腓骨神経損傷方法：神経筋接合部を修復信頼性の高い同定するためのアッセイおよびテスト要因

この末梢神経損傷法の全体的な目標は、マウスの再生する神経筋接合部を確実に調べることです。この方法は、神経筋接合部の再生に関連する分子的、細胞的、および機能的変化を特定するのに役立ちます。この手順の主な利点は、主に筋原性の変化がない場合に、神経筋接合部の再生速度を実験グループ間で確実に比較できることです。

その手順を実演するのは、私の研究室の医学生であるウィリアム・ダルキンです。手順を開始する前に、80%エタノールを使用して手術部位、ボード、器具を洗浄し、続いてポビドンヨードで消毒します。次に、マウスを手術用ボードに置き、つま先を挟むことに対する反応がないことを確認します。

拘束具内の手足を、ターゲットの後肢を解剖学的に自然な位置に合わせ、膝関節を内旋または外旋なしでわずかに伸ばします。次に、動物を手術用顕微鏡下に移し、骨の膝関節と前脛骨筋と腓腹筋の間の隆起が対物レンズを通して見えるまでボードを調整します。メスと鉗子を使用して、総腓骨神経の根底にあるコースに垂直に、皮膚を約3センチメートル切開します。

大腿二頭筋と外側広筋を露出させる表在筋膜を通して切開を続け、続いて、筋肉を分離するために、接続する深部筋膜を通して1〜2センチメートルの切開を行います。次に、機械式リトラクターを使用して大腿二頭筋を尾側に後退させ、総腓骨神経を明らかにします。腓腹筋の外側頭部の腱との交差が見つかるまで、神経を近位になぞります。

次に、細い鉗子を使用して、腓腹筋腱の外側境界に平行に先端を揃える神経をつかみ、5秒間着実に集中的な圧力を加えて総腓骨神経を粉砕します。鉗子を繊維に対して垂直に保持し、鉗子の先端のすぐ後ろの領域で組織をつかみ、しっかりと、しかし穏やかな圧力を加えて、腱の境界に沿って神経をきれいに直線的に押しつぶします。手術用顕微鏡で神経を目視検査し、組織が完全に圧迫されていることを確認します。

神経は損傷部位で半透明に見えます。末梢軸索に蛍光タンパク質を発現するマウスを使用すると、損傷部位から蛍光が消えます。神経が十分に損傷している場合は、リトラクターを取り外し、筋肉を解剖学的位置に再配置します。

次に、6-0シルク縫合糸を使用して、1〜3回の単純な中断縫合糸で切開部位を閉じ、マウスを完全に回復するまで監視しながら、清潔なケージの加熱パッドにマウスを置きます。細い鉗子を使用して神経を5秒間圧迫すると、損傷部位からYFPが消失します。神経上膜は連続したままで、軸索を元の標的に正確に再生するための導管として機能します。

70日齢の雌マウスでは、神経損傷は、クラッシュ後4日で、ニューロン体細胞から遠位にあるすべての軸索セグメントの変性を引き起こすのに十分です。.クラッシュ後7日までに、神経終末は空いたシナプス後の部位を活発に再占有します。12日目には、神経終末はシナプス前部に分化し続け、神経筋接合部は完全に再神経化されます。

同じ時間除神経したマウス間でのばらつきはほとんどなく、腓骨神経の粉砕をアッセイとして、同じ年齢と性別の動物間の筋肉の再神経化を比較できることを示しています。予想通り、アルファ運動軸索は筋線維を再構築する際に、多くの変化が起こります。軸索成長円錐は、シナプス後部位に接触すると拡大して分岐し、シナプス後の特定の領域で成長し、軸索終末とシナプス後部位とのほぼ完全な並置で最高潮

定量的PCRで示されているように、神経筋接合部関連遺伝子は除神経後に増加し、神経筋接合部が再神経化されると減少します。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば15分で完了できます。この手順を試行する際は、時間をかけてすべての構造を視覚化し、完全なクラッシュが得られたことを再確認することを忘れないでください。

この手順に続いて、QPCRなどの他の方法を実行して、どの遺伝子がアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされているかについての追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、神経生物学の分野の研究者がマウスのシナプス再生を探求する道を開きました。このビデオを見た後、マウスの神経筋接合部の再神経洗浄率を調べるために腓骨神経クラッシュを実行する方法をよく理解しているはずです。