遠心分離後、メチルセルロースの透明な上部画分を使用して、1〜1.5センチメートルの滴をシャーレのマークされたスポットに移します。次に、調製したばかりのアガロースコーティングディッシュごとに、40ミリリットルの高カルシウムリンガー、またはHCR溶液を1つ調製します。各アリコートに、ここに記載されているように抗生物質を追加します。.

胞胚融合を行う準備ができたら、HCRのアリコートと抗生物質を使用して、メチルセルロースの液滴を含む各皿を慎重に充填し、液滴を乱さないように注意してください。以前に準備した改質ガラスパスツールピペットを10ミリリットルのピペットポンプに取り付けます。次に、ステレオスコープの下で、各背景から1つのデコレーション化された胚を収集します。

2つの胚を分注する前に、パスツールピペットを使用して、メチルセルロース滴の中央に小さなくぼみを作ります。次に、2つの胚をくぼみに沈着させます。次に、端にゲルローディングチップが付いたティーリングニードルを使用して、胚に直接触れずに穏やかに掃引する動きを使用して、メチルセルロース内の胚を慎重に再配置します。

発生中の胚の向きを適切に調整することで、胚がどのように融合して成長するかが決まります。直接対決の場合は、各融合が動物の極で整列していることを確認してください。メチルセルロースが胚の周りに落ち着くまで、胚を5分間座らせます。

この間に、次のペアを別のドロップにロードします。手術を行うには、ガラス針ツールを使用して、各胚を接触点に慎重に傷つけます。次に、穏やかな縫製動作で、最初の胚から2番目の胚に細胞を引き込み、再び戻します。

モーションの最後に、針を2〜3秒間所定の位置に保持してから、ゆっくりと針を引き離します。ガラス針の精度は、胚が適切に縫い合わされていることを確認するために重要です。卵黄嚢を傷つけないように注意しながら、融合を成功させるための十分な接続を維持する必要があります。

胚を室温で10〜15分間放置します。その間に、胚の追加のペアをステッチします。インキュベーション後、胚が付着したままになっているかどうかを評価し、必要に応じて傷害ステップを繰り返します。

胚を同じ皿と培地で摂氏28.5度で一晩インキュベートします。翌朝までに、胚は大部分が溶解したメチルセルロースから移動します。正常に融合していない胚をすべて取り出します。

次に、培地をデカンタし、25ミリリットルのE3を使用して交換します。融合した胚の画像を取得するには、0.8%低融点のアガロースを調製します。まだ熱いうちに、1ミリリットルのアガロースを摂氏37度の加熱ブロックにセットした1.5ミリリットルのマイクロチューブに分注します。

胚を含む25ミリリットルのE3培地に、pH 7.0トリカイン1ミリリットルあたり4ミリグラムの1ミリリットルを添加することにより、パラバイオティック胚を麻酔します。胚が真ん中に溜まるように皿をそっと回します。次に、先端の広いプラスチック製トランスファーピペットを使用して、できるだけ少ない液体で胚を引き上げます。

次に、ピペットを直立させ、胚をそっと跳ね返らせて、ピペットの一番下に落ち着くようにします。次に、アガロース表面のピペットチップに軽く触れて、胚を低融点アガロースの1ミリリットルアリコートに移します。ピペットから余分な液体を処分し、ピペットを使用してアガロース内の胚を穏やかに混合します。

次に、ピペットを使用して、アガロースと胚をガラス底の6ウェルプレートのウェルに移します。実体顕微鏡下で、ティーシング針の端に貼り付けたゲルローディングチップを使用して、胚をカバーガラスに近づけ、イメージングに適した方向に配置します。アガロースが硬化し、トリカインを含む培地をウェルに添加した後、倒立広視野落射蛍光レーザー走査型共焦点顕微鏡またはスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して画像を取得します。

胚全体の視野には、4倍の対物レンズを使用します。20倍対物レンズを使用して、特定の組織をイメージングします。テキストプロトコルに従って画像を処理します。

ここに示すように、2つの胞胚を動物の極を互いに向けた後、胚は接触点で慎重に傷つけられました。傷の程度が大きくなると、胚が結合を維持する可能性が高まり、その結果、追加の形態学的欠陥や発達の遅延なしに融合が成功しました。この図で示されているように、2つの胞胚を動物の極を直接揃えて向きを変えることで、信頼性の高い頭と頭、または卵黄の嚢と卵黄の嚢の融合が共有循環で生成されました。

ほとんどの場合、胚は2つの心臓を持ち、共通の循環を共有していました。胚が実際に循環を共有していることを確認するために、GFP陽性赤血球を持つ融合トランスジェニック胚を、mCherry陽性血管内皮細胞を持つ胚に融合させました。この動画で見られるように、受精後48時間までに、GFP陽性赤血球がFlik 1 HRAS mCherryパートナー胚を循環していることが観察されました。

最後に、遺伝子発現の時間的制御を調べるために、2つの胚のうちの1つにhsp70 EGFP DNAコンストラクトを注入しました。摂氏37度での30分間の短時間の熱ショックの後、胚の1つで明確なGFPシグナルが確立され、場合によっては、注入されていないパートナー胚でGFP陽性細胞が循環しているのが見られました。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば5時間で完了します。

この手術を試みる際には、2つの胞胚を縫合する際に注意すること、そして最初の試みで手術が成功しなかった場合は融合を再検討することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、ライブセルイメージングなどの追加の方法を使用して、野生型HSCが変異型ニッチで正常に機能するかどうか、逆に変異型HSCが野生型ニッチで機能できるかどうかなどの追加の質問に答えることができます。この技術は、血液学の研究者がゼブラフィッシュの血液発生の調節を研究するための強力な方法を提供します。

トリケインスは危険な場合があり、この手順を実行する際には適切な安全服を着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。このビデオをご覧いただき、私たちが推奨する技術に従った結果、より優れた生物的ゼブラフィッシュの胚を作製し、より大きな成功を収めることができることを願っています。