Name: 用いた無細胞アッセイアフリカツメガエル胚は、核サイズの規制のメカニズムを研究するために抽出します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
Description: 学ぶアフリカツメガエル胚抽出物を用いた核縮小アッセイの手法。核サイズ調節メカニズムを解明し、細胞生物学研究に貢献します。

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Levy研究室とGatlin研究室のメンバー、そして分子生物学科の同僚たちは、有益なアドバイスと議論を提供しました。Rebecca Healdは、このプロトコルの開発の初期段階でサポートを提供しました。この研究は、NIH/NIGMS (R15GM106318) と American Cancer Society (RSG-15-035-01-DDC) の支援を受けました。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、X.laevis発生中の核サイズ調節のメカニズムを研究するための新しい方法を紹介します。発生の進行は、細胞の生理学、代謝、分裂速度、移動の劇的な変化、および細胞のサイズと細胞内構造の変化に関連しています。これらの多様なプロセスは複雑で不可欠であるため、in vivo環境で発生のこれらの側面の1つだけを研究することは困難です。ここで説明するX.laevis胚抽出物と核収縮アッセイは、in vivoシステムの複雑なシグナルと物理的制約を回避して、in vitroの文脈でのサイズ調節メカニズムの研究を可能にします。さらに、抽出物の開放的な性質により、生化学的操作が容易になります。
プロトコルのいくつかの手順のトラブルシューティングが必要になる場合があります。核の集合と成長の問題は、低品質の卵子、精子核の不完全な脱膜、精子核の濃度が高すぎる使用、または温度が低すぎる核集合反応のインキュベーションによって生じる可能性があります。後期胚抽出物からの内因性胚核の除去は、これらの核のサイズが小さいた...

