用いた無細胞アッセイ

この手順の全体的な目的は、アフリカツメガエル（Xenopus）の卵および胚抽出物を用いて、大きな核が縮小するアッセイを作成することです。この手法は、核の大きさを制御するメカニズムは何かという、核細胞生物学における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、Xenopusの無細胞抽出物の組成と活性を容易に操作し、核の大きさに影響を与える要因を評価できることです。

テキストのプロトコルに従ってアフリカツメガエル（Xenopus）卵抽出液、脱膜精子、および再構成核を調製した後、ガラス製の再利用可能なペトリ皿の上にカエルを保持し、産み落とされたばかりの卵を回収します。総排泄腔付近の下背部に緩やかに圧力を加えることで、産卵を促します。卵が皿の縁に溜まるように、皿を約45度に傾けて保持してください。

次に、過剰なバッファーを除去し、卵がわずかに浸る程度の量の1/3×MMRを加えます。密閉性の高いペッスルを用い、1.5 milliliterチューブ内で精巣の1/4を500 microlitersの高塩濃度Modified Barth's Saline（MBS）とともに磨砕し、均質化します。その後、磨砕した精巣を卵に加え、室温で15分間放置して受精させます。

インキュベーション後、卵を1/3×MMRで満たします。その後、5〜10分後に、暗色の色素を持つ動物極の収縮を確認し、胚を回転させて動物極を上に向けることで、受精を確認します。口径の広いプラスチックピペットを用いて、死滅した卵、溶解した卵、または受精しなかった未分裂の卵を入念に取り除いてください。これらの卵は、周囲の胚に急速に死を誘発させるためです。

受精後1〜2.5時間の間に、pH 7.9に調整した1/3 X MMRに溶解した2〜3%システインを用いて、胚のジェリー層を除去します。除ゼリー化前の胚は、比較的大きな体積を占めています。緩衝液の交換を2回、それぞれ3〜4分間ずつ行います。

次に、1/3 X MMRで6〜10回短時間で繰り返し洗浄し、システインの痕跡を完全に除去します。除ゼリー後、胚は密集し、比較的少ない体積に収まります。続いて、広口のガラスピペットを用いて、健康な受精卵を新鮮な1/3 X MMRを含むペトリ皿に移します。

室温で、目的のステージまで発生させます。初回分裂が見られない、あるいは白く膨張した外見を示す死滅または溶解した胚を、引き続き取り除きます。胚がステージ11.5から12に達したら、0.5 millimolar cycloheximideを添加した新鮮な1/3 X MMRに移し、室温で1時間インキュベートして、インターフェーズ（間期）後期で停止させます。

広口のガラス製またはプラスチック製ピペットを用いて、中期で停止した胚を少なくとも15個、マイクロ遠心チューブに移します。1 µLのLPCストックを添加した1 mLの卵細胞溶解バッファー（ELB）を胚に加えます。チューブを静かに反転させて、胚を洗浄します。

その後、胚がチューブの底に沈降するまで待ちます。バッファーを除去する前に、洗浄をさらに2回繰り返します。胚を、500 µLのELB、0.5 µLのLPCストック、5 µLの19.7 mMシクロヘキシミド、およびアクチン重合を抑制するための5 µLの35.5 mMサイトカラシンDに再懸濁します。

卓上遠心機を用い、200 ×gで1分間サンプルを遠心分離し、余分なバッファーを除去した後、ペッスルを使用して胚を十分に破砕します。破砕したサンプルをスイングバケットローターにセットし、10,000 ×g、16 °Cで10分間遠心分離します。200 µLのピペットチップで上層の脂質層を突き破り、きれいなピペットチップを用いて、中層の琥珀色の細胞質層を適切なサイズのチューブに回収します。

胚抽出物に以下の試薬を添加します。その後、チューブを静かに転倒混和させます。次に、本文のプロトコルに従ってスクワッシュ標本を作成し、抽出物中の内因性胚核を確認した後、ここに記載の試薬を含むELBを同量加えて、抽出物から核を除去します。

チューブを静かに転倒混和します。スイングバケットローターを用い、17,000 ×g、16 °Cで15分間、サンプルを遠心分離します。その後、上層に残っている脂質を避けるように注意しながら上清を回収し、底部の核ペレットを乱さないようにします。

テキストプロトコルに従ってスクワッシュ（圧砕）を行い、ほとんどの核が除去されたことを確認します。その後、新鮮な抽出液を使用するか、サンプルを分注して-80°Cで保存します。1.5 mLチューブ内で、あらかじめ構築した核25～150 µLを1 mLのELBで希釈し、卵抽出液中で構築された核を単離します。

