マウスの骨髄からGM-CSF由来肺胞のようなマクロファージや樹状細胞の生成および同定

本手順の全体的な目的は、GM-CSFを添加したマウス骨髄細胞のin vitro培養において、肺胞マクロファージ様細胞を分化誘導し、樹状細胞から区別することです。このin vitro法は、樹状細胞またはマクロファージの機能に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、十分な細胞数を確保できること、および樹状細胞と肺胞マクロファージ様細胞を区別できることです。

この手法の意義は、肺タンパク質症の治療へと広がる可能性があります。なぜなら、本手法により、この疾患の治療に使用可能な肺胞様マクロファージの獲得が容易になるためです。一般的に、この方法を初めて行う方は、洗浄済み骨の分離および骨髄のフラッシングに習熟する必要があります。書面による指示だけでは理解しにくい技術もあるため、本手法を視覚的に提示することは有用です。

解剖を開始する15分前に、バイオセーフティキャビネットの電源を入れ、キャビネット内の空気を浄化して気流を安定させ、キャビネット表面を70%エタノールで清掃します。準備が整ったら、マウスを1〜2枚のペーパータオルの上に腹臥位で置き、動物に70%エタノールをスプレーします。次に、利き手ではない方の手で胸部周囲の皮膚を持ち上げ、はさみで切開します。

切開部の両端を掴み、切開部の両端が胃のところで合うまで慎重に引っ張ります。次に、マウスを仰臥位にし、片手で皮膚の下半分を脚が露出するまで下に引きます。足を保持し、足関節の上にあるアキレス腱と、脛骨下端で筋肉と足を繋いでいる靭帯を切断し、足を脚の骨から緩めます。

脚を上げたまま、大腿骨下端の膝関節周囲の筋肉と靭帯を取り除き、大腿筋を下腿から切り離します。ピンセットを用いて、緩んだ筋肉を腓骨および大腿骨の表面から慎重に剥がします。次に、股関節部分でハサミを開いた状態で押し当て、脚を回転させながら大腿骨をそっと引っ張り、脚を身体から切り離しながら股関節から脚骨を分離させます。

次に、滅菌済みピンセットで脚の股関節端を保持し、別のピンセットを用いて足首端から足を切り離します。その後、一方のピンセットで大腿骨の遠位端を、もう一方のピンセットで脛骨および腓骨の近位端を保持し、膝関節とは逆方向に脛骨と腓骨を慎重に曲げ、下腿を大腿骨および膝蓋骨から分離させます。ピンセットを使用して、下腿骨から残りの靭帯、筋肉、および腓骨を取り除き、洗浄した脛骨を1〜2 mLのHBSS/FCSが入った逆さまにしたペトリ皿の蓋の上に置きます。

一方のピンセットで大腿骨の下端を、もう一方のピンセットで膝蓋骨を保持し、膝と周囲の組織を反対方向に曲げて関節を取り除きます。その後、大腿骨に残っている結合組織を取り除き、骨を逆さまにしたペトリ皿の蓋の上に置きます。すべての骨を採取し終えたら、ピンセットを使用して骨に付着している残りの組織を清掃し、ペトリ皿の底にある 10 milliliters の HBSS/FCS に骨を浸します。

シャーレに滅菌済みの蓋を部分的に被せて遮蔽し、洗浄済みの各骨をハサミで半分に切断します。次に、26.5ゲージの針を装着した1 mLシリンジを用い、赤色骨髄がすべて放出されるまで、シャーレから各骨片の端へ1 mLのHBSS/FCSをフラッシュします。骨髄の凝集塊が見られる場合は、シリンジで数回繰り返し通過させて単一細胞懸濁液にし、その後10 mLピペットで十分に混合します。

細胞を回収チューブに移し、ペトリ皿を5 mLのHBSS/FCSで1回洗浄して、残存している細胞を回収します。次に、洗浄液を回収チューブにまとめ、細胞を氷上に置きます。骨髄細胞培養を準備するため、回収した細胞を遠心分離し、真空吸引装置に取り付けた滅菌ガラスパステールピペットで上清を吸引します。

タッピングにより、赤血球に富んだペレットをほぐします。次に、10 millilitersのRBC lysis bufferを加え、ボルテックスで細胞を再懸濁します。室温で5分間インキュベートした後、10 millilitersのHBSS/FCSを加えて溶血を停止させ、細胞を遠心分離し、ペレットを骨髄細胞培地で再懸濁します。

トリパンブルー排除法により生存細胞数をカウントし、必要な細胞数を骨髄細胞培地を入れた新しいチューブに移します。次に、遠心分離によって細胞を回収し、20 ng/mLのGM-CSFを含む骨髄細胞培地を用いて、細胞密度が4 million cells/mLになるようにペレットを再懸濁します。続いて、20 ng/mLのGM-CSFを添加した骨髄細胞培地 9.5 mLを、培養1件につき1枚の滅菌済み細菌用ペトリ皿に分注し、各皿の中央に細胞懸濁液 500 µLを添加します。

細胞を37 °C、5% CO2条件下でインキュベートする。3日目に、GM-CSFを20 ng/mL添加した新鮮な骨髄培地10 mLを、細胞への刺激を最小限に抑えながら各培養系に加える。6日目に、細胞培養上清10 mLを滅菌済みの50 mLコニカルチューブに注意深く移す。

細胞を遠心分離し、20 ng/mLのGM-CSFを含む新鮮な骨髄細胞培地10 mLでペレットを再懸濁します。次に、細胞懸濁液を緩やかにボルテックスし、細胞を培養皿に戻します。1日目、骨髄細胞は小さくまばらですが、3日目までには細胞の数とサイズが増加し、一部の細胞が接着し始めます。

6日目までには細胞数が増加し、付着細胞と非付着細胞の両方の画分が観察されます。培養物は7日から10日の間に回収することができ、サイズと生存細胞でゲートをかけます。10日目の培養物からより高い割合のCD11c陽性細胞が得られます。7日目に回収した非付着画分には、樹状細胞形態を持つ細胞が大幅に濃縮されています。

7日目および10日目に回収されたCD11c陽性かつGR1陰性の集団は、MHCIIの発現とFL-HA結合能により、マクロファージ、未熟樹状細胞、成熟樹状細胞の3つの主要な集団に分けることができます。興味深いことに、MerTKはマクロファージのマーカーと考えられていますが、7日目および10日目に回収されたマクロファージと未熟樹状細胞の両方の集団で強力な発現を示し、成熟樹状細胞では低レベルの発現が観察されました。

この手順を行う際は、骨髄採取および細胞培養の全工程において、無菌操作を徹底することが重要です。本手順の後、細胞をソーティングして個々の細胞集団を個別に検討したり、炎症剤で刺激した後に細胞内染色とフローサイトメトリーを用いてサイトカイン産生を解析したりすることも可能です。このビデオを視聴することで、骨髄細胞を単離し、GM-CSFで培養して樹状細胞と肺胞様マクロファージの両方を分化させる方法について十分に理解できるはずです。