細胞小器官の大きさは、典型的には、細胞の大きさに比例し、これはおそらく最高のセルサイズ1-10との核の大きさのスケーリングのために文書化されています。これは、細胞と核の大きさの両方の劇的な減少は、多くの場合、11,12を観察している胚形成および細胞分化、中に特に当てはまります。また、変更された核の大きさは、癌の診断および予後13-17で重要なパラメータです。核のサイズの調節に寄与メカニズムは複雑さに起因する部分と核構造と機能の本質的な性質で、不明な点が多いです。ここで説明する方法は、生化学的操作および核のサイズ調節のメカニズムの解明に適している核のサイズスケーリングのためのin vitroアッセイとして開発されました。 アフリカツメガエルの卵抽出物は、in vitroでの複雑な細胞過程を再現し、研究するために十分に確立されたシステムであり、 </em&gt;コンテキスト。これらの抽出物は、アセンブリおよび紡錘体、小胞体の機能、および核18-22を含むいくつかの細胞プロセスに関する新たな基本的な情報を明らかにしました。抽出システムへの重要な利点の1つは、Xです。ツメガエル卵抽出物は、その組成が容易に組換えタンパク質または免疫除去の添加によって、例えば、変更することができ、ほぼ未希釈の細胞質を表します。また、一方がさもなければインビボの状況において致死的であるかもしれない治療を使用することによって本質的なプロセスを操作することができます。卵抽出物手順の変更は、Xからの抽出物の単離を可能にツメガエル胚ではなく、卵、およびこれらの胚抽出物は、生化学的な操作23にも同様に適しています。 X.中に数千50μを生成する-開発をアフリカツメガエル 、単細胞受精胚（〜1ミリメートルの直径）は12急速な細胞分裂（8ステージ1）のシリーズを受けますメートルの直径と発達段階に到達したより小さな細胞は、中期胞胚変移（MBT）またはステージ8 24-26と呼ばれます。 MBTは接合体、転写、細胞遊走、非同期細胞分裂、ギャップ相の取得、および核定常状態のサイズではなく、事前MBT胚のように継続的な原子力拡大の設立の発症によって特徴付けられます。ステージ4から原腸形成（段階10.5から12）に、個々の核の体積が10倍以上11により減少します。 ここでは、目標は、発達の進行の間の核の大きさで、これらの削減のための責任のメカニズムを識別することです。アプローチは、最初のXで核を組み立てることです卵抽出物をアフリカツメガエル卵細胞質/抽出物から、それらの核を単離すること。これらの核は、その後、後期原腸段階の胚から細胞質中に再懸濁されています。インキュベーション期間後、卵抽出物からの核は後期胚抽出物中より小さくなります。我々は、このwoulと推論しました発達核のサイズスケーリングに貢献後期胚に存在する細胞質成分を同定するために有用なアッセイをd。 インビボでの検証と結合し、このアッセイを用いて、我々は、プロテインキナーゼC（PKC）は、Xの核の大きさの発達削減に寄与することが実証され23を アフリカツメガエル 。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 568 ロバ抗マウスIgG</td><td>分子プローブ</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>ATP二ナトリウム塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>ベンゾカイン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1501</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>ベックマン</td><td>J2-21M</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機ローター</td><td>ベックマン</td><td>JS13.1</td><td></td></tr><tr><td>キモスタチン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>クレアチンリン酸二ナトリウム</td>カル<td>バイオケム</td><td>2380</td><td></td></tr>シ<tr><td>クロヘキシミド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>C6255</td><td></td></tr><tr><td>サイトカラシンD</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てワイプ(kimwipes)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>L-システイン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W326306</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>ガラス結晶化皿(150 x 75 mm)</td><td>VWR</td><td>89090-662</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>マクロン</td><td>5094-16</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst - ビスベンズイミド H 33342 三塩酸塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>HCG - ヒト絨毛性ゴナドトロピン&nbsp;</td><td>Prospec</td><td>hor-250-c</td><td></td></tr><tr><td>L15 Media</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Lysolecithin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1381</td><td></td></tr><tr><td>mAb414</td><td>Abcam</td><td>ab24609</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>EMD</td><td>MX0045-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>マルトース</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>M5885</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>BDH</td><td>56009</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン+ストレプトマイシン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>Pp0781</td><td></td></tr><tr><td>ペプスタチン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>パイプ</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック パラフィン フィルム (パラフィルム)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</sub</td><td>>Mallinckrodt</td><td>70100</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Baker</td><td>5 3140</td><td></td></tr><tr><td>PMSG - 妊娠中の牝馬血清 ゴナドトロピン</td><td>プロスペック</td><td>hor-272-a</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</sub</td><td>>Fisher</td><td>BP328</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD</td><td>SX0720-1</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0590</td><td></td></tr><tr><td>Pestle</td><td>Thomas Scientific</td><td>3411D56</td><td></td></tr><tr><td>丸底ガラス管、15 ml</td><td>Corex</td><td>8441</td><td></td></tr><tr><td>二次抗体 (Alexa Fluor 568 ロバ抗マウス IgG)</td><td>ThermoFisher</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Calbiochem</td><td>8550</td><td></td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>Beckman</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>超遠心ローター</td><td>Beckman</td><td>SW 50.1</td><td></td></tr><tr><td>ベクタシールド(色褪せ防止封入材)</td><td></td><td>ベクターH-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

用いた無細胞アッセイ<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚は、核サイズの規制のメカニズムを研究するために抽出します

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

細胞生物学の根本的な疑問は、細胞や細胞小器官のサイズが規制されている方法です。長い細胞や核のサイズの両方の劇的な削減が発生したときに、核の大きさは、一般的に胚形成の間、特に、セルの大きさに比例することが認められています。核のサイズ調節のメカニズムは不明な点が多いと変更された核の大きさがキー診断および予後のパラメータである癌に関連する可能性がある。 インビボ核サイズ調節因子が核機能の本質的かつ複雑な性質によって複雑されている識別に近づきます。核のサイズ制御を研究するためにここに記載のin vitroアプローチは、 アフリカツメガエルの開発中に発生する核の大きさが通常の減少を利用しています。まず、核はXに組み立てられます卵抽出物をアフリカツメガエル 。そして、これらの核は、後期胚から単離され、細胞質中に再懸濁します。 90分のインキュベーション期間、核の表面積 - 30後発達核のサイズスケーリングに貢献後期胚に存在する細胞質成分を識別するために有用なアッセイを提供し、60％ - 20によって減少します。このアプローチの主な利点は、卵や胚抽出物は、生化学的に核の大きさを調節する新規タンパク質や活動の同定を可能にする、操作することが可能な相対的な施設です。任意のインビトロのアプローチと同様に、in vivo系での結果の検証が重要であり、Xのマイクロインジェクションツメガエル胚は、これらの研究のために特に適しています。