1600 ×g、4 °Cで3分間遠心分離します。その後、ペレットを乱さないように注意しながらバッファーを除去します。卵抽出液の元の量と同量の胚抽出液をペレットに加え、チューブを軽く叩いてペレットを崩し、核を再懸濁させます。

室温で90分間インキュベートし、15〜30分ごとにチューブを軽く叩いて混合します。インキュベート後、15% glycerolおよび2.6% Paraformaldehydeを含むELB 500 µLを添加する直前に、チューブを叩いて核を再懸濁させます。直ちにチューブを反転させ、室温のローテーターで15分間回転させます。

15 mLのラウンドボトムガラスチューブにラウンドボトムプラスチックインサートを装着し、スピンダウンチューブを準備します。核クッションバッファーを5 mL加え、次に直径12 mmの円形カバーガラスをチューブに入れ、プラスチックインサートの上に平らに置かれていることを確認します。ワイドボアピペットチップを使用して、固定済み核溶液を核クッションの上に静かに重層します。

スイングバケットローターを用い、1,000 ×g、16 °Cで15分間遠心分離します。次に、アスピレーターを使用してバッファーをすべて除去し、プラスチックインサートをチューブの上端に固定します。その後、精密ピンセットを用いてカバーガラスを取り除きます。この際、核が沈降したカバーガラスの面を確認するように注意してください。

カバーガラスを冷メタノール中で室温で5分間固定します。カバーガラスを、核が上になるように、大きなプラスチック製ペトリ皿に敷いたプラスチック製パラフィンフィルムの上に移動させます。その後、乾燥を防ぐため、皿の側面に濡れた使い捨てワイプを置きます。

500 µLのPBS NP40を用いて、カバーガラス上の核を5〜10秒間再水和させ、その後吸引します。次に、75 µLのPBS 3%BSAをカバーガラス上に慎重に重層し、室温で1時間、または4 °Cで一晩ブロッキングを行います。ブロッキングバッファーを除去し、PBS 3%BSAで希釈した一次抗体でインキュベートします。

次に、サンプルをPBS NP40で5回迅速に洗浄します。これらのインキュベーションおよび洗浄ステップを、二次抗体を用いて繰り返します。PBS 3%BSAで希釈した10 µg/mLのHoechstを用いて、室温で5分間インキュベートします。

次に、PBS NP40で5回洗浄し、余分なバッファーをすべて取り除きます。最後に、5 µLの抗退色封入剤を用いてカバーガラスをスライドグラスに封入します。透明なマニキュアでカバーガラスを密封し、直ちにエピ蛍光顕微鏡で撮影するか、後で撮影するために40 °Cで保存してください。

この図は卵抽出液中における核の組み上がりを示しています。反応開始から30～45分後、細いS字型の精子核が肥大し、ナメクジ状のクロマチン塊へと変化し始めます。核の組み上がりが起こると、核の形状はより円形に近づき、核膜の拡大と核タンパク質の取り込みに伴って核容積が増加します。

ここで示すように、胚抽出液の少量をHoechst染色してプレス標本（スクアッシュ）を作成すると、多くの染色された核が観察され、抽出液の調製が成功したことがわかります。遠心分離による核の除去後、このパネルに示されているように、最初のプレス標本と比較して抽出液中に残っている核は極めて少なくなっており、これにより内因性核が後続の解析を妨げないことが保証されます。もし核がまだ存在している場合は、2回目の遠心分離が必要です。

この核収縮アッセイでは、胚抽出液の後期段階に再懸濁した卵抽出液核が、時間の経過とともに正常に小型化します。しかし、熱失活させた胚抽出液中でインキュベートした核ではこの現象は起こりません。アッセイ固有のばらつきに対処するためには、実験を複数回繰り返すことが重要です。

一度習得すれば、プロトコル全体を2日間で完了でき、核収縮アッセイ自体には約4時間かかります。この手順を行う際は、全工程を通じて卵子と胚の品質チェックを行うこと、および遠心分離後の細胞質抽出液を回収する際に、ペレットと脂質層を避けるよう細心の注意を払うことが重要です。本手順に従って得られた結果は、検証される必要があります。

例えば、胚へのマイクロインジェクションや細胞培養におけるトランスフェクションなどが挙げられます。さらに、この手法は他の細胞小器官のサイズ調節を探索するためにも利用できる可能性があります。本技術の開発後、核細胞生物学分野の研究者は、核サイズの調節メカニズムや、発生および発がんにおける核サイズの機能的な役割を探索することが可能となりました。

このビデオを視聴することで、Xenopus卵抽出液核の調製と単離、Xenopus胚および胚抽出液の作製、核収縮アッセイの実施、およびその結果の可視化の方法について十分に理解することができます。