マウスの骨髄からGM-CSF由来肺胞のようなマクロファージや樹状細胞の生成および同定

全体的な目標は、この手順が、GM-CSFを添加したin vitroマウス骨髄細胞培養物中の樹状細胞から肺胞様マクロファージを生成し、区別することです。このin vitro法は、樹状細胞またはマクロファージの機能に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、十分な細胞数を生成でき、樹状細胞と肺胞様マクロファージを区別できることです。

この技術の意味は、肺胞様マクロファージの獲得を促進するため、肺タンパク症の治療にまで及ぶ可能性があります。これは、この疾患の治療に使用できます。一般的に、この方法に不慣れな人は、洗浄された骨を分離し、骨髄を洗い流す練習が必要になります。この方法の視覚的なデモンストレーションは、すべての手法が書面による指示だけでは簡単に理解できるわけではないため、有用です。

解剖を開始する15分前に、生物学的安全キャビネットの電源を入れてキャビネットの空気をパージし、空気の流れを安定させ、70%エタノールでキャビネットの表面を清掃します。キャビネットの準備ができたら、1〜2枚のペーパータオルの上にマウスを腹臥位に置き、動物に70%エタノールをスプレーします。次に、利き手ではない方の手で胸部の周りの皮膚を持ち上げ、ハサミを使って切開します。

切開部の両端をつかみ、切開部の両端が胃で合流するまで慎重に引っ張ります。次に、マウスを仰臥位に置き、片手で皮膚の下半分を脚が露出するまで引き下げます。足を保持し、足首関節の上のアキレス腱と脛骨の下端で筋肉と足をつなぐ靭帯を切断して、脚の骨から足を緩めます。

脚を上げたまま、大腿骨の下端にある膝関節の周りの筋肉と靭帯を取り除き、下腿から大腿部の筋肉を酷くします。鉗子を使用して、緩んだ筋肉を腓骨と大腿骨の表面からそっと引き離します。次に、股関節の開いた位置でハサミを押し、脚を回転させ、大腿骨をそっと引っ張って脚の骨を股関節から分離し、脚を体から解放します。

次に、滅菌鉗子で脚を股関節の端に保持し、別の鉗子を使用して足首の端から足を取り除きます。次に、大腿骨の遠位端を1つの鉗子で保持し、脛骨と腓骨の近位端を別の鉗子で保持し、脛骨と腓骨を膝関節の反対方向に慎重に曲げて、下腿を大腿骨と膝蓋骨から分離します。鉗子を使用して、下腿の骨から残りの靭帯、筋肉、腓骨を取り外し、洗浄した脛骨を1〜2ミリリットルのHBSS / FCSを含む逆さのペトリ皿の蓋に置きます。

大腿骨の下端を1セットの鉗子で保持し、膝蓋骨を別のセットで保持し、膝と周囲の組織を反対方向に曲げて関節を取り外します。次に、大腿骨から残りの結合組織のいずれかを取り出し、骨を逆さまのペトリ皿の蓋に置きます。すべての骨を採取したら、鉗子を使用して骨に付着している残留組織をきれいにし、ペトリ皿の底部内の10ミリリットルのHBSS / FCSに骨を浸します。

皿を滅菌蓋で部分的に保護したまま、きれいにした骨をそれぞれハサミで半分に切ります。次に、26.5ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器を使用して、赤骨髄がすべて解放されるまで、皿から各骨片の端に1ミリリットルのHBSS / FCSを洗い流します。骨髄の目に見える塊をシリンジに数回通して単一細胞懸濁液を形成し、続いて10ミリリットルのピペットで完全に混合します。

細胞を収集チューブに移し、ペトリ皿を5ミリリットルのHBSS / FCSで1回すすぎ、残留細胞を収集します。次に、洗浄液を収集チューブにプールし、細胞を氷の上に置きます。骨髄細胞培養をセットアップするには、収集した細胞を遠心分離し、真空吸引に取り付けられた滅菌ガラスパスツールピペットで上清を吸引します。

赤血球が豊富なペレットを軽くたたいてほぐします。次に、10ミリリットルのRBC溶解バッファーを添加し、ボルテックスで細胞を再懸濁します。室温で5分間のインキュベーション後、10ミリリットルのHBSS/FCSで溶解を停止し、細胞をスピンダウンして、ペレットを骨髄細胞培地に再懸濁します。

トリパンブルーの排除により生細胞の数をカウントし、必要な細胞を骨髄細胞培地を用いた新しいチューブに移します。次に、遠心分離によって細胞を回収し、GM-CSFの1ミリリットルあたり20ナノグラムを含む骨髄細胞培地で1ミリリットルあたり400万細胞の希釈でペレットを再懸濁します。次に、1培養あたり1つの無菌細菌性ペトリ皿に、GM-CSF1ミリリットルあたり20ナノグラムを補充した9.5ミリリットルの骨髄細胞培地を加え、各皿の中央に500マイクロリットルの細胞を追加します。

細胞を摂氏37度と5%のCO2でインキュベートします。3日目に、各培養物に20ナノグラム/ミリリットルのGM-CSFを補充した10ミリリットルの新鮮な骨髄培地を、細胞への障害を最小限に抑えるように注意しながら加えます。6日目に、10ミリリットルの細胞培養上清を無菌の50ミリリットルの円錐管に慎重に移します。

細胞を遠心分離し、GM-CSFのミリリットルあたり20ナノグラムを含む10ミリリットルの新鮮な骨髄細胞培地にペレットを再懸濁します。次に、細胞懸濁液を穏やかにボルテックスし、細胞を培養皿に戻します。1日目には、骨髄細胞は小さくまばらですが、3日目までに細胞の数とサイズが増加し、一部が付着し始めています。

6日目までに、より多くの細胞が存在し、接着画分と非接着画分の両方が観察されます。培養物は7日目から10日目まで回収でき、サイズと生細胞によってゲーティングでき、10日目の培養から得られるCD11c陽性細胞の割合が高くなります。7日目には、採取された非接着画分は、樹状突起形態の細胞に対して非常に濃縮されます。

7日目と10日目に収穫されたCD11c陽性、GR1陰性の集団は、主に3つの集団に分けることができます。マクロファージ、未成熟樹状細胞、およびMHCII発現およびFL-HA結合による成熟樹状細胞。興味深いことに、MerTKはマクロファージマーカーと考えられていますが、7日目と10日目に採取されたマクロファージと未成熟樹状細胞集団の両方で強力な発現を示し、成熟樹状細胞では低レベルの発現が観察されました。

この手順を試みる際には、骨髄採取と細胞培養全体で無菌技術を使用することを忘れないでください。この手順に従って、細胞を選別して細胞集団を個別に調べたり、炎症剤で刺激して細胞内染色やフローサイトメトリーによってサイトカイン産生を分析することもできます。このビデオを見た後、骨髄細胞を単離し、それらをGM-CSFで培養して樹状細胞と肺胞様マクロファージの両方を生成する方法についてよく理解しているはずです。