卵抽出物中の核の組立 このプロトコルの最初のステップは、Xを準備していますツメガエルの卵抽出物（プロトコル1）および脱膜化精子核（プロトコル2）。これらの試薬 ​​は、その後、核デノボ （プロトコル3）を構築するために使用されている。1は、いくつかの代表的なデータを示しています。カルシウムの添加は、間期に減数分裂逮捕卵抽出物を駆動し、シクロヘキシミドは間期で逮捕された抽出物を保持します。 30で - 反応開始後45分で、最初は薄いS字型の精子核はスラグ状のクロマチン塊に厚くを開始する必要があります。無傷の核エンベロープの成功した形成は、GST-GFP-NLS（データは示していない）、またはFGリピートを認識するmAb414を用いた核膜孔複合体のためのリム染色などに...

細胞および細胞内のスケーリングのメカニズムは、まだとらえどころのないままです。Xenopus胚抽出物の使用は、オルガネラサイズ制御のメカニズムを解明するためにますます一般的になっています。この方法は、胚抽出物の調製と、核サイズ調節のメカニズムを特定できる新しい核スケーリングアッセイについて説明するものです。

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

この手順の全体的な目的は、アフリカツメガエル（Xenopus）の卵および胚抽出物を用いて、大きな核が縮小するアッセイを作成することです。この手法は、核の大きさを制御するメカニズムは何かという、核細胞生物学における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、Xenopusの無細胞抽出物の組成と活性を容易に操作し、核の大きさに影響を与える要因を評価できることです。テキストのプロトコルに従ってアフリカツメガエル（Xenopus）卵抽出液、脱膜精子、および再構成核を調製した後、ガラス製の再利用可能なペトリ皿の上にカエルを保持し、産み落とされたばかりの卵を回収します。総排泄腔付近の下背部に緩やかに圧力を加えることで、産卵を促します。卵が皿の縁に溜まるように、皿を約45度に傾けて保持してください。次に、過剰なバッファーを除去し、卵がわずかに浸る程度の量の1/3×MMRを加えます。密閉性の高いペッスルを用い、1.5 milliliterチューブ内で精巣の1/4を500 microlitersの高塩濃度Modified Barth's Saline（MBS）とともに磨砕し、均質化します。その後、磨砕した精巣を卵に加え、室温で15分間放置して受精させます。インキュベーション後、卵を1/3×MMRで満たします。その後、5〜10分後に、暗色の色素を持つ動物極の収縮を確認し、胚を回転させて動物極を上に向けることで、受精を確認します。口径の広いプラスチックピペットを用いて、死滅した卵、溶解した卵、または受精しなかった未分裂の卵を入念に取り除いてください。これらの卵は、周囲の胚に急速に死を誘発させるためです。受精後1〜2.5時間の間に、pH 7.9に調整した1/3 X MMRに溶解した2〜3%システインを用いて、胚のジェリー層を除去します。除ゼリー化前の胚は、比較的大きな体積を占めています。緩衝液の交換を2回、それぞれ3〜4分間ずつ行います。次に、1/3 X MMRで6〜10回短時間で繰り返し洗浄し、システインの痕跡を完全に除去します。除ゼリー後、胚は密集し、比較的少ない体積に収まります。続いて、広口のガラスピペットを用いて、健康な受精卵を新鮮な1/3 X MMRを含むペトリ皿に移します。室温で、目的のステージまで発生させます。初回分裂が見られない、あるいは白く膨張した外見を示す死滅または溶解した胚を、引き続き取り除きます。胚がステージ11.5から12に達したら、0.5 millimolar cycloheximideを添加した新鮮な1/3 X MMRに移し、室温で1時間インキュベートして、インターフェーズ（間期）後期で停止させます。広口のガラス製またはプラスチック製ピペットを用いて、中期で停止した胚を少なくとも15個、マイクロ遠心チューブに移します。1 µLのLPCストックを添加した1 mLの卵細胞溶解バッファー（ELB）を胚に加えます。チューブを静かに反転させて、胚を洗浄します。その後、胚がチューブの底に沈降するまで待ちます。バッファーを除去する前に、洗浄をさらに2回繰り返します。胚を、500 µLのELB、0.5 µLのLPCストック、5 µLの19.7 mMシクロヘキシミド、およびアクチン重合を抑制するための5 µLの35.5 mMサイトカラシンDに再懸濁します。卓上遠心機を用い、200 ×gで1分間サンプルを遠心分離し、余分なバッファーを除去した後、ペッスルを使用して胚を十分に破砕します。破砕したサンプルをスイングバケットローターにセットし、10,000 ×g、16 °Cで10分間遠心分離します。200 µLのピペットチップで上層の脂質層を突き破り、きれいなピペットチップを用いて、中層の琥珀色の細胞質層を適切なサイズのチューブに回収します。胚抽出物に以下の試薬を添加します。その後、チューブを静かに転倒混和させます。次に、本文のプロトコルに従ってスクワッシュ標本を作成し、抽出物中の内因性胚核を確認した後、ここに記載の試薬を含むELBを同量加えて、抽出物から核を除去します。チューブを静かに転倒混和します。スイングバケットローターを用い、17,000 ×g、16 °Cで15分間、サンプルを遠心分離します。その後、上層に残っている脂質を避けるように注意しながら上清を回収し、底部の核ペレットを乱さないようにします。テキストプロトコルに従ってスクワッシュ（圧砕）を行い、ほとんどの核が除去されたことを確認します。その後、新鮮な抽出液を使用するか、サンプルを分注して-80°Cで保存します。1.5 mLチューブ内で、あらかじめ構築した核25～150 µLを1 mLのELBで希釈し、卵抽出液中で構築された核を単離します。1600 ×g、4 °Cで3分間遠心分離します。その後、ペレットを乱さないように注意しながらバッファーを除去します。卵抽出液の元の量と同量の胚抽出液をペレットに加え、チューブを軽く叩いてペレットを崩し、核を再懸濁させます。室温で90分間インキュベートし、15〜30分ごとにチューブを軽く叩いて混合します。インキュベート後、15% glycerolおよび2.6% Paraformaldehydeを含むELB 500 µLを添加する直前に、チューブを叩いて核を再懸濁させます。直ちにチューブを反転させ、室温のローテーターで15分間回転させます。15 mLのラウンドボトムガラスチューブにラウンドボトムプラスチックインサートを装着し、スピンダウンチューブを準備します。核クッションバッファーを5 mL加え、次に直径12 mmの円形カバーガラスをチューブに入れ、プラスチックインサートの上に平らに置かれていることを確認します。ワイドボアピペットチップを使用して、固定済み核溶液を核クッションの上に静かに重層します。スイングバケットローターを用い、1,000 ×g、16 °Cで15分間遠心分離します。次に、アスピレーターを使用してバッファーをすべて除去し、プラスチックインサートをチューブの上端に固定します。その後、精密ピンセットを用いてカバーガラスを取り除きます。この際、核が沈降したカバーガラスの面を確認するように注意してください。カバーガラスを冷メタノール中で室温で5分間固定します。カバーガラスを、核が上になるように、大きなプラスチック製ペトリ皿に敷いたプラスチック製パラフィンフィルムの上に移動させます。その後、乾燥を防ぐため、皿の側面に濡れた使い捨てワイプを置きます。500 µLのPBS NP40を用いて、カバーガラス上の核を5〜10秒間再水和させ、その後吸引します。次に、75 µLのPBS 3%BSAをカバーガラス上に慎重に重層し、室温で1時間、または4 °Cで一晩ブロッキングを行います。ブロッキングバッファーを除去し、PBS 3%BSAで希釈した一次抗体でインキュベートします。次に、サンプルをPBS NP40で5回迅速に洗浄します。これらのインキュベーションおよび洗浄ステップを、二次抗体を用いて繰り返します。PBS 3%BSAで希釈した10 µg/mLのHoechstを用いて、室温で5分間インキュベートします。次に、PBS NP40で5回洗浄し、余分なバッファーをすべて取り除きます。最後に、5 µLの抗退色封入剤を用いてカバーガラスをスライドグラスに封入します。透明なマニキュアでカバーガラスを密封し、直ちにエピ蛍光顕微鏡で撮影するか、後で撮影するために40 °Cで保存してください。この図は卵抽出液中における核の組み上がりを示しています。反応開始から30～45分後、細いS字型の精子核が肥大し、ナメクジ状のクロマチン塊へと変化し始めます。核の組み上がりが起こると、核の形状はより円形に近づき、核膜の拡大と核タンパク質の取り込みに伴って核容積が増加します。ここで示すように、胚抽出液の少量をHoechst染色してプレス標本（スクアッシュ）を作成すると、多くの染色された核が観察され、抽出液の調製が成功したことがわかります。遠心分離による核の除去後、このパネルに示されているように、最初のプレス標本と比較して抽出液中に残っている核は極めて少なくなっており、これにより内因性核が後続の解析を妨げないことが保証されます。もし核がまだ存在している場合は、2回目の遠心分離が必要です。この核収縮アッセイでは、胚抽出液の後期段階に再懸濁した卵抽出液核が、時間の経過とともに正常に小型化します。しかし、熱失活させた胚抽出液中でインキュベートした核ではこの現象は起こりません。アッセイ固有のばらつきに対処するためには、実験を複数回繰り返すことが重要です。一度習得すれば、プロトコル全体を2日間で完了でき、核収縮アッセイ自体には約4時間かかります。この手順を行う際は、全工程を通じて卵子と胚の品質チェックを行うこと、および遠心分離後の細胞質抽出液を回収する際に、ペレットと脂質層を避けるよう細心の注意を払うことが重要です。本手順に従って得られた結果は、検証される必要があります。例えば、胚へのマイクロインジェクションや細胞培養におけるトランスフェクションなどが挙げられます。さらに、この手法は他の細胞小器官のサイズ調節を探索するためにも利用できる可能性があります。本技術の開発後、核細胞生物学分野の研究者は、核サイズの調節メカニズムや、発生および発がんにおける核サイズの機能的な役割を探索することが可能となりました。このビデオを視聴することで、Xenopus卵抽出液核の調製と単離、Xenopus胚および胚抽出液の作製、核収縮アッセイの実施、およびその結果の可視化の方法について十分に理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

核膜のアセンブリは、細胞分裂サイクルの重要なステップであり、このプロセスは、アフリカツメガエル精子クロマチン、細胞質、および光膜の分画を組み合わせることにより、試験管内で複製することができます。完全な核孔複合体と核膜を含めて、形成されており、これらの再構成された原子核は通常の核プロセスの能力がありますされています。...

分別アフリカツメガエルの卵抽出を用いたin vitro核アセンブリで

アフリカツメガエル胚上皮は、上皮形態形成時の極性の開発と形状の変化などの細胞の挙動を研究する理想的なモデルシステムです。固定試料の伝統的な組織は、ますます生細胞の共焦点イメージングによって補完されています。ここでは、カエルの組織を分離し、生きた細胞の共焦点顕微鏡を使用して、ライブ上皮細胞とその細胞骨格を可視化する方法を示しています。...

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル</em

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ここで原稿がアフリカツメガエルにおける蛍光タグ付きリガンドの分泌と普及を分析するための方法の簡単なセットを提供します。これは、リガンドの分布を変更するための他のタンパク質の能力を試験し、モルフォゲン勾配を調節するメカニズムへの洞察を与えることが実験を可能にするためのコンテキストを提供します。...

の共焦点分析を用いました<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt; WntおよびShhのモルフォゲン勾配の調節を調査するために、

高度に圧縮された有糸分裂クロマチンの脱凝縮の分子メカニズムは明確に定義されていません。HeLa細胞から単離された有糸分裂クロマチンクラスターとXenopus...

無細胞アッセイは、有糸分裂の終了時クロマチン脱凝縮を勉強します

高精度、キャピラリーを用いたマイクロ サンプリングを使用して代謝活動のスナップショットの化学的特性を容易に最小の侵入の個々...

生きているカエル (アフリカツメガエル) 胚の単一細胞メタボロミクスのマイクロ プローブ キャピラリー電気泳動質量分析法

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アフリカツメガエル卵からの希釈されていない細胞質抽出物の調製およびライブイメージングの方法を記載する。...

アフリカツメガエル 動的細胞質組織を可視化するための卵抽出物調製およびライブイメージング法

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ツメガエルの初期胚から単一細胞を単離し、サイズで分類する

学ぶアフリカツメガエル胚抽出物を用いた核縮小アッセイの手法。核サイズ調節メカニズムを解明し、細胞生物学研究に貢献します。

用いた無細胞アッセイ